修飾的κ輕鏈‑結合多肽的製作方法
2023-05-26 08:27:41 2
發明領域本發明涉及親和色譜領域，並且更特別地涉及包含蛋白l的κ輕鏈-結合結構域的多肽，其可用於許多類型的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段的親和色譜。本發明還涉及含有所述多肽的分離基質和使用這樣的分離基質的分離方法。發明背景免疫球蛋白和免疫球蛋白片段代表全世界生產或開發的最普遍的生物製藥產品。對於這種特定治療市場的高商業需求，以及由此的價值，已導致重點放在製藥公司上，以使它們各自的生產過程的生產力最大化，同時控制相關的成本。親和色譜，通常在包含葡萄球菌蛋白a或其變體的基質上，通常被用作在完整免疫球蛋白分子的純化中的關鍵步驟之一。蛋白a對免疫球蛋白的fc鏈的高選擇性結合提供一個對雜質和汙染物具有很高的清除作用的通用步驟。對於抗體片段，例如fab、單鏈可變片段(scfv)、雙-特異性t-細胞銜接子(bite)、結構域抗體等，其缺乏fc鏈但具有1、3或4子類κ輕鏈，包含源自大消化鏈球菌(peptostreptococcusmagnus)的蛋白l的基質(båkerström,lbjörck:j.biol.chem.264,19740-19746,1989；wkasternetal:j.biol.chem.267,12820-12825,1992；bhknilsonetal:j.biol.chem.267,2234-2239,1992和美國專利6,822,075)顯示作為提供所需的高選擇性的純化平臺的巨大前景。美國專利6,822,075中公開的蛋白l包含胺基酸序列seqidno:1加上在n-末端的另外的aven序列。seqidno:1(蛋白l)keetpetpetdseeevtikanlifangstqtaefkgtfekatseayayadtlkkdngeytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadalkkdngeytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfaeataeayryadllakengkytadledggytinirfagkkvdekpee蛋白l基質是可作為captotml從gehealthcarebio-sciencesab,sweden(captoldatafile29-0100-08ac,2014)經商業獲得的，並可被用來分離含κ輕鏈的蛋白例如完整抗體、fab片段、scfv片段、結構域抗體等。由健康人產生的約75%的抗體具有κ輕鏈，並且許多治療性單克隆抗體和抗體片段含有κ輕鏈。任何生物處理色譜應用需要全面注意汙染物的明確去除。這樣的汙染物可以是例如在色譜程序中吸附於固定相或基質的非-洗脫的分子，例如非-期望的生物分子或微生物，包括例如蛋白、碳水化合物、脂質、細菌和病毒。從基質除去這樣的汙染物通常在首次洗脫期望的產物後執行，以在後續使用之前再生基質。這樣的除去通常涉及稱為原位清洗(cip)的程序，其中能夠從固定相洗脫汙染物的試劑被使用。一類常常與色譜介質一起使用的這樣的試劑是在基質上通過的鹼性溶液。目前最廣泛使用的清潔和消毒劑是naoh，並且理想的是以範圍從0.05至最多例如1m的濃度使用，這取決於汙染的程度和性質。然而，與例如蛋白a比較，蛋白l是一種對鹼相當敏感的蛋白並且在大量的周期後僅耐受至多約15mmnaoh。這意味著另外的、不太理想的清潔溶液，例如尿素或胍鎓鹽，也可能必須使用，以確保足夠的清潔。一項廣泛的研究較早地專注於基因工程蛋白a配體的開發，所述配體表現出耐鹼性ph-值的改進能力。例如，wo2003/080655a1公開了具有特定的天冬醯胺突變的蛋白a結構域是比天然蛋白顯著更加鹼穩定的。因此，本領域仍有獲得含有蛋白l-衍生的配體的分離基質的需要，所述配體具有對鹼性清潔程序的改進的穩定性。發明概述本發明的一個方面是提供具有改進的鹼穩定性的多肽。這用如在權利要求1中定義的多肽實現。一個優點是鹼穩定性比蛋白l和親本多肽有改善。一個進一步的優點是本發明的多肽保持對蛋白l證實的對含κ輕鏈的蛋白的高選擇性結合。本發明的第二個方面是提供一種編碼具有改進的鹼穩定性的多肽或多聚體的核酸或載體。這用如在權利要求中定義的核酸或載體實現。本發明的第三個方面是提供一種能夠表達具有改進的鹼穩定性的多肽或多聚體的表達系統。這用如在權利要求中定義的表達系統實現。本發明的第四個方面是提供一種能夠選擇性地結合含κ輕鏈的蛋白並表現出改進的鹼穩定性的分離基質。這用如在權利要求中定義的分離基質實現。本發明的第五個方面是提供一種分離含κ輕鏈的蛋白的有效和經濟的方法。這用如在權利要求中定義的方法實現。本發明的更合適的實施方案在從屬權利要求中描述。定義術語「抗體」和「免疫球蛋白」在此可互換使用，並被理解為還包括抗體的片段、包含抗體或抗體片段的融合蛋白和包含抗體或抗體片段的綴合物。術語「κ輕鏈-結合多肽」和「κ輕鏈-結合蛋白」在此分別指能夠結合抗體的1、3或4子類κ輕鏈(也稱為vκi、vκiii和vκiv，如在bhknilsonetal:j.biol.chem.267,2234-2239,1992中)的多肽或蛋白，並包括例如蛋白l，及其已維持所述結合特性的任何變體、片段或融合蛋白。術語「含κ輕鏈的蛋白」被用作「含免疫球蛋白κ輕鏈的蛋白」的同義詞，並且在此意指包含從抗體衍生的1、3或4子類κ輕鏈(也稱為vκi、vκiii和vκiv，如在bhknilsonetal:j.biol.chem.267,2234-2239,1992中)的蛋白，並包括含有1、3或4子類κ輕鏈的任何完整抗體、抗體片段、融合蛋白、綴合物或重組蛋白。附圖簡述圖1顯示如在us6,822,075和wkasternetal:jbiol.chem.267,12820-12825,1992中描述的蛋白l的5個κ輕鏈-結合結構域的比對。圖2顯示蛋白l的不同κ輕鏈-結合結構域的鹼穩定性。圖3顯示蛋白l的突變κ輕鏈-結合結構域的鹼穩定性。圖4顯示包含4個結構域的蛋白l配體的鹼穩定性。圖5顯示與蛋白l比較，蛋白l的突變二聚體、四聚體和六聚體κ輕鏈-結合結構域的鹼穩定性。實施方案的詳細描述一方面，本發明公開一種κ輕鏈-結合多肽，其包含大消化鏈球菌蛋白l的一個或多個結合結構域，或基本由大消化鏈球菌蛋白l的一個或多個結合結構域組成，其中這些結構域的每一個選自結構域2、結構域3和結構域4。結構域2可具有由seqidno:3或seqidno:12定義的胺基酸序列，或它可具有與seqidno:3或12至少90%，例如至少95%的序列同源性。seqidno:12是seqidno:3的變體，具有在第31位的丙氨酸。結構域3可具有由seqidno:4定義的胺基酸序列，或它可具有與seqidno:4至少90%，例如至少95%的序列同源性。結構域4可具有由seqidno:5定義的胺基酸序列，或它可具有與seqidno:5至少90%，例如至少95%的序列同源性。在多肽的一些實施方案中，每個結構域選自結構域3和結構域4，或每個結構域是結構域3。特別地，多肽可包含結構域3的多聚體或基本由結構域3的多聚體組成。在一些實施方案中，至少兩個結構域選自結構域2、結構域3和結構域4，或選自結構域3和結構域4。在某些實施方案中，多肽不含消化鏈球菌蛋白l的任何結構域1。結構域1可具有由seqidno:2定義的胺基酸序列，或它可具有與seqidno:2至少90%，例如至少95%的序列同源性。在多肽的某些實施方案中，在一個或多個，例如全部的結合結構域中，至少在對應於seqidno:2-5的第45位的位置的胺基酸(例如在seqidno:2-5或12的第45位的胺基酸)已突變為不是天冬醯胺、脯氨酸或半胱氨酸的胺基酸。第45位的胺基酸可以例如被突變為丙氨酸。在多肽的一些實施方案中，在一個或多個，例如全部的結合結構域中，至少在對應於seqidno:2-5的第10位的位置的胺基酸(例如在seqidno:2-5或12的第10位的胺基酸)已突變為不是天冬醯胺、脯氨酸或半胱氨酸的胺基酸。第10位的胺基酸可以例如被突變為穀氨醯胺。在多肽的某些實施方案中，在一個或多個，例如全部的結合結構域中，至少在對應於seqidno:2-5的第60位的位置的胺基酸(例如在seqidno:2-5或12的第60位的胺基酸)已突變為不是天冬醯胺、脯氨酸或半胱氨酸的胺基酸。第60位的胺基酸可以例如被突變為穀氨醯胺。特別地，一個或多個，例如全部的結合結構域可具有選自n10q；n45a；n60q；n10q,n45a；n45a,n60q,n10q,n60q和n10q,n45a,n60q，或者選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q和n10q,n45a,n60q的突變。在多肽的一些實施方案中，在一個或多個，例如全部的結合結構域中，至少在對應於seqidno:2-5的第19位的位置的胺基酸(例如在seqidno:2-5或12的第19位的胺基酸)已突變為不是穀氨醯胺、天冬醯胺、脯氨酸或半胱氨酸的胺基酸。第19位的胺基酸可以例如被突變為穀氨酸或丙氨酸。特別地，一個或多個，例如全部的結合結構域可具有選自q19e和q19a的突變。在多肽的某些實施方案中，一個或多個，例如全部的所述結合結構域具有選自由seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:13和seqidno:14定義的序列的胺基酸序列。或者，一個或多個，例如全部的所述結合結構域可具有選自由seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10和seqidno:11定義的序列的胺基酸序列。多肽還可在n-末端包含多個胺基酸殘基，所述殘基源自克隆過程或構成來自裂解的信號傳導序列的殘基。另外的胺基酸殘基的數目可以例如是15個或更少，例如10個或更少，或5個或更少。作為一個特定的實例，多肽可在n-末端包含aqv序列。seqidno:7(結構域3,n45a突變)pkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlnikfagkektpeeseqidno:8(結構域3,n10q,n45a突變)pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlnikfagkektpeeseqidno:9(結構域3,n45a,n60q突變)pkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeeseqidno:10(結構域3,n10q,n60q突變)pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlqikfagkektpeeseqidno:11(結構域3,n10q,n45a,n60q突變)pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeeseqidno:12(結構域2的變體)pkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeaaaeayryadalkkdngeytvdvadkgytlnikfagkektpeeseqidno:13(結構域3,q19a突變)pkeevtikanliyadgktataefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeeseqidno:14(結構域3,q19e突變)pkeevtikanliyadgktetaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpee在某些實施方案中，多肽是包含如由上文公開的任何實施方案所定義的多個突變或非-突變結構域，或基本由如由上文公開的任何實施方案所定義的多個突變或非-突變結構域組成的多聚體。多聚體可以例如是二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體。它可以是同源多聚體，其中多聚體中的所有單位是相同的，或它可以是異源多聚體，其中至少一個單位不同於其它的。有利地，多聚體中的所有單位，例如通過包含以上公開的突變，是鹼穩定的。結構域可通過結構域的c-和n-末端之間的肽鍵彼此直接連接。或者，多聚體中的兩個或更多個單位可通過包含寡聚或多聚種類的元件，例如包含至多15或30個胺基酸，例如1-5、1-10或5-10個胺基酸的元件連接。這樣一種連接的性質應該優選不會破壞結構域的空間構象的穩定性。這可例如通過避免在連接中存在半胱氨酸來實現。而且，所述連接還應該優選在鹼性環境中是足夠穩定的，不損害結構域的特性。為此目的，如果連接不含天冬醯胺，則是有利的。如果連接不含穀氨醯胺，則可能是額外有利的。多聚體可進一步在n-末端包含多個胺基酸殘基，其源自克隆過程或構成來自裂解的信號傳導序列的殘基。另外的胺基酸殘基的數目可以例如是15或更少，例如10或更少，或5或更少。作為一個特定的實例，多聚體可包含在n-末端的aqv序列。在一些實施方案中，多聚體可包含選自以下的序列，或基本由選自以下的序列組成：seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17和seqidno:18，例如選自seqidno:16、seqidno:17和seqidno:18的序列。seqidno:15(結構域3,四聚體)pkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeeseqidno:16結構域3(n10q,n45a,n60q)2pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeeseqidno:17結構域3(n10q,n45a,n60q)4pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeeseqidno:18結構域3(n10q,n45a,n60q)6pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpee在某些實施方案中，如上文公開的多肽和/或多聚體還包含在c-末端或n-末端的一個或多個偶聯元件，其選自半胱氨酸殘基、多個賴氨酸殘基和多個組氨酸殘基。偶聯元件可以例如是在c-末端的單一半胱氨酸。偶聯元件可直接連接於c-或n-末端，或它/它們可通過包含至多15個胺基酸，例如1-5、1-10或5-10個胺基酸的接頭連接。這段序列(stretch)優選在鹼性環境中應該也是足夠穩定的，不損害突變蛋白的特性。為此目的，如果這段序列不含天冬醯胺，則是有利的。如果這段序列不含穀氨醯胺，則可能是額外有利的。具有c-或n-末端半胱氨酸的優點是蛋白的終點偶聯可通過半胱氨酸硫醇與支持體上的親電子基團的反應完成。這提供對於結合能力是重要的偶聯蛋白的優越的移動性。多肽或多聚體的鹼穩定性可通過使之偶聯於spr晶片，例如如在實施例中所述的biacorecm5傳感器晶片，並使用例如特定的含κ輕鏈的蛋白或多複製人igg(其中大多數igg分子具有κ輕鏈)，在鹼性溶液中孵育之前和之後，在特定的溫度，例如22+/-2℃下，測量晶片的κ輕鏈-結合能力來評價。孵育可例如在0.1mnaoh中進行許多個10min的周期，例如50、96或100個周期。於22+/-2℃，在0.1mnaoh中在96-100個10min的孵育周期後，基質的結合能力可以是孵育前結合能力的至少40，例如至少50或至少55%。或者，對於如上測量的特定突變體在96-100個周期後的剩餘結合能力可與對親本多肽/多聚體的剩餘結合能力比較。在這種情況下，對於突變體的剩餘結合能力可以是親本多肽/多聚體的至少105%，例如至少110%、至少125%、至少150%或至少200%。本發明還公開一種包含消化鏈球菌蛋白l的至少一個突變結合結構域的κ輕鏈-結合多肽，其中由seqidno:2-6或12定義的，或與seqidno:2-6或12具有至少95%或98%的序列同源性的親本結構域的至少一個天冬醯胺殘基已經突變為另一個並非天冬醯胺、脯氨酸或半胱氨酸的胺基酸殘基。多肽可包含至少突變n45a和/或突變n60q。在特定的實施方案中，所述突變選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q,n10q,n60q和n10q,n45a,n60q，或者選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q和n10q,n45a,n60q。相對於親本多肽的鹼穩定性可被改進和如上文所公開進行測定。在一些實施方案中，多肽包含多個突變結合結構域或基本由多個突變結合結構域組成，例如2、3、4、5或6結構域，其中每個結構域包含突變n10q,n45a和n60q的至少一個，例如n45a和/或n60q。特別地，在每個結構域中的突變可選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q,n10q,n60q和n10q,n45a,n60q，或者選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q和n10q,n45a,n60q。結構域可任選地通過包含至多15個胺基酸的元件彼此連接。在第二方面，本發明公開編碼依據以上公開的任何實施方案的多肽或多聚體的核酸。因此，本發明涵蓋本核酸序列的所有形式，例如編碼多肽或多聚體的rna和dna。本發明涵蓋載體，例如質粒，其除了編碼序列，還包含用於表達依據本發明的多肽或多聚體所需的信號序列。在一個實施方案中，載體包含編碼依據本發明的多聚體的核酸，其中編碼各個單位的獨立的核酸可具有同源或異源的dna序列。在第三方面，本發明公開一種表達系統，其包含如上公開的核酸或載體。表達系統可以例如是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性原核宿主細胞系統，例如芽孢桿菌(bacillussp)或大腸桿菌(escherichiacoli)，其已被修飾為表達本發明的多肽或多聚體。在可供選擇的實施方案中，表達系統是真核宿主細胞系統，例如酵母，例如巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)或釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)。在第四方面，本發明公開一種分離基質，其中依據以上公開的任何實施方案的多個多肽或多聚體已經偶聯於固體支持體。這樣一種基質可用來分離含κ輕鏈的蛋白，並且由於多肽/多聚體的改進的鹼穩定性，基質將耐受在清潔期間的高鹼性的條件，這對於在生物處理分離背景下的長期重複使用是至關重要的。基質的鹼穩定性可通過於特定的溫度下，例如22+/-2℃，在鹼性溶液中孵育之前和之後，使用例如特定的含κ輕鏈的蛋白或多複製人igg測量κ輕鏈-結合能力來評價。孵育可例如在0.1mnaoh中進行一定數目的15min周期，例如100、200或300個周期。於22+/-2℃，在0.1mnaoh中經100個15min孵育周期後，基質的結合能力可以是孵育前結合能力的至少80，例如至少85、至少90或至少95%。或者，孵育可在0.1mnaoh中進行多個4h的周期，例如6個周期(提供24h的總孵育時間)。於22+/-2℃，在0.1mnaoh中經24h的總孵育時間後，基質的結合能力可以是孵育前結合能力的至少80，例如至少85，至少90或至少95%。如技術人員應該理解的，表達的多肽或多聚體在被固定到支持體之前，應被純化至合適的程度。這樣的純化方法是本領域熟知的，且基於蛋白的配體固定於支持體容易使用標準方法進行。合適的方法和支持體將在下文更詳細地討論。依據本發明的基質的固體支持體可以是任何合適的熟知的種類。常規親和分離基質通常具有有機性質並基於親水性表面暴露於所用的水性介質(即暴露在它們的外表面上和(如果存在)也在內表面上的羥基(-oh)、羧基(-cooh)、甲醯胺基(-conh2，可能呈現為n-取代的形式)、氨基(-nh2，可能呈現為取代的形式)、寡-或聚乙烯氧基)的聚合物。固體支持體可適合為多孔的。孔隙率可以表示為kav或kd值(特定尺寸的探針分子可獲得的孔體積的分數)，其通過逆尺寸排阻色譜，例如依據在gelfiltrationprinciplesandmethods,pharmacialkbbiotechnology1991,pp6-13中描述的方法測量。按照定義，kd和kav值二者總是在0-1範圍內。kav值可有利地為0.6-0.95，例如0.7-0.90或0.6-0.8，如用mw110kda的葡聚糖作為探針分子測量的。其優點是支持體具有大分數的孔，其能夠容納本發明的多肽/多聚體和結合於多肽/多聚體的免疫球蛋白並提供免疫球蛋白朝向結合位點和離開結合位點的質量輸運。多肽或多聚體可經由常規偶聯技術，利用例如存在於配體中的硫醇基、氨基和/或羧基，附接於支持體。雙環氧化物(bisepoxides)、表氯醇、cnbr、n-羥基琥珀醯亞胺(nhs)等是熟知的偶聯試劑。在支持體和多肽/多聚體之間，可引入一種稱為間隔區的分子，其改善多肽/多聚體的可利用性並促進多肽/多聚體化學偶聯於支持體。合適的間隔區可例如通過用表氯醇、丁二醇二環氧化物、烯丙基縮水甘油醚等激活支持體來引入。或者，多肽/多聚體可通過非-共價鍵合，例如物理吸附或生物特異性吸附附接於支持體。在一些實施方案中，基質包含5-20，例如5-15mg/ml、5-11mg/ml或8-11mg/ml的偶聯於支持體的多肽或多聚體。偶聯的多肽/多聚體的量可受在偶聯過程中所用的多肽/多聚體的濃度，受所用的偶聯條件和/或受所用支持體的孔結構的控制。作為一般規則，基質的絕對結合能力隨著偶聯多肽/多聚體的量增加而增加，至少達到其中孔變得受偶聯的多肽/多聚體顯著限制的點。每mg偶聯的多肽/多聚體的相對結合能力將在高偶聯水平上降低，導致在以上指定範圍內的成本效益最優化。在一些實施方案中，多肽經由多點附接偶聯於支持體。這可通過使用這樣的偶聯條件，即多肽中的多個反應性基團與支持體中的反應性基團反應來適當地完成。典型地，多點附接可涉及序列中胺基酸殘基的幾個內在反應性基團，例如賴氨酸中的胺，與支持體上的反應性基團，例如環氧化物、氰酸酯(例如來自cnbr激活)、琥珀醯亞胺酯(例如來自nhs激活)等反應。然而，也可能是有意在多肽的不同位置引入反應性基團以影響偶聯特性。為經由賴氨酸提供多點偶聯，偶聯反應適當地在其中很大一部分賴氨酸伯胺呈現非-質子化親核狀態的ph，例如在高於8.0，例如10以上的ph下進行。在某些實施方案中，多肽或多聚體通過硫醚鍵偶聯於支持體。執行這樣的偶聯的方法是本領域熟知的並由本領域技術人員使用標準技術和設備容易地進行。硫醚鍵是撓性和穩定的，且一般適用於親和色譜。特別是當硫醚鍵經由多肽或多聚體上的末端或接近-末端的半胱氨酸殘基時，偶聯的多肽/多聚體的移動性增加，這提供了改善的結合能力和結合動力學。在一些實施方案中，多肽/多聚體經由如上所述的蛋白上提供的c-末端半胱氨酸偶聯。這允許半胱氨酸硫醇有效偶聯於支持體上的親電子基團，例如環氧化物基團、滷代醇基團等，導致硫醚橋偶聯。多肽/多聚體可例如經由單點附接(例如經由單一半胱氨酸)或經由直接的多點附接，使用例如接近多肽/多聚體的末端的多個賴氨酸或其它偶聯基團偶聯。在某些實施方案中，支持體包含多羥基聚合物，例如多糖。多糖的例子包括例如葡聚糖、澱粉、纖維素、支鏈澱粉、瓊脂、瓊脂糖等。多糖是固有親水性的，具有較低程度的非特異性相互作用，它們提供高含量的反應性(可激活的)羥基且它們對用於生物處理的鹼性清潔溶液一般是穩定的。在一些實施方案中，支持體包含瓊脂或瓊脂糖。用於本發明的支持體可依據標準方法，例如逆懸浮凝膠化(inversesuspensiongelation)(shjertén:biochimbiophysacta79(2),393-398(1964)容易地製備。或者，鹼性基質是可市售獲得的產品，例如以sepharose™ff(gehealthcare)商品名出售的交聯的瓊脂糖珠。在對於大規模分離是特別有利的一個實施方案中，已使用在us6602990或us7396467(通過引用以其整體結合到本文中)中描述的方法，使支持體適應於增加其剛性，因而使基質更適合於高流速。在某些實施方案中，支持體，例如多糖或瓊脂糖支持體被交聯，例如用羥烷基醚交聯。產生這樣的交聯的交聯劑可以是例如表滷代醇像表氯醇、雙環氧化物像丁二醇二縮水甘油醚、烯丙基化劑像烯丙基滷化物或烯丙基縮水甘油醚。交聯對於支持體的剛性是有益的並改善化學穩定性。羥烷基醚交聯是鹼穩定的，且不引起顯著的非特異性吸附。或者，固體支持體基於合成的聚合物，例如聚乙烯醇、聚羥基烷基丙烯酸酯、聚羥基烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺等。在疏水性聚合物的情況下，例如基於二乙烯基和單乙烯基-取代的苯的基質，基質的表面常常被親水化，以使如上定義的親水性基團暴露於周圍的水性液體。這樣的聚合物依據標準方法，見例如「styrenebasedpolymersupportsdevelopedbysuspensionpolymerization」(rarshady:chimicael'industria70(9),70-75(1988))容易地生產。或者，使用可市售獲得的產品，例如source™(gehealthcare)。在另一個替代中，依據本發明的固體支持體包含無機性質的支持體，例如二氧化矽、氧化鋯等。在再另一個實施方案中，固體支持體呈現為另一種形式例如表面、晶片、毛細管，或濾器(如膜或深過濾基質)。關於依據本發明的基質的形狀，在一個實施方案中，基質呈現為多孔整料的形式。在可供選擇的實施方案中，基質以可以是多孔或無孔的串珠或粒子形式呈現。以串珠或粒子形式呈現的基質可用作填充床或以懸浮的形式使用。懸浮的形式包括稱為膨脹床的那些和純粹的懸浮液，其中顆粒或珠自由移動。在整料、填充床和膨脹床的情況下，分離程序通常遵循具有濃度梯度的常規色譜。在純粹的懸浮液的情況下，應使用分批的模式。在第六方面，本發明公開一種分離含κ輕鏈的蛋白的方法，其中如以上公開的分離基質被使用。在一些實施方案中，該方法包含以下步驟：a)使包含含κ輕鏈的蛋白的液體樣品與如以上公開的分離基質接觸，b)用洗滌液洗滌所述分離基質，c)用洗脫液從分離基質洗脫含κ輕鏈的蛋白，和d)用清潔液清潔分離基質。該方法還可包含以下步驟：在步驟a)之前，提供依據上文描述的任何實施方案的親和分離基質和提供包含含κ輕鏈的蛋白和至少一種其它物質的溶液作為液體樣品，以及在步驟c)之後，回收洗脫液和任選地使洗脫液經歷進一步的分離步驟，例如通過陰離子或陽離子交換色譜、多峰色譜和/或疏水相互作用色譜。液體樣品的合適的組成，洗滌液體和洗脫液，以及執行分離的一般條件是親和色譜領域且特別是蛋白l色譜領域熟知的。包含含κ輕鏈的蛋白和至少一種其它物質的液體樣品可包含宿主細胞蛋白(hcp)，例如中國倉鼠卵巢(cho)細胞、大腸桿菌或酵母細胞蛋白。cho細胞和大腸桿菌蛋白的含量可通過針對這些蛋白質的免疫測定法便利地測定，如得自cygnustechnologies的chohcp或大腸桿菌hcpelisa試劑盒。宿主細胞蛋白或cho細胞/大腸桿菌/酵母蛋白可在步驟b)期間被解除吸附。洗脫可通過使用用來從蛋白l介質洗脫的任何合適的溶液進行。這可以例如是具有ph4或更低，例如ph2.5-4或2.8-3.5的溶液或緩衝液。在一些實施方案中，洗脫緩衝液或洗脫緩衝液梯度包含至少一種單-、二-或三官能的羧酸或這樣的羧酸的鹽。在某些實施方案中，洗脫緩衝液或洗脫緩衝液梯度包含至少一個選自乙酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、琥珀酸鹽、磷酸鹽和甲酸鹽的陰離子種類。在一些實施方案中，清潔液是鹼性的，例如具有12-14的ph。這樣的溶液提供基質的有效清潔，特別是在區間的上端。在某些實施方案中，清潔液包含0.01-1.0mnaoh或koh，例如0.05-1.0或0.05-0.1mnaoh或koh。本發明的多肽的高穩定性使得使用這樣的比較強的鹼性溶液成為可能。在一些實施方案中，步驟a)-d)重複至少10次，例如至少50次或50-200次。這對過程經濟是重要的，因為基質可重複利用多次。實施例蛋白的突變發生從在us6822075(seqidno:1)中公開的，含有4個κ輕鏈-結合結構域的蛋白l設計單體構建體。這些被編號為1、2、3和4，從n-末端開始(圖1)。dna片段購自dna合成公司(dna2.0)。4個單體構建體在pjexpress201克隆載體中製備，每個具有n-末端半胱氨酸。對構建體的概述，見seqidno:2、4、5、12。構建體被亞克隆至表達載體pgo，其含有大腸桿菌gap啟動子和用於靶蛋白的周質定位的ompa信號肽序列。編碼4個結構域的序列通過用含有分別在5』側和3』側上的fspi和psti的限制性內切酶識別位點的寡核苷酸擴增來製備。製備的編碼每個結構域的dna片段用fspi和psti(newenglandbiolabs)消化。單獨地，表達載體用fspi和psti消化來製備，通過瓊脂糖凝膠電泳純化並回收。將兩者混合併用quick連接試劑盒(newenglandbiolabs)連接。用熱休克方法，將表達每個結構域的連接的質粒轉化至化學感受態大腸桿菌k12株。結構域3中的胺基酸n10、n45、q19和n60的進一步的突變在lac操縱子控制機制下，在含有t5啟動子的表達載體pjexpress401(dna2.0)中製備(seqidno:7-11,13-14)。設計含有和不含ompa信號肽，但無c-末端半胱氨酸的構建體。結構域3的四聚體，含n45、n10和n60突變的結構域3的二聚體、四聚體和六聚體也在含有和不含c-末端半胱氨酸的pjexpress401中製備(seqidno:15-18)。構建體表達和純化於37℃，在裝有補充有25mg/l卡那黴素的lb-肉湯(10g蛋白腖、5g酵母提取物、5gnacl)的搖瓶中培養大腸桿菌k12重組細胞，直至600nm的光學密度達到0.8。在此點，蛋白表達用1mm的最終濃度的異丙基β-d-1-硫代半乳吡喃糖苷(vwrinternational)誘導。在誘導後，溫度下降至30℃並將培養物培養5小時。停止培養並將細胞以4000xg離心15分鐘，棄去上清液。使細胞再次懸浮於含磷酸緩衝鹽水(pbs)的1/10培養體積中並使用脈衝聲波降解法超聲處理2分鐘的有效時間。經超聲處理的樣品通過以6000xg離心30分鐘從細胞碎片澄清，接著用具有0.2µm孔徑的膜微濾。純化的配體用lc-ms分析以確定純度並確定分子量對應於期望值(基於胺基酸序列)。實施例1表1中列出的純化的單體配體(在非-突變單一結構域的情況下，還包含在c末端的半胱氨酸和在n-末端的aqv序列)，使用gehealthcare的胺偶聯試劑盒(用於晶片上羧甲基上的胺的碳二亞胺偶聯)，以足以在biacore儀器(gehealthcare,sweden)中給出約1000ru的信號強度的量，在biacorecm5傳感器晶片(gehealthcare,sweden)上固定化。為跟蹤固定化表面的igg結合能力，使1mg/ml人多克隆igg(gammanorm)流過晶片並記錄信號強度。然後表面經原位清洗(cip)，即於室溫(22+/-2℃)下，用100mmnaoh衝洗10分鐘。重複96個周期並在每個周期後按igg結合能力(信號強度)的相對損失，跟蹤固定化配體的鹼穩定性。對於非-突變結構域的結果示於圖2中並表明結構域1具有比其它結構域明顯更低的鹼穩定性，和結構域3具有最高的鹼穩定性。對於結構域3的單一-結構域天冬醯胺突變體的結果示於圖3並表明與親本結構域3(其被用作與突變平行的參比)比較，所有突變體的鹼穩定性改進。表1配體序列96個周期後的剩餘能力(%)參比能力(%)樣品/參比比率結構域1(d1)seqidno:213310.42結構域2(d2)seqidno:1222310.71結構域3(d3)seqidno:431311.00結構域4(d4)seqidno:526310.84d3(n45a)1seqidno:744311.42d3(n10q,n45a)1seqidno:848311.55d3(n45a,n60q)1seqidno:959311.90d3(n10q,n45a,n60q)1seqidno:1159311.90結構域3(d3)seqidno:428281.00d3(q19a)1seqidno:1328281.00d3(q19e)1seqidno:1431281.11實施例2表2中列出的純化的多結構域配體，使用gehealthcare的胺偶聯試劑盒(用於晶片上羧甲基上的胺的碳二亞胺偶聯)，以足以在biacore儀器(gehealthcare,sweden)中給出約1000ru的信號強度的量，在biacorecm5傳感器晶片(gehealthcare,sweden)上固定化。蛋白l在n-末端具有另外的aihnra序列。為跟蹤固定化表面的igg結合能力，使1mg/ml人多克隆igg(gammanorm)流過晶片並記錄信號強度。然後表面經原位清洗(cip)，即於室溫(22+/-2℃)下，用100mmnaoh衝洗10分鐘。重複96個周期並在每個周期後按igg結合能力(信號強度)的相對損失，跟蹤固定化配體的鹼穩定性。結果示於表2和圖4中並表明與蛋白l(其作為參比平行運行)比較，四聚體結構域3具有改進的鹼穩定性。表2配體序列96個周期後的剩餘能力(%)參比能力(%)樣品/參比比率蛋白lseqidno:128281.00結構域3四聚體seqidno:1538281.36實施例3使表3中列出的純化的多結構域配體在biacorecm5傳感器晶片上固定化，並通過用於實施例2的方法評價。配體的名稱末端的-cys表明，配體除了由seqidno:16-18定義的序列外，還具有c-末端半胱氨酸。結果示於表3和圖5並表明與蛋白l(其作為參比平行運行)比較，所有的突變結構域3二聚體、四聚體和六聚體具有改進的鹼穩定性。表3配體序列100個周期後的剩餘能力(%)參比能力(%)樣品/參比比率蛋白lseqidno:123231.00d3(n10q,n45a,n60q)2seqidno:1659232.56d3(n10q,n45a,n60q)2-cysseqidno:1659232.56d3(n10q,n45a,n60q)4seqidno:1760232.61d3(n10q,n45a,n60q)4-cysseqidno:1754232.35d3(n10q,n45a,n60q)6seqidno:1858232.52d3(n10q,n45a,n60q)6-cysseqidno:1856232.43實施例4表4的純化的二聚體、四聚體和六聚體配體使用下面描述的方法在瓊脂糖珠上固定化並對能力進行評價。結果示於表4。表4激活所用的基礎基質是依據us6602990的方法製備的85微米(體積-加權的)中值直徑的剛性交聯瓊脂糖珠，且對於mw110kda的葡聚糖具有對應於逆凝膠過濾色譜kav值0.70的孔徑(依據在gelfiltrationprinciplesandmethods,pharmacialkbbiotechnology1991,pp6-13中描述的方法)。於25℃，將25ml(g)排乾的基礎基質、10.0ml蒸餾水和2.02gnaoh在帶有機械攪拌器的100ml燒瓶中混合10min。加入4.0ml表氯醇並進行反應2小時。激活的凝膠用10個凝膠沉降體積(gv)的水洗滌。偶聯激活的凝膠用5gv0.2m磷酸鹽/1mmedtaph11.5(偶聯緩衝液)洗滌。將15ml凝膠+13mg配體/ml凝膠(5.0ml)+5.5ml偶聯緩衝液+4.7g硫酸鈉在50ml燒瓶中混合併於30℃攪拌18.5h。ph經測量為10.8。固定後，凝膠用蒸餾水洗滌3xgv，然後用0.1m磷酸鹽/1mmedtaph8.5洗滌5xgv。將凝膠+1gv{0.1m磷酸鹽/1mmedta/7.5%硫代甘油ph8.5}混合併於45℃，在燒瓶中攪拌2小時又20分鐘。然後凝膠用1xgv0.1mhac和1xgv{0.1mtris/0.15mnaclph8.5}交替洗滌，然後用蒸餾水洗滌(6xgv)。將凝膠樣品送至外部實驗室用於胺基酸分析並從總胺基酸含量計算配體含量(mg/ml凝膠)。所用的偶聯方案提供多點偶聯，每個結構域的數個賴氨酸附接於凝膠。2ml樹脂被填充於tricorn™5100柱中。蛋白a)從木瓜蛋白酶-消化的iggmab製備的純化的fab，在平衡緩衝液中稀釋至1mg/ml。b)從熱-處理的大腸桿菌上清液製備的純化的dab，在平衡緩衝液中稀釋至1mg/ml。dab僅含有κ輕鏈，而無任何抗原-結合位點。平衡緩衝液apb磷酸鹽緩衝液20mm+0.15mnacl，ph7,4(medicago)吸附緩衝液apb磷酸鹽緩衝液20mm+0.15mnacl，ph7.4(medicago)洗脫緩衝液25mm檸檬酸鹽ph2.5穿透能力用äktaexplorer10系統，以4分鐘的滯留時間測定。然後使平衡緩衝液通過旁路柱，直到獲得穩定的基線。這在自動歸零之前進行。將樣品施加於柱直至獲得100%uv信號。然後，再次應用平衡緩衝液直至獲得穩定的基線。將樣品裝載於柱直至達到uv信號85%的最大吸光度。然後用平衡緩衝液洗滌柱並以0.5ml/min的流速(ph2.5)洗脫。為計算在10%時的穿透能力，採用以下方程。那是裝載到柱中直至柱流出液中的fab/dab濃度是進料中fab/dab濃度的10%的fab/dab的量。a100%=100%uv信號；asub=來自非-結合蛋白的吸光度貢獻；a(v)=給定的應用體積的吸光度；vc=柱體積；vapp=直至10%穿透的應用體積；vsys=系統死體積；c0=進料濃度。計算10%穿透的動態結合能力(dbc)並對曲線的表現進行研究。還關於結合、洗脫和cip峰，對曲線進行了研究。對10和80%穿透，計算動態結合能力(dbc)。本書面說明書使用實施例來公開本發明，包括最佳模式，並且還能使本領域的任何技術人員實踐本發明，包括製造和使用任何設備或系統並執行任何結合的方法。本發明的可專利性範圍由權利要求書限定，並且可包括本領域技術人員可設想的其它實施例。如果這樣的其它實施例具有與權利要求書的文字語言相同的結構要素，或如果它們包括與權利要求書的文字語言無實質性差異的等同結構要素，則打算使這樣的其它實施例落入權利要求書的範圍內。本文中提及所有專利和專利申請通過引用以其整體結合到本文中，如同它們單獨結合到本文中一樣。當前第1頁12