一種細菌質粒dna提取的方法

2023-05-30 12:37:56

專利名稱：一種細菌質粒dna提取的方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學，具體地說是一種細菌質粒DNA的提取方法。質粒是存在於細菌染色體外的能獨立複製並穩定遺傳的環狀雙鏈DNA 分子，質粒腿A是基因工程的常用載體，可以攜帶外源基因進入細菌、動 物細胞或植物體內進行擴增與表達。質粒DNA提取的效率及質量對後續實 驗(酶切、PCR擴增等)的成功與否有著直接的關係，因此快速高效地從細 菌細胞中提取和純化質粒具有重要的意義。目前從細菌中提取質粒DNA常採用的方法有煮沸法、SDS法、鹼裂解法等，這些方法通常都是針對帶有人工構建質粒的大腸桿菌進行提取，耗時 長、質量低，而且提取過程中使用酚、氯仿等有毒物質，既汙染環境又危 害人體健康。對於很多有機汙染物降解細菌來說，汙染物降解的特性都是 由細菌的內生質粒調控的或者與質粒有關，認清降解細菌質粒以及位於質 粒上的基因與有機汙染物降解之間的關係，將有助於更深刻地了解微生物 對有機汙染物降解的內在機制和過程，所以尋找一種安全高效、簡便快速 並能應用於多種有機汙染物降解菌的質粒提取方法是進行此項研究的基 礎。發明內容本發明的目的在於提供一種安全、高效、適合多種細菌質粒DNA提取 的方法。有機汙染物降解菌的質粒DNA提取的方法。 為實現上述目的，本發明採用的技術方案為-. 提取的方法1) 細菌的培養將挑取的細菌單菌落在細菌常用液體培養基中，25-30x:振搖過夜培養；2) 菌體的收集、裂解當為革蘭氏染色陰性菌時，取1.5-2.0mL培養 16-24小時的菌液，並在10000-12000rpm下離心30-60秒，收集菌體；用 l-l. 5mL S丁E溶液洗滌兩次，10000rpra離心30秒；而後在細菌沉澱中加入 100-30GjuL溶液I ,再加入2QQ-6QQjuL溶液I]，冰浴3-5分鐘，得裂解菌 液；當為革蘭氏染色陽性菌分別培養時，取3. 0-4.0mL培養10-16小時的 菌液，並在8000-10000r，下離心60-90秒，收集菌體；用2. 0-3. OmL STE 溶液洗滌兩次，lOOOOrpm離心30秒；而後在細菌沉澱中加入100-200 y L 溶液1和50-lOOjaL溶菌酶，37"C水洛30-60分鐘,然後再加入200-600ML溶液II，冰浴3-5分鐘，得裂解菌液；3) 質粒DNA的復性、與染色體DNA分離在步驟2)中得到的裂解菌 液內加入150-400 mL溶液m，冰浴15-20分鐘，4 。C下以12000rpm離心10 分鐘，取上清；並在上清液中加與其等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘，4 。C下再以12000rpm離心5分鐘，取其沉澱待用；4) 質粒dna的沉澱將步驟3)中的沉澱用100-400 m l無菌重蒸水溶 解，並加入溶解沉澱的無菌水的l/2體積的7. 5mol -L—屮lUc和5mo1 'l—'LiCl, 冰洛3-5分鐘，4。C下以12000rpm離心5分鐘，取上清；並在上清液中加 與其等體積的異丙醇，室溫放置40分鐘，沉澱即為質粒DNA;其中溶液I為50mmol/L葡萄糖，25畫1/L Tris Cl ， pH8. 0和 1O隨ol/L EDTA, pH8. 0;溶液ii為0. 2mol/L NaOH和1%SDS;溶液iii為 溶液中含鉀的濃度為3-5mol/L的KAc,和5mol/L乙酸根，pH4. 8; NH,Ac 和LiCl之間的摩爾比例是1: 1。所述細菌常用液體培養基的成分為葡萄糖1.0g,酵母奢l. 0g， MgS04 7H20 0. 2g, Na2C03 0. lg, CaCh . 2H20 0. Olg, MnS04 . H20 0. 02g, FeS04 - 7H20 0. 005g, NH萬1. Og， KH2P04 0. 4g, Na2HP04 。
6g,加蒸餾水 至1L, pH7. 2-7. 5。上述得到的質粒DNA可用乙醇洗滌，空氣中乾燥後加50-lOOjaL TE溶 解，-2(TC保存。所述質粒DNA的洗滌用乙醇洗滌2-4次，其中乙醇的濃度為60-80%。 STE溶液的成分為10mmol/L Tris "Cl,pH8. 0， 10mmol/L NaCl和lmmol/L EDTA, pH8. 0; TE緩衝液為10mmol/L Tris HC1, pH8. 0和1mmol/L EDTA, pH8. 0;所述溶菌酶(Lysozyme Egg White,濃度為50mg/mL) 本發明所具有的優點1. 操作簡便、安全。本發明所用儀器簡單，易操作。用NH,Ac代替酚、 氯仿去除蛋白，可以有效降低對人體的危害，並減少對環境的汙染。2. 質量高。選擇適宜的條件進行細菌培養以及合適體積的菌液進行質 粒DNA提取，可最大限度的提高提取的效率；同時利用LiCl進行處理可以 大量沉澱RNA,並減少RNaseA的消化時間；用等體積異丙醇代替2倍體積 的乙醇來沉澱質粒dna,可以獲得更好的沉澱效果，最終獲得的質粒dna的 a，/a則均達到了 1.80，完全可以滿足常規分子生物學實驗的要求。3. 應用範圍廣。在帶有質粒的有機汙染物降解細菌中，既有革蘭氏染 色陰性細菌也有革蘭氏染色陽性細菌，經實驗證明本發明不僅適用於革蘭 氏染色陰性細菌質粒DNA的提取，同樣適用於革蘭氏染色陽性細菌，因此 具有廣泛的適用性。


圖1為DNA的水平瓊脂糖凝膠電泳譜圖；其中的1泳道是lkb DNA marker, 5泳道是入隨/跑c/111 marker,中間三個泳道分別2為戈登氏菌ZCG2， 3為假單胞菌B61, 4為人蒼白桿菌ZHL4。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明進一步說明。 實施例1將在斜面培養的戈登氏菌ZCG2，挑取其單菌落在細菌常用液體培養基 中25。C振蕩培養12小時後，取3. OmL菌液，9000rpni離心70秒,用2. OmL STE溶液洗滌兩次，10000rpm離心30秒；先加入150 ja L溶液I和50 p L 溶菌酶(購自上海生工生物工程技術服務有限公司)，37。C水浴40分鐘， 然後再加入400 mL溶液I1,冰浴5分鐘；加入300 m L溶液iii,冰浴20分 鍾，4。C, 12000rpm離心IO分鐘；取上清，加等體積異丙醇，室溫放置5 分鐘，4'C， 12000rpm離心5分鐘；用300 m L無菌重蒸水溶解沉澱，加入 150yL的7. 5mol . L—'NH4Ac和5mol . L—'LiCl,冰洛5分鐘，4*C， 12000rpm 離心5分鐘；取上清，並在上清液中加與其等體積的異丙醇，室溫放置40 分鐘，沉澱即為質粒DNA;將上述沉澱用70%乙醇洗滌兩次，空氣中乾燥後 加70mL TE溶解。其中細菌常用液體培養基的成分為葡萄糖l. Og,酵母膏1.0g, MgS04 7H20 0. 2g, Na2C03 0. lg， CaCl2 2H20 0. Olg, MnS04 . H20 0. 02g, FeS04 7H20 0. 005g, NH萬1. Og, KH2P04 0. 4g, Na風0. 6g，加蒸餾水 至1L, pH7.2, 12rC滅菌30tnin;溶液I為50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris ■ CI, pH8. 0和lOmmol/L EDTA, pH8. 0;溶液II為0, 2mol/L NaOH和 1%SDS;溶液III為溶液中含鉀的濃度為5mol/L的KAc,和5mol/L乙酸根， pH4. 8; NIUc和LiCl之間的摩爾比例是1:1。 STE溶液的成分為1O腿ol/L Tris-Cl， pH8. 0, 10,1/L NaCl和lmmol/L EDTA， pH8. 0; TE緩衝液為 lOmmol/L Tris HC1， p朋.0和lmmol/L EDTA, pH8. 0;其質粒DNA的提取 結果(參見圖1第2泳道)，提取DNA的含量為28. 9pg/mL， A261t/A28 =l. 80。實施例2將在斜面培養的假單胞菌B61,挑取其單菌落在細菌常用液體培養基中 28。C振蕩培養18小時後，取2. OmL菌液，lOOOOrpm離心45秒，用1. 5mL STE 溶液洗滌兩次，lOOOOrpm離心30秒；先加入135 ja L溶液I ,然後再加入 270laL溶液I1 ,冰洛4分鐘；加入200iaL溶液in，冰浴20分鐘，4。C，12000rpm 離心10分鐘；取上清，加等體積異丙醇，室溫放置5分鐘，4°C, 12000rpm 離心5分鐘；用200 nL無菌重蒸水溶解沉澱，加入100 y L的 7. 5mol . L—'歸c和5rao1 . L 'LiCl,冰浴5分鐘，4°C, 12000rpm離心5分 鍾；取上清，加入等體積的異丙醇，室溫放置40分鐘，沉澱即為質粒DNA; 將上述沉澱用70%乙醇洗滌兩次，空氣中乾燥後加60pLTE溶解。其中細菌常用液體培養基的成分為葡萄糖l.Og，酵母膏l.Og, MgS04 7H:0 0. 2g, Na.'CO 0. lg， CaCl2 2H20 0. Olg, MnSO, H.O 0. 02g, FeS04 . 7H;0 0. Q05g，歸O' l.Og, KHPOj 0. 4g， Na2HP04 0. 6g,加蒸f水至1L. pH7. 4， 12rC滅菌30min;溶液I為50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris'Cl， pH8. 0和10mmol/L EDTA, pH8. 0;溶液II為0. 2mol/L NaOH和 1%SDS;溶液III為溶液中含鉀的濃度為4mol/L的KAc,和5mol/L乙酸根， pH4. 8; NH4Ac和LiCl之間的摩爾比例是1: 1。 STE溶液的成分為lOmmol/L Tris . CI, pH8. 0, 10mmol/L NaCi和1睡1/L EDTA, pH8. 0; 丁E緩衝液為 10mmol/L Tris HCl， pH8. 0和l鵬ol/L EDTA， pH8. 0;其質粒DNA的提取 結果(參見圖1第3泳道)，提取DNA的含量為42. 3 ja g/mL, A2fc。/Aw)=l. 85。 實施例3將在斜面培養的人蒼白桿菌ZHL4,挑取其單菌落在細菌常用液體培養 基中3(TC振蕩培養20小時後，取1. 5mL菌液，11000rpm離心35秒，用1. OmL STE溶液洗滌兩次，10000rpm離心30秒；先加入100 y L溶液I ，然後再 加入200juL溶液II,冰洛3分鐘；加入150 n L溶液III,冰洛15分鐘，4 °C， 12000rpm離心IO分鐘；取上清，加等體積異丙醇，室溫放置5分鐘， 4°C， 12000rpm離心5分鐘；用200 m L無菌重蒸水溶解沉澱，加入lOOyL 1的7. 5mol . L—'WUc和5mol L—'LiCl,冰洛5分鐘，4°C, 12000rpm離心 5分鐘；取上清，加入等體積的異丙醇，室溫放置40分鐘，沉澱即為質粒 DNA;將上述沉澱用70%乙醇洗滌兩次，空氣中乾燥後加50 )a L TE溶解。其中細菌常用液體培養基的成分為葡萄糖l.Og,酵母膏l.Og, MgSO, ■ 7H20 0. 2g, Na2CO; 0. lg， CaCh 2H20 0. Olg, MnS04 H20 0. 02g, FeSO廣7H20 0. 005g， NH4N03 l.Og, KH2P04 0. 4g, Na2HP04 0. 6g,加蒸餾水 至1L， pH7. 3, 12rC滅菌30min;溶液I為50,1/L葡萄糖，25醒ol/L Tris . CI, pH8. 0和10mmol/L EDTA, pH8. 0;溶液II為0. 2mol/L NaOH和 1°/。SDS;溶液III為溶液中含鉀的濃度為3mol/L的KAc,和5mol/L乙酸根， pH4. 8; NH4Ac和LiCl之間的摩爾比例是1: 1。 STE溶液的成分為lOmmol/L Tris . CI, pH8. 0， 10mmol/L NaCl和l隱ol/L EDTA, pH8. 0; TE緩衝液為 lOmmol/L Tris HCl， pH8. 0和1嶋1/L EDTA, pH8. 0;其質粒DM的提取 結果(參見圖1第4泳道)，提取DNA的含量為35. 3jug/niL, A26。/A28。=l. 82。
權利要求
1. 一種細菌質粒DNA提取的方法，其特徵在於1)細菌的培養將挑取的細菌單菌落在細菌常用液體培養基中，25-30℃振搖過夜培養；2)菌體的收集、裂解當細菌為革蘭氏染色陰性菌時，取1.5-2.0mL培養16-24小時的菌液，並在10000-12000rpm下離心30-60秒，收集菌體；用1-1.5mL STE溶液洗滌兩次，10000rpm離心30秒；而後在細菌沉澱中加入100-300μL溶液I，再加入200-600μL溶液II，冰浴3-5分鐘，得裂解菌液；當為革蘭氏染色陽性菌分別培養時，取3.0-4.0mL培養10-16小時的菌液，並在8000-10000rpm下離心60-90秒，收集菌體；用2.0-3.0mL STE溶液洗滌兩次，10000rpm離心30秒；而後在細菌沉澱中加入100-200μL溶液I和50-100μL溶菌酶，37℃水浴30-60分鐘，然後再加入200-600μL溶液II，冰浴3-5分鐘，得裂解菌液；3)質粒DNA的復性、與染色體DNA分離在步驟2)中得到的裂解菌液內加入150-400μL溶液III，冰浴15-20分鐘，4℃下以12000rpm離心10分鐘，取上清；並在上清液中加與其等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘，4℃下再以12000rpm離心5分鐘，取其沉澱待用；4)質粒DNA的沉澱將步驟3)中的沉澱用100-400μL無菌重蒸水溶解，並加入溶解沉澱的無菌水的1/2體積的7.5mol·L-1NH4Ac和5mol·L-1LiCl，冰浴3-5分鐘，4℃下以12000rpm離心5分鐘，取上清；並在上清液中加與其等體積的異丙醇，室溫放置40分鐘，沉澱即為質粒DNA；其中溶液I為50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl，pH8.0和10mmol/L EDTA，pH8.0；溶液II為0.2mol/L NaOH和1％SDS；溶液III為溶液中含鉀的濃度為3-5mol/L的KAc，和5mol/L乙酸根，pH4.8；NH4Ac和LiCl之間的摩爾比例是1∶1。
2. 按權利要求1所述的細菌質粒DNA提取的方法，其特徵在於所述 細菌常用液體培養基的成分為葡萄糖1. 0g，酵母膏1. Og，MgSO, '7H,0 0. 2g, Na2C03 0. lg， CaCl2 2H20 0. 01g, MnS04 ' H20 0. 02g, FeS04 7H20 0. 005g, NH4N0, l.Og, KH2P04 0. 4g, Na2HP04 0. 6g，加蒸餾水至1L, pH7. 2-7. 5。
3. 按權利要求1所述的細菌質粒DNA提取的方法，其特徵在於上述 得到的質粒DNA可用乙醇洗滌，空氣中乾燥後加50-IOOjuLTE溶解，-20°C 保存。
4. 按權利要求3所述的細菌質粒DNA提取的方法，其特徵在於所述 質粒DNA的洗滌用乙醇洗滌2-4次，其中乙醇的濃度為60-80%。5.按權利要求1所述的細菌質粒DNA提取的方法，其特徵在於STE 溶液的成分為10國l/LTris .Cl， pH8. 0, lOmmol/L NaCl和1mmol/L ED丁A， pH8. 0; TE緩衝液為0隱ol/LTris . HC1， pH8. 0和lmmol/L EDTA, pH8. 0。
全文摘要
本發明涉及分子生物學，具體地說是一種細菌質粒DNA的提取方法。具體為將微生物菌體在液體培養基中，25-30℃振搖過夜培養；將培養過夜的菌液中加入緩衝溶液，離心收集和洗滌得裂解菌體；質粒DNA的分離純化，所得到的質粒DNA可直接用於酶切、PCR等多種分子生物學實驗。本發明操作簡便、安全、質量高、同時適用於革蘭氏染色陰性細菌、革蘭氏染色陽性細菌質粒DNA的提取，因此具有廣泛的適用性。
文檔編號C12N15/31GK101235379SQ20071001027
公開日2008年8月6日 申請日期2007年2月2日 優先權日2007年2月2日
發明者宛 劉, 張利紅, 李培軍, 樂 鄭 申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所