抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物及製備方法
2023-05-30 20:03:41
抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物及製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物及其製備方法。該疫苗組合物含有豬肺炎支原體抗原、豬胸膜肺炎放線桿菌抗原，其免疫程序簡單，既可產生抗體，又同時具有攻毒保護，能有效的防治豬支原體肺炎和豬傳染性胸膜肺炎。該疫苗組合物的免疫效果至少與分別注射單苗效果相當，副反應小，血清抗體效價高，免疫期長，耗時少、費力少、對豬的侵害也小。該疫苗組合物生產工藝簡單，免疫成本低廉，實用性強。
【專利說明】抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物及製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於畜類生物製藥【技術領域】，涉及一種抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎的二聯多價疫苗組合物及其製備方法。
【背景技術】
[0002]豬氣喘病又稱豬支原體肺炎(Macoplasmal pneumoniae of swine, MPS)或豬地方性流行性肺炎(Swine Enzootic Pneumonia, SEP),是由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)引起的一種接觸性慢性呼吸道傳染病,普遍存在於世界各地。患病豬主要表現為咳嗽和氣喘，生長遲緩，飼料轉化率低，體溫基本正常。解剖時以肺部病變為主，尤以兩肺心葉，中間葉和尖葉出現胰樣變和肉樣變為其特徵。發病率高，死亡率低。近年的研究發現，豬肺炎支原體與豬繁殖呼吸綜合症病毒和其它病原混合感染，使其感染的重要性進一步提高。到目前為止，該病仍是造成養豬經濟損失最重要的疾病之一。
[0003]豬肺炎支原體對培養基的營養條件要求非常苛刻，在一般的培養基中很難生長，是動物支原體中較難培養的一種。該疾病通過咳嗽產生的飛沫以及與感染或恢復期的病原攜帶豬直接接觸而傳播。感染動物和未感染動物混居導致早期和頻繁的再感染，感染通常開始於攜帶病原的母豬產胎時感染小豬。由於豬群集中管理技術的影響，感染在生命後期才變得明顯。當斷乳後把豬集中起來時，通常還可發現其它感染。在六周齡或更大的豬中常常觀察到明顯的疾病，感染豬的生長速度和飼料轉化率顯著降低。使用抗生素治療貴並且需要長期使用。再感染也是一個問題。目前疫苗是避免感染及其影響的最有效方法。
[0004]豬傳染性胸膜肺炎(porcinecontagious pleuropneumonia, PCP),是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的豬的一種高度傳染性呼吸道疾病。該病在世界範圍內分布廣泛，常呈地方性流行，造成持續的經濟損失，嚴重阻礙了世界養豬業的健康發展。由於APP血清型眾多，且各個國家及地區流行的優勢血清型各不相同，給該病的防治帶來了極大的困難。我國已分離到1、2、3、4、5、7和8型，其中以7型最多，該病在我國不同省市流行的血清型不同。豬傳染性胸膜肺炎主要是由感染豬直接傳染給易感豬群的，能感染任何年齡的豬只，I~4月齡最易感，APP最主要的傳播方式是通過感染豬呼出的小液滴進行的，這些小液滴隨著氣流漂移，當距離較近的易感豬呼入或直接接觸到小液滴時就容易發病。豬傳染性胸膜肺炎與豬傳染性萎縮性鼻炎和豬氣喘病一起成為當今大型養豬場的三大呼吸道傳染病。該病以急性出血和慢性纖維素性胸膜肺炎為特徵，目前在多數工廠化的養豬國家均有發生。本病主要通過飛沫傳播，也可通過接觸傳染。該病造成的豬只死亡、生長緩慢、飼料報酬降低及藥物防治費用的增加，給世界各地的養殖業造成了嚴重的經濟損失。
[0005]但是，迄今為止，尚沒有能夠同時防治豬支原體肺炎和豬傳染性胸膜肺炎的二聯組合疫苗。因此，目前需要研究開發一種安全有效、使用簡便，並能同時防治豬支原體肺炎和豬傳染性胸膜肺炎的二聯組合疫苗。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎的二聯疫苗組合物及其製備方法。該疫苗組合物含有豬肺炎支原體抗原、豬胸膜肺炎放線桿菌抗原，免疫程序簡單，既可產生抗體，又同時具有攻毒保護，能同時有效的防治豬支原體肺炎和豬傳染性胸膜肺炎。該疫苗生產工藝簡單，免疫成本低廉，實用性強。
[0007]為此，本發明提供了一種抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物，其包括豬肺炎支原體抗原、豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。
[0008]在本發明中，所述豬肺炎支原體抗原包含至少一種在對豬給藥後能誘導、刺激或增強抗豬肺炎支原體感染的免疫應答的豬肺炎支原體抗原。
[0009]根據本發明，所述豬肺炎支原體抗原為豬肺炎支原體全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬肺炎支原體細菌，或者含有豬肺炎支原體的免疫原性胺基酸序列的多肽成分中一種或幾種。
[0010]本發明中所述用語「豬肺炎支原體全菌體」，是指豬肺炎支原體的完整細胞體。
[0011]在本發明的一個具體實施例中，所述豬肺炎支原體抗原選自勃林格殷格翰公司的豬支原體肺炎滅活疫苗(Ingeivacs M.hyo)、哈藥集團公司的瑞倍適Respisure和RespisureOne、美國先靈德雅公司的豬支原體肺炎滅活疫苗(Myco Silencer? )、西班牙海博萊生物大藥廠的J株(喜可舒)、美國普泰克公司的MycoGard、美國輝瑞公司的RespiFendMH、梅裡亞動物保健公司的豬克喘中的一種或幾種。
`[0012]在本發明的一個優選的實施例中，所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的J株或HN0613株全菌體。優選所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的HN0613株全菌體。所述豬肺炎支原體 HN0613 (Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)的保藏編號為:CCTCC NO:M 2012230，保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區珞珈山路16號武漢大學)。保藏日期為2012年6月13日。
[0013]本發明中所述用語「豬肺炎支原體HN0613」，也稱為「豬肺炎支原體HN0613株」 (Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)。
[0014]根據本發明，在所述疫苗組合物中，所述豬肺炎支原體HN0613滅活前含量為IO8~101QMHDCE/ml (MHDCE =豬肺炎支原體DNA細胞等同物，即I MHDCE相當於I個豬肺炎支原體)。優選在所述疫苗組合物中，所述豬肺炎支原體HN0613抗原滅活前含量為2X109MHDCE/ml。
[0015]正如本領域技術人員所知，不同的微生物野外分離株在基因序列上有微小的變異，然而，當變異不影響其蛋白質合成、結構或者主要作用功能區時，該微生物之他種野外分離株即使基因序列無法百分之百相同，其基本的生理功能並不會有所改變。但是同源性比較如果針對全部的基因來進行比對，實際上是非常巨大的工程，不太可行，目前國際上常使用16S Ribosomal RNA(16S rRNA)來進行細菌型的分辨，因此在相似性的比較上可以用16S rRNA來進行比對而得到其同源性。所以本發明所使用的支原體抗原並不限定於本發明所使用的野外分離株，16s rRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在於所有細菌的染色體基因組中。16S rRNA具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長(包含約50個功能域)。[0016]因此，本發明中，所述豬肺炎支原體抗原為與豬肺炎支原體HN0613的16SrRNA的同源性至少為80%的菌株。優選所述豬肺炎支原體抗原為與豬肺炎支原體HN0613的16SrRNA的同源性至少為90%的菌株。進一步優選的是，所述豬肺炎支原體抗原為與豬肺炎支原體HN0613的16S rRNA的同源性至少為95%~99%的菌株，更優選的是，所述豬肺炎支原體抗原為與豬肺炎支原體HN0613的16S rRNA的同源性為98%~99%的菌株。即在不改變豬肺炎支原體16S rRNA的前提下，本領域技術人員可以通過簡單的篩選或誘變本發明的豬肺炎支原體，獲得與本發明豬肺炎支原體16S rRNA高度同源的菌株，並獲得相應地具有相同或相似免疫原性的抗原組合物。
[0017]同樣，在本發明中，所述胸膜肺炎放線桿菌抗原包含至少一種在對豬給藥後能誘導、刺激或增強抗豬傳染性胸膜肺炎的免疫應答的胸膜肺炎放線桿菌抗原。
[0018]根據本發明，所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為豬胸膜肺炎放線桿菌全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬胸膜肺炎放線桿菌細菌，或者含有豬胸膜肺炎放線桿菌的免疫原性胺基酸序列的嵌合病毒，或者含有豬胸膜肺炎放線桿菌的免疫原性胺基酸序列的多肽成分中一種或幾種。
[0019]本發明中所述用語「豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌全菌體」，是指豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的完整細胞體。
[0020]本發明中所述用語「豬胸膜肺炎放線桿菌」，也稱為「豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌」或「胸膜肺炎放線桿菌」(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP),該病原菌生長要求嚴格，為革蘭氏陰性球桿菌，有莢膜。
[0021]同樣，本發明中所述用語「豬胸膜肺炎放線桿菌抗原」，也稱為「豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原」或「胸膜肺炎放線桿菌抗原」。
[0022]在本發明的一個具體實施例中，所述胸膜肺炎放線桿菌抗原選自華中農業大學的豬傳染性胸膜肺炎三價滅活疫苗(1、2、7型)；專利文件CN 102058880中的傳染性胸膜肺炎放線桿菌HT株(豬傳染性胸膜肺炎HT株的分離、鑑定與定型試驗，中國動物檢疫，1999，16(2):7~9)、52株(保藏編號為 CGMCC N0.4215)、DY 株(保藏編號為 CGMCC N0.4216)中的一種或幾種。
[0023]在本發明的一個優選的實施例中，所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為滅活形式的全菌體。優選所述豬胸膜放線桿菌抗原為滅活形式的血清I型LC株、血清5型YC株和血清7型YS株全菌體。
[0024]所述胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株(ActinobaciIIuspIeuropneumoniaeserotypeI strain LC, APP-1)的保藏編號為:CCTCC NO:M 2011458 ；所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型YC株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype5strainYC，APP-5)的保藏編號為:CCTCC NO:M 2011459 ;所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型 YS 株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype7 strain YS, APP-7)的保藏編號為:CCTCC NO:M 2011460 ;上述菌種均保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區珞珈山路16號武漢大學)。保藏日期均為2011年12月9日。
[0025]根據本發明，在所述疫苗組合物中，所述豬胸膜肺炎放線桿菌滅活前血清I型LC株含量為IO8~10lclCFU/ml，血清5型YC株含量為IO8~10lclCFU/ml，血清7型YS株含量為IO8~101(lCFU/ml。優選在所述疫苗組合物中，所述豬胸膜肺炎放線桿菌滅活前血清I型LC株含量為109CFU/ml，血清5型YC株含量為109CFU/ml，血清7型YS株含量為109CFU/ml。
[0026]在本發明中，所述疫苗組合物還包括其它豬的病原體的附加抗原，其選自豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)的抗原、豬瘟抗原、豬偽狂犬病毒(PRV)抗原、豬圓環病毒抗原(PCV)、豬波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原、豬流感病毒(SIV)中的一種或幾種。
[0027]根據本發明，所述疫苗組合物還包括疫苗輔劑，並且，在所述疫苗組合物中，所述疫苗輔劑含量為10wt%~60wt%。
[0028]在本發明中，所述疫苗輔劑包括疫苗佐劑、防腐劑、代謝油混合物、稀釋劑。其中，所述疫苗佐劑為氫氧化招膠、礦物油、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel 01 (法國 SEPPIC)、蜂膠、ISA206(法國 SEPPIC)、ISA760VG (法國 SEPPIC)，優選卡波姆(Carbomer)(商品名 Carbopol)、Ge 101 (法國 SEPPIC)、ISA206 (法國 SEPPIC)、ISA760VG (法國 SEPPIC)，更優選卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、GelOl (法國SEPPIC),更優選卡波姆(Carbomer)(商品名 Carbopol)。
[0029]本發明進一步提供了一種根據本發明所述疫苗組合物的製備方法，包括配苗步驟:將抗原與疫苗輔劑混合製得抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物，其中，所述抗原包括豬肺炎支原體抗原和豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。
[0030]可任意選擇的，在配苗步驟中，所述抗原還包括其它豬的病原體的附加抗原。
[0031]根據本發明方法，所述方法還包括在配苗步驟之前的抗原準備步驟，包括製備抗原，或者通過其他方法獲得抗原，如直接購置抗原。所述製備抗原包括分別培養豬肺炎支原體和豬胸膜肺炎放線桿菌，並分別進行濃縮，獲得豬肺炎支原體抗原和豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。優選所述製備抗原包括分別培養豬肺炎支原體和豬胸膜肺炎放線桿菌，並分別進行滅活、濃縮，獲得豬肺炎支原體滅活抗原和豬胸膜肺炎放線桿菌滅活抗原。
[0032]本發明還提供了一種 根據本發明所述的疫苗組合物在稀釋PRSS疫苗中的應用。
[0033]本發明針對現有技術的不足提供了一種含有豬肺炎支原體與豬胸膜肺炎放線桿菌的二聯多價疫苗組合物，該疫苗組合物免疫程序簡單，能同時有效的防治豬支原體肺炎和豬傳染性胸膜肺炎。該產品既可產生抗體，又同時具有攻毒保護，其免疫效果至少與分別注射單苗效果相當，副反應小，血清抗體效價高，免疫期長，耗時少、費力少、對豬的侵害也小。該疫苗組合物生產工藝簡單，免疫成本低廉，實用性強。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1是實施例1中豬肺炎支原體HN0613的狄氏染色結果圖。
[0035]圖2是實施例1中豬肺炎支原體HN0613的PCR鑑定結果圖。
[0036]圖2中附圖標記的含義如下:1 Marker DL 2000 ；2病料分離株HN0613 ；3致病性試驗分離株；4陰性對照。
[0037]圖3是實施例1中豬胸膜肺炎放線桿菌的PCR鑑定結果圖
[0038]圖3中附圖標記的含義如下:I Marker ；2豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株；3豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型YC株；4豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株。
[0039]mmm
[0040]豬肺炎支原體HN0613 (Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑑定，已在中國典型培養物保藏中心(簡稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區珞珈山路16號武漢大學)進行保藏，保藏日期:2012年6月13日，保藏編號:CCTCC NO:M 2012230。
[0041]胸膜肺炎放線桿菌血清I 型 LC 株(Actinobacillus pleuropneumoniaeserotypelstrain LC, APP-1),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑑定，已在中國典型培養物保藏中心(簡稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區珞珈山路16號武漢大學)進行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏編號:CCTCC NO:M2011458。
[0042]豬胸膜肺炎放線桿菌血清5型YC株(ActinobaciIIuspleuropneumoniaeserotype5 strain YC, APP-5),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑑定，已在中國典型培養物保減中心(簡稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區洛咖山路16號武漢大學)進行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏編號:CCTCCN0:M 2011459。
[0043]豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株(ActinobaciIIuspleuropneumoniaeserotype7 strain YS, APP-7),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑑定，已在中國典型培養物保減中心(簡稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區洛咖山路16號武漢大學)進行 保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏編號:CCTCCN0:M 2011460。
[0044]為獲得免疫性強的菌種，各菌種經敏感豬體復壯鑑定合格後凍幹保存並保藏。
【具體實施方式】
[0045]為使本發明更加容易理解，下面將結合實施例來詳細說明本發明，這些實施例僅起說明性作用，並不局限於本發明的應用範圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規實驗方法進行。
[0046]實施例
[0047]實施例1:豬肺炎支原體HN0613的分離鑑定
[0048]1.材料與方法
[0049](I)材料
[0050]①病料來源
[0051]2006年從河南省各地採集疑似豬支原體肺炎病變肺臟，共16份。
[0052]②培養基
[0053]豬肺炎支原體Friis培養基購自BD公司；豬血清購自GIBCO公司；酚紅指示劑購自美國AMRESC0公司。
[0054]③試劑
[0055]生化試劑及化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。
[0056]細菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，狄氏染色試劑盒購自於重慶龐通醫療器械有限公司。生化鑑定試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。
[0057]④陰、陽性血清
[0058]兔抗豬肺炎支原體J株特異性血清，按參考文獻方法製備(Meens，J.，Selke,M.，Gerlach, G.F.，2006.1dentification and immunological characterizationof conserved Mycoplasma hyopneumoniae lipoproteins Mhp378 and Mhp651.Vet.Microbiol.116:85~95)。未免兔血清作為陰性血清。
[0059]2.方法[0060](I)病料處理
[0061]取疑似支原體肺炎病變肺臟，在超淨臺內用無菌手術剪刀剪取發病部位邊緣組織，放入無菌平皿，將病肺組織剪成I~2_3碎塊，接種Friis肉湯，37°C培養，每日觀察培養液PH值變化。培養液變色時，取第一代經0.45 ii m過濾器過濾的培養物0.5ml接種到
1.5ml含青黴素2000U/ml的Frris肉湯培養基中，37°C繼續培養，培養基變黃後直接取培養物進行移植傳代，如培養物變色，進行塗片，分別進行革蘭氏染色和瑞氏染色，鏡檢。如革蘭氏染色未發現細菌，同時瑞氏染色發現支原體樣菌體時，取0.2ml培養物塗布於Frris平板固體培養基表面，置37°C，5% CO2條件下培養，每日觀察是否有支原體樣菌落。取支原體樣單個菌落接種於Friis肉湯,培養基顏色變黃後取0.2ml培養物塗布於Frris平板固體培養基表面置37°C ,5% CO2條件下進行純化培養，如此進行純化培養2次。將最後一次純化培養生長的支原體樣菌落接種Frris液體培養基所得的顏色變黃培養物保存於_70°C備用。
[0062](2)菌落狄氏染色
[0063]按參考文獻進行(曹澍澤.獸醫微生物學及免疫學技術[M]，北京:北京農業大學出版社，1992:49~50，126~129，371~373)，採用無菌方法從固體培養基上切下菌落，放到載玻片上，在兩邊墊上竹籤，滴上狄氏染色液後再蓋上一塊玻片，置於4°C染色30min後低倍鏡下觀察結果。
[0064](3) PCR鑑定及測序分析
[0065]用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA模板。PCR引物參考文獻進行合成(J.Caron, M.0uardani, and S.Dea.Diagnosis and Differentiation of Mycoplasmahyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis Infections in Pigs by PCR Amplificationof the p36 and p46 Genes[J].Journal of clinical microbiology,2000,38(4):1390~1396)。 FSp36，5』 -GGGCCGATGAAACCTATTAAAATAGCT-3』 Rsp36，5』 -GCCGCGAAATTAAATATTTTTAAITGCATCCTG-3』，上海生工合`成。PCR 反應體系:超純水 34.5 y 1、10XPCR Buffer 5u I,dNTP 4 ill、引物各2 ill、模板2 ill、TaqDNA聚合酶0.5 ill。按下列參數進行PCR反應:預變性 94°C 3min ；94°C 30s，53°C退火 30s，72°C延伸 90s，35 個循環後;72°C終延伸 IOmin0 擴增結束後取上述產物瓊脂糖凝膠電泳檢測。直接將有特異性條帶的PCR產物及引物提交至上海生工進行測序分析。
[0066](4)生化試驗:
[0067]生化試驗參考文獻進行(曹澍澤.獸醫微生物學及免疫學技術[M]，北京:北京農業大學出版社，1992:49~50，126~129，371~373)。主要進行洋地黃皂甙敏感性試驗、尿素酶試驗、葡萄糖分解試驗、精氨酸水解試驗、三苯基氯化四氮唑(TTC)還原試驗、七葉甙水解試驗、甘露醇分解試驗、薄膜和斑點形成試驗。
[0068](5)生長抑制試驗(GIT)
[0069]Friis平板接種0.1ml對數生長期的豬肺炎支原體培養物，將未稀釋的抗血清25 Ul吸附於滅菌的6mm濾紙片，將吸附有血清的濾紙片貼附於平板表面，培養至菌落可見。正常兔血清處理的紙片作為陰性對照。培養觀察圓紙片周圍有無菌落抑制環的產生。抑制寬度達2mm以上時判為豬肺炎支原體陽性。
[0070](6)分離菌株的致病性[0071]將分離菌株培養物經氣管注射I~2周齡健康易感豬3頭，每頭5ml (HN0613,108CCU/ml)。另設3頭條件相同的對照豬，各氣管注射培養基5ml，作為對照。試驗豬、對照豬隔離飼養。攻毒後按常規飼養，飼料中無抗生素。觀察28日，每日測體溫。注射28日後剖檢，根據豬支原體肺炎肺病變指數記分標準對試驗豬的肺病變進行記分。試驗組與對照組進行肺病變指數差異分析。對試驗豬及對照豬按實施例1第2部分方法(4)中「生化試驗」的方法進行豬肺炎支原體的分離，對分離株按實施例1第2部分方法(3)中「PCR鑑定及測序分析」的方法進行PCR鑑定。
[0072]3.結果
[0073](I)培養結果
[0074]16份病料中僅有1份病料接種的培養基7日後變黃色，過濾接種後5日培養液變黃，培養液均勻混濁，轉接於含青黴素的Friis培養基變色後，革蘭氏染色未發現細菌，瑞氏染色發現支原體樣菌體。轉接於固體培養基後，菌落生長入培養基內部。菌落呈典型煎荷包蛋狀，與支原體菌落形態相符，命名為HN0613株豬肺炎支原體。
[0075](2)狄氏染色結果
[0076]在低倍鏡下觀察到，在Friis固體培養基的豬肺炎支原體的菌落被染成不褪色的中心深藍色菌落(參見圖1)，與支原體菌落染色特性相符。
[0077](3) PCR 鑑定
[0078]所提取的分離培養物模板經PCR擴增後，再經瓊脂糖凝膠電泳檢測，待檢病料或培養物均在750~1000bp之間接近1000bp的位置有一條帶，與預期948bp相符(參見圖2)。
[0079](4)序列測定與分析
[0080]將所分離菌株PCR擴增產物測序與GenBank中進行blast比較。結果顯示，HN0613分離菌株P36基因序列與NCBI中公布的Mhp P36基因序列相應序列同源性為98%以上。測序結果見序列表。
[0081](5)生化及血清學鑑定
[0082]分離菌株生化反應與豬肺炎支原體生化特性相符(表1)。
[0083]表1 HN0613分離株生化及生長抑制試驗結果表
[0084]
【權利要求】
1.一種抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物，其包括豬肺炎支原體抗原、豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。
2.根據權利要求1所述的疫苗組合物，其特徵在於: 所述豬肺炎支原體抗原為豬肺炎支原體全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬肺炎支原體細菌，或者含有豬肺炎支原體的免疫原性胺基酸序列的多肽成分中一種或幾種； 所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為豬胸膜肺炎放線桿菌全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬胸膜肺炎放線桿菌細菌，或者含有豬胸膜肺炎放線桿菌的免疫原性胺基酸序列的嵌合病毒，或者含有豬胸膜肺炎放線桿菌的免疫原性胺基酸序列的多肽成分中一種或幾種。
3.根據權利要求2所述的疫苗組合物，其特徵在於: 所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的J株或HN0613株全菌體； 所述豬胸膜肺炎放線桿菌抗原為滅活形式的全菌體。
4.根據權利要求3所述的疫苗組合物，其特徵在於: 所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的HN0613株全菌體； 在所述疫苗組合物中，所述豬肺炎支原體HN0613滅活前含量為IO8~1kiMhdceAiI ； 所述豬肺炎支原體HN0613 (Mycoplasma hyopneumoniae strain)的保藏編號為:CCTCCNO:M 2012230，保藏於中國典型培養物保藏中心； 所述豬胸膜放線桿菌抗原為滅活形式的血清I型LC株、血清5型YC株和血清7型YS株全菌體； 在所述疫苗組合物中，所述豬胸膜肺炎放線桿菌滅活前血清I型LC株含量為IO8~101QCFU/ml，血清5型YC株含量為IO8~10lclCFU/ml，血清7型YS株含量為IO8~IOiciCFU/ml ； 所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株(Actinobacillus pIeuropneumoniaeserotypel strain LC)的保藏編號為:CCTCC NO:M 2011458 ;所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清 5 型 YC 株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype5 strain YC)的保藏編號為=CCTCC NO:M 2011459 ;所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株(Actinobacilluspleuropneumoniae serotype7 strain YS)的保藏編號為:CCTCC NO:M 2011460 ;上述菌種均保藏於中國典型培養物保藏中心。
5.根據權利要求4所述的疫苗組合物，其特徵在於: 所述豬肺炎支原體抗原為與豬肺炎支原體HN0613的16S rRNA的同源性至少為80%的囷株； 在所述疫苗組合物中，所述豬肺炎支原體HN0613抗原滅活前含量為2X 109MHDCE/ml ； 在所述疫苗組合物中，所述豬胸膜肺炎放線桿菌滅活前血清I型LC株含量為IO9CFU/ml，血清5型YC株含量為109CFU/ml，血清7型YS株含量為109CFU/ml。
6.根據權利要求6所述的疫苗組合物，其特徵在於:所述豬肺炎支原體抗原為與豬肺炎支原體HN0613的16S rRNA的同源性至少為95%~99%的菌株。
7.根據權利要求1~6中任意一項所述的疫苗組合物，其特徵在於:所述疫苗組合物還包括其它豬的病原體的附加抗原，其選自豬繁殖與呼吸症候群病毒的抗原、豬瘟抗原、豬偽狂犬病毒抗原、豬圓環病毒抗原、豬波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原、豬流感病毒中的一種或幾種。
8.根據權利要求1~7中任意一項所述的疫苗組合物，其特徵在於:所述疫苗組合物還包括疫苗輔劑，並且，在所述疫苗組合物中，所述疫苗輔劑含量為10wt%~ 60wt%。
9.一種根據權利要求1~8中任意一項所述疫苗組合物的製備方法，包括配苗步驟:將抗原與疫苗輔劑混合製得抗豬支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎疫苗組合物，其中，所述抗原包括豬肺炎支原體抗原和豬胸膜肺炎放線桿菌抗原。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於:在配苗步驟中，所述抗原還包括其它豬的病原體的附加抗原。
11.一種根據權利要求 1~6中任意一項所述的疫苗組合物在稀釋PRSS疫苗中的應用。
【文檔編號】A61P31/20GK103623400SQ201210305034
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月24日 優先權日:2012年8月24日
【發明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司