通過使用棒狀菌突變株發酵生產5'－一磷酸黃苷的方法
2023-05-30 22:29:56
專利名稱:通過使用棒狀菌突變株發酵生產5'－一磷酸黃苷的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產5』-一磷酸黃苷的發酵方法以及其中使用的微生物。
5』-一磷酸黃苷(XMP)是嘌呤核苷酸生物合成的一種中間體並且被用作生產已知作為風味劑[Kuninaka(1960)《日本農業化學協會雜誌》(J.Agr.Chem.Soc.Japan)34，489]的5』-一磷酸鳥苷(GMP)的工業原料和用於合成藥物的原料[美國專利5,736,530]。
相關現有技術的描述已知通過直接發酵方法生產5』-一磷酸黃苷的方法包括使用棒狀菌(coryneform bacteria)的各種菌株的方法。據發現穀氨酸棒桿菌(穀氨酸微球菌)和產氨短桿菌(現被重新命名為產氨棒桿菌)的需要鳥嘌呤或需要腺嘌呤-鳥嘌呤的突變株在合適的發酵條件下積累了大量的XMP[Misawa等人，1964，《農業生物化學》(Agr.Biol.Chem.)28，690-693，Misawa等人，1964，《農業生物化學》(Agr.Biol.Chem.)28，694-699，Demain等人，1965，《Aool.Vicrobiol.》13，757-765；Misawa等人，1969，《農業生物化學》(Agr.Biol.Chem.)33，370-376]。通過這些菌株積累XMP似乎是由於從細胞中直接分泌出從頭合成的核苷酸，這是因為XMP焦磷酸化酶(黃嘌呤phosphorybosyltransferase)非常少甚至是缺乏的，並且通過生長的細胞並不將外源提供的黃嘌呤轉化為XMP[Misawa等人，1964，《農業生物化學》(Agr.Biol.Chem.)28，694-699]。
此外，據報導通過具有弱的5』-核苷酸酶活性的枯草芽孢桿菌之需要腺嘌呤或需要腺嘌呤-鳥嘌呤的突變株積累了XMP以及IMP[Akiya等人，1972《農業生物化學》(Agr.Biol.Chem.)36，227-234]。
之後描述了一種使用具有弱的核苷酸酶活性並且具有更高XMP產率的產氨棒桿菌之腺嘌呤滲漏且需要鳥嘌呤的突變株的方法[Fujio等人，1984，《發酵技術雜誌》《J.Ferment.Technol.》62，131]。
此外，也已經進行了通過賦予產氨棒桿菌的5』-一磷酸黃苷產生菌株其它的特性來提高其產率的嘗試。現已發現通過使需要腺嘌呤-鳥嘌呤的突變株對溶菌酶具有敏感性[韓國專利公開號86-248及89-540]或者對細胞壁抑制性抗生素具有抗性[日本專利延遲公開號60-156399A2]就可以極大地提高產氨棒桿菌的5』-一磷酸黃苷產生菌株的產率。
對溶菌酶的敏感性以及對抗生素的抗性顯然與5』-一磷酸黃苷的胞質膜滲透性有關。
眾所周知使微生物細胞處於應激(溫度，輻射、飢餓、抑制劑和抗生素)之下的多種處理都會導致RNA和DNA的破壞，繼而分泌出核酸衍生物[A.Demain(1968).「通過發酵生產嘌呤核苷酸」《工業微生物學進展》(Progress inIndustrial Microbiology)第18卷，編輯D.J.D.Hockenhull.J.A.Churchill有限公司，倫敦]。目前通常接受的是代謝物垮過胞質膜的滲透一般是由或多或少的特異性流出的轉運蛋白介導的[Pao等人，1998《微生物學分子生物學回顧》(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62，1-34；Paulsen等人，1998《分子生物學雜誌》(J.Mol.Biol.)277，573-592；Saier等人，1999《分子微生物學生物技術雜誌》(J.Mol.Microbiol.Biothechnol.)(1999)1，257-279]。反之，可以合理地推測出這些轉運蛋白可以在應激條件下被誘導或激活。據表明在許多年前[Billen，D.(1957)《Arch.Bichem.Biophys.》67，333-340]，紫外線或X射線照射的大腸桿菌細胞分泌出遊離的鹼基、核苷、單核苷酸和ATP。由於沒有發現DNA衍生物或肽，因此這種釋放並非是細胞溶解的結果。對於釋放最大時需要葡萄糖和無機磷酸鹽並且砷酸鹽或低溫的抑制作用表明其涉及了酶促作用，其中可能包括轉運蛋白的合成。
另外，在腺嘌呤滲漏的產氨棒桿菌營養缺陷型的培養中錳離子(Mn2+)的缺乏導致對5』-一磷酸肌苷「膜滲透屏障的改變」，從而造成核苷酸大量的積累[Furuya等人，1970《農業生物化學》(Agr.Biol.Chem.)34，210-217]。之後確定了錳離子的缺乏影響了存在於棒狀菌中依賴於錳的核糖核苷酸還原酶功能，並且誘導了不平衡的生長應激[Auling等人，1980《Arch. Microbiol.》127，105-114；Willing等人，1988《歐洲生物化學雜誌》(Eur.J.Biochem.)170，603-611]。在這種情況下細胞呈現出絲狀的生長，並且分泌蛋白和一些代謝物到培養基中。
據認為在過量錳離子存在下由一些產氨短桿菌突變株所致的5』-一磷酸肌苷產率的提高也是由IMP分泌的「滲透性改善」引起的。這些突變株表現出對多種抗生素、洗滌劑、染料和溶菌酶的敏感性有所增加[Teshiba，S.與A.Furuya，1983.《農業生物化學》(Agr.Biol.Chem.)47，1035-1041]，而這顯然與細菌膜的改變有關。
另一方面，在枯草芽孢桿菌中，通過引入賦予了對抑制濃度的甲硫氨酸和甲硫氨酸類似物DL-甲硫氨酸亞碸的抗性的突變顯著地提高了鳥苷的生產[Matsui等人，1977《應用環境微生物學》(Appl.Environ.Microbiol.)34，337-341；Matsui等人，1979《農業生物化學》(Agr.Biol.Chem.)43，1317-1323]。甲硫氨酸亞碸的抗性主要導致5』-核苷酸酶特異性的降低並且通過GMP導致IMP脫氫酶的抑制作用和阻遏作用的部分喪失[Matsui等人，1977《應用環境微生物學》(Appl.Environ.Microbiol.)34，337-341]。而且，由GMP所致的PRPP醯胺轉移酶的陽遏和抑制作用也會喪失[Matsui等人，1979《農業生物化學》(Agr.Biol.Chem.)43，1317-1323]。將IMP轉化為XMP的IMP脫氫酶是對GMP合成具有特異性的途徑中的第一種酶，並且通常由GMP調節[Nishikawa等人，1967《生物化學雜誌》(J.Biochem.)62，92]。PRPP醯胺轉移酶是嘌呤核苷酸生物合成途徑中的第一種酶，並且由AMP和GMP調節[Nishikawa等人，1967《生物化學雜誌》(J.Biochem.)62，92；Sato與Shiio，1970《生物化學雜誌》(J.Biochem.)68，763]。但是，從來沒有利用對甲硫氨酸類似物的抗性來改進棒狀菌的XMP產生菌株。
發明的內容本發明已經考慮了上述觀點，本發明的一個目的在於提供一種針對工業目的以高產率生產5』-一磷酸黃苷的更高效的方法以及可以在所述方法中使用的微生物。
為此，本發明的發明人在對5』-一磷酸黃苷產生菌進行了大量研究之後，發現屬於產氨棒桿菌(Coryvebacterium ammoniagenes)的並且具有新近發現的突變的微生物在培養基中產生和積累了相當更多量的5』-一磷酸黃苷，其中所述的突變賦予了對細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑、磷酸化抑制劑、解偶聯劑、RNA-聚合酶抑制劑和甲硫氨酸類似物的抗性。對一系列突變株的研究表明對上述化合物的抗性與5』-一磷酸黃苷的積累直接相關。
迄今，人們沒有認識到5』-一磷酸黃苷的產率可以通過使產生5』-一磷酸黃苷的微生物具有上述特性來提高。
因此基於這一發現繼續地工作以完成了本發明。
於是，本發明如下(1)棒狀菌，所述的細菌對由抑制劑所致的生長抑制作用具有抗性並且具有生產5』-一磷酸黃苷的能力，所述的抑制劑選自細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑、磷酸化抑制劑、解偶聯劑、RNA-聚合酶抑制劑和甲硫氨酸類似物。
(2)棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產5』-一磷酸黃苷的能力並且對甘氨酸具有抗性。
(3)棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產5』-一磷酸黃苷的能力並且對多粘菌素具有抗性。
(4)棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產5』-一磷酸黃苷的能力並且對寡黴素具有抗性。
(5)棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產5』-一磷酸黃苷的能力並且對羰基氰化間氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrasone)(CCCP)具有抗性。
(6)棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產5』-一磷酸黃苷的能力並且對利福平具有抗性。
(7)棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產5』-一磷酸黃苷的能力並且對甲硫氨酸類似物具有抗性，其中所述的甲硫氨酸類似物選自DL-甲硫氨酸亞碸。L-甲硫氨酸亞碸、DL-甲硫氨酸碸以及L-甲硫氨酸碸。
(8)根據上述(1)至(7)之任一的棒狀菌，其中所述的細菌屬於產氨棒桿菌。
(9)根據(2)的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 10-52(VKPM B-8006)。
(10)根據(3)的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 101-51(VKPM B-8010)。
(11)根據(4)的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 67-52(VKPM B-8004)。
(12)根據(5)的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 97-52(VKPM B-8008)。
(13)根據(6)的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 93-38(VKPM B-8003)。
(14)根據(7)的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 11-51(VKPM B-8005)。
(15)根據(7)的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 47-51(VKPM B-8007)。
(16)一種通過發酵生產5』-一磷酸黃苷的方法，該方法包括下列步驟在培養基中培養上述(1)至(15)之任一所說的細菌以便在培養物中生產和積累5』-一磷酸黃苷，以及從中回收所述的5』-一磷酸黃苷。
下面將要詳細地解釋本發明。
通過發明人以上的發現，他們認為可以合理地推測出一些影響細胞膜功能、DNA複製、轉錄或翻譯機理的突變可能是模擬了應激條件並且誘導了特異性轉運蛋白活性的增強，從而增加了核酸衍生物、並且更具體地講為5』-一磷酸黃苷的積累。此外，由轉運蛋白介導的分泌可能取決於細菌細胞的能級的事實看來，增強ATP再生活性的突變對於5』-一磷酸黃苷產生菌株的改進可能也是有用的。
本發明的微生物可以通過賦予其特異性抗性而由本身就具有生產5』-一磷酸黃苷能力的微生物中獲得。另一方面，本發明的微生物也可以通過使具有所述特異性抗性的微生物具有生產5』-一磷酸黃苷的能力來獲得。
術語「對細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑具有抗性的細菌」是指這樣一種來源於屬於棒狀菌的細菌菌株的微生物，其中由於親本菌株在遺傳特性上進行了修飾，從而它可以在含有細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑的培養基中生長。術語「細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑」是指抑制了胞質膜生物合成或者影響其正常功能的化合物(例如甘氨酸、多粘菌素、短桿菌肽)。因此，正如本文所使用的那樣，術語「對由細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑所致的生長抑制作用的抗性」是指突變株能夠在含有作為抑制劑的化合物的營養培養基中生長，而所述抑制劑的量可以抑制親本菌株的生長。
例如，通過在瓊脂平板上在32℃下培養，其中所述的瓊脂平板含有40g/L或更多，優選50g/L或更多，的甘氨酸、40mg/L或更多，優選50mg/L或更多，的多粘菌素、5mg/L或更多，優選10mg/L或更多的，短桿菌肽，可以在3-5天內形成菌落的微生物對這些藥物具有抗性。
術語「對磷酸化抑制劑具有抗性的細菌」是指這樣一種來源於屬於棒狀菌的細菌菌株的微生物，其中由於親本菌株在遺傳特性上進行了修飾，從而它可以在含有磷酸化抑制劑的培養基中生長。術語「磷酸化抑制劑」是指抑制通過F0/F1ATP酶(ATP合酶)由ADP和Pi合成ATP的化合物(例如寡黴素)。因此，正如本文所使用的那樣，術語「對由磷酸化抑制劑所致的生長抑制作用的抗性」是指突變株能夠在含有作為抑制劑的化合物的營養培養基中生長，而所述抑制劑的量可以抑制親本菌株的生長。
例如，通過在瓊脂平板上在32℃下培養，其中所述的瓊脂平板含有50mg/L或更多，優選100mg/L或更多，的寡黴素，可以在3天內形成菌落的微生物對寡黴素具有抗性。
術語「對解偶聯劑具有抗性的細菌」是指這樣一種來源於屬於棒狀菌的細菌菌株的微生物，其中由於親本菌株在遺傳特性上進行了修飾，從而它可以在含有解偶聯劑的培養基中生長。術語「解偶聯劑」是指廢止了呼吸鏈和磷酸化系統之間的專性聯繫的化合物[例如二硝基苯酚、羰基氰化間氯苯腙(CCCP)、對三氟甲氧基羰基氰化苯腙(FCCP)]。因此，正如本文所使用的那樣，術語「對解偶聯劑的抗性」是指突變株能夠在含有作為抑制劑的化合物的營養培養基中生長，而所述抑制劑的量可以抑制親本菌株的生長。
例如，通過在瓊脂平板上在32℃下培養，其中所述的瓊脂平板含有2mg/L或更多，優選4mg/L或更多，的CCCP或FCCP，可以在3天內形成菌落的微生物對CCCP或FCCP具有抗性。
術語「對RNA-聚合酶抑制劑具有抗性的細菌」是指這樣一種來源於屬於棒狀菌的細菌菌株的微生物，其中由於親本菌株在遺傳特性上進行了修飾，從而它可以在含有RNA-聚合酶抑制劑的培養基中生長。術語「RNA-聚合酶抑制劑」是指抑制了依賴於DNA的RNA聚合酶活性的化合物(例如利福平)。因此，正如本文所使用的那樣，術語「對RNA-聚合酶抑制劑的抗性」是指突變株能夠在含有作為抑制劑的化合物的營養培養基中生長，而所述抑制劑的量可以抑制親本菌株的生長。
例如，通過在瓊脂平板上在32℃下培養，其中所述的瓊脂平板含有5mg/L或更多，優選15mg/L或更多，的利福平，可以在3天內形成菌落的微生物對利福平具有抗性。
術語「對甲硫氨酸類似物具有抗性的細菌」是指這樣一種來源於屬於棒狀菌的細菌菌株的微生物，其中由於親本菌株在遺傳特性上進行了修飾，從而它可以在含有甲硫氨酸類似物的培養基中生長。術語「甲硫氨酸類似物」是指在結構上類似於甲硫氨酸的化合物(DL-甲硫氨酸亞碸、L-甲硫氨酸亞碸、DL-甲硫氨酸碸以及L-甲硫氨酸碸)。因此，正如本文所使用的那樣，術語「對甲硫氨酸類似物的抗性」是指突變株能夠在含有作為抑制劑的化合物的營養培養基中生長，而所述抑制劑的量可以抑制親本菌株的生長。
例如，通過在瓊脂平板上在32℃下培養，其中所述的瓊脂平板含有5g/L或更多，優選10g/L或更多，的DL-甲硫氨酸亞碸或L-甲硫氨酸亞碸、或者5g/L或更多，優選10g/L或更多，的DL-甲硫氨酸碸成L-甲硫氨酸碸，可以在5天內形成菌落的微生物對這些藥物具有抗性。
本發明中所稱的「棒狀菌」包括迄今為止已被分入短桿菌屬、但目前又被併入棒桿菌屬的細菌[Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981)]，以及包括屬於與棒桿菌屬關係密切的短桿菌屬的細菌。所述棒狀菌的例子包括以下內容產氨棒桿菌(產氨短桿菌)(Corynebacterium ammoniagenes(Brevibacterium ammoniagenes))嗜乙醯乙酸棒桿菌 (Corynebacterium acetoacidophilum)醋谷棒桿菌 (Corynebacterium acetoglutamicum)解鹼棒桿菌 (Corynebacterium alkanolyticum)美棒桿菌 (Corynebacterium callunae)穀氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)百合花棒桿菌 (Corynebacterium lilium(穀氨酸棒桿菌) (Corynebacterium glutamicum))melassecola棒桿菌 (Corynebacterium melassecola)熱產氨棒桿菌 (Corynebacterium thermoaminogenes)力士棒桿菌 (Coryneabcterium herculis)擴展短桿菌 (Brevibacterium divaricatum(穀氨酸棒桿菌) (Corynebacterium glutamicum))黃色短桿菌 (Brevibacterium flavum(穀氨酸棒桿菌) (Corynebacterium glutamicum))immariophilum短桿菌 (Brevibacterium immariophilum)乳發酵短桿菌 (Brevibacterium lactofermentum(穀氨酸棒桿菌) (Corynebacterium glutamicum))玫瑰色短桿菌 (Brevibacterium roseum)解糖短桿菌 (Brevibacterium saccharolyticum)生硫短桿菌 (Brevibacterium thiogenitalis)白色短桿菌 (Brevibacterium album)蠟狀短桿菌 (Brevibacterium cerinum)嗜氨微桿菌 (Microbacterium ammoniaphilum)更具體地講，下面給出了這些細菌菌株的具體實例產氨棒桿菌(產氨短桿菌)ATCC6871，ATCC6872，VKPM B-6307嗜乙醯乙酸棒桿菌ATCC13870醋谷棒桿菌ATCC15806解鹼棒桿菌ATCC21511美棒桿菌ATCC15991穀氨酸棒桿菌ATCC13020，ATCC13032，ATCC13060百合花棒桿菌(穀氨酸棒桿菌)ATCC15990melassecola棒桿菌ATCC17965熱產氨棒桿菌AJ12340(FERM BP-1539)力士棒桿菌ATCC13868擴展短桿菌(穀氨酸棒桿菌)ATCC14020黃色短桿菌(穀氨酸棒桿菌)ATCC13826，ATCC14067immariophilum短桿菌ATCC14068乳發酵短桿菌(穀氨酸棒桿菌)ATCC13665，ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240白色短桿菌ATCC15111蠟狀短桿菌ATCC15112
嗜氨微桿菌ATCC15354除了已經提到的特性之外，在不偏離本發明範圍的情況下，它們也可以具有其它特異的特性，諸如不同的營養需求、抗藥性、藥物敏感性和藥物依賴性。此外，本發明的微生物可以通過遺傳重組技術進行修飾以提高參與5』-一磷酸黃苷生物合成的酶的活性。
在實現本發明中有用的突變微生物可以通過採用常規的誘變技術(諸如紫外線照射、X射線照射、放射性射線照射)以及用化學誘變劑處理隨後通過影印方法進行選擇的突變來獲得。優選的誘變劑為N-硝基-N』-甲基-N-亞硝基胍(下文中稱作NTG)。
因此，可能可以使屬於棒狀菌的本身就具有生產5』-一磷酸黃苷能力的任何已知菌株(比如產氨棒桿菌)經歷上述突變過程之一以獲得突變菌株，然後測試突變菌株以確定其是否滿足本發明與對抑制劑所致的生長抑制作用的抗性有關的上述要求並從而適用於本發明，其中所述的抑制劑為細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑、磷酸化抑制劑、解偶聯劑、RNA-聚合酶抑制劑或甲硫氨酸類似物。通過在營養培養基中培養並且選出具有比其親本菌株更高產率地生產5』-一磷酸黃苷能力的菌株來篩選出如上所述突變的菌株，並且在本發明中使用得到的菌株。
滿足本發明要求的菌株也可以通過本領域普通技術人員眾所周知的遺傳重組技術來得到。
通過順序選擇或遺傳重組技術可以在一個菌株中結合以上提到的抗性特徵。
在實踐本發明的過程中使用的菌株的代表性實例為AGRI45-11(VKPM B-8009)、AGRI101-51(VKPM B-8010)、AGRI10-52(VKPM B-8006)、AGRI67-52(VKPM B-8004)、AGRI97-52(VKPM B-8008)、AGRI11-51(VKPMB-8005)、AGRI47-51(VKPMB-8007)和AGRI93-38(VKPMB-8003)。除了對生長抑制作用的抗性以及以更高的產率生產5』-一磷酸黃苷的能力之外，其中所述的抑制作用是由細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑、磷酸化抑制劑、解偶聯劑、RNA-聚合酶抑制劑或甲硫氨酸類似物所致的，在本發明生產5』-一磷酸黃苷中所用的棒狀菌與其親本菌株具有相同的細菌學特性。保藏號(VKPM B-8003-8010)已經在俄羅斯國家工業微生物保藏所(VKPM)中進行了保藏的微生物，該保藏所位於俄羅斯莫斯科的1-st DorozhnyProezd，b.1 VKPM B-8003至8010於2001年7月17日保藏於上述保藏機構，並於2001年10月15日按布達佩斯條約由原始保藏轉為國際保藏。
這些菌株來源於作為親本菌株的產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)，該菌株為5』-一磷酸黃苷產生菌產氨棒桿菌AJ13606的鏈黴素抗性衍生菌。依次地，通過將以下一系列突變(即鳥嘌呤滲漏的需要、對高溫的敏感性以及對磺胺胍的抗性)依次引入到菌株AG98-79的基因組中，從5』-一磷酸肌苷產生菌產氨棒桿菌AG98-79得到了菌株產氨棒桿菌AJ13606，其中產氨棒桿菌AG98-79為已知菌株產氨棒桿菌225-5(VKPM B-1073)[俄羅斯專利515783]的衍生菌株。
以上述方法得到的產生5』-一磷酸黃苷的微生物可以以與常規的微生物培養相同的方式進行培養。因此，對培養基而言，可以使用液體培養基，其中含有一種或多種碳源、一種或多種氮源和金屬離子，並且如果需要的話，還含有其它營養物，比如胺基酸、核酸和維生素。作為碳源，例如可以使用葡萄糖、果糖、核糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、澱粉、澱粉水解物、糖蜜等。作為氮源，可以使用有機氮源(比如腖、玉米漿、大豆粉、酵母提取物以及脲)，此外還可以使用無機氮源(比如硫酸、硝酸、鹽酸、碳酸和其它酸的銨鹽，氨氣和氨水)，它們可以單獨或混合使用。作為其它營養物，適當地選出為細菌生長所必須的無機鹽、胺基酸、維生素等並且這些物質可以單獨或混合使用。
培養通常是在需氧的條件下進行的。培養基優選pH在5至9的範圍內。培養溫度通常在25℃至40℃之間進行選擇，以便該溫度適合於所用微生物的生長以及5』-一磷酸黃苷的積累。優選進行培養直至5』-一磷酸黃苷的積累基本上達到最大。一般說來，培養1到6天能夠達到此目的。
對於從所得的培養液中分離和回收5』-一磷酸黃苷來說，可以採用本領域公知的常規純化技術。
從工業化的觀點來看，本發明生產5』-一磷酸黃苷的方法是很有利的，這是因為它導致更為大量地積累了5』-一磷酸黃苷，同時極少地生產出5』-一磷酸肌苷、黃苷或黃嘌呤這類副產物。
實施本發明的最佳方式下面的實施例目的在於更為具體地解釋本發明。
實施例1對甘氨酸具有抗性的突變株的選擇濃度介於1至6％之間的甘氨酸通過抑制D-丙氨醯D-丙氨醯連接酶和丙氨酸消旋酶來影響細胞壁的合成。在大腸桿菌中，對甘氨酸耐受性增加的突變株也表現出對青黴素G的敏感性有所增加(Wijsman Pafort，1974《Mol.Gen.Genet.》128，349-357)。因此，通過選擇甘氨酸抗性突變株，有可能獲得在胞外被膜中功能有所扭曲的菌株。這種缺陷可能模擬了應激條件並且誘導了參與XMP分泌的轉運蛋白。因此，選出了對由甘氨酸所致的生長抑制作用具有抗性的突變株。
用50μg/ml NTG處理產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)20分鐘。然後將細胞平鋪在PYM培養基上，所述培養基具有下列組成(g/L)腖-10.0，酵母提取物-10.0，肉膏-5.0，NaCl-2.5，瓊脂-20.0，並且含有40g/L、或50g/L或者60g/L的甘氨酸。將接種的平板在30℃下培養5天。從呈現出的菌落當中，選出了產率最高的菌株產氨棒桿菌AGRI10-52(VKPM B-8006)。
將該菌株以及親本菌株產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)分別在種子培養基中在通氣情況下於32℃下培養20小時，所述的培養基具有下列組成(g/L)葡萄糖-20.0，腖-10.0，酵母提取物-10.0，NaCl-2.5，pH7.2，該培養基盛於20×200mm試管中。然後，將0.3ml所得的培養物接種到盛於20×200mm試管中的3ml具有下列組成(見下文)的發酵培養基中，並且在旋轉搖床上在32℃下培養72小時。
在培養後，通過已知的方法測定培養基中XMP的積累量。
結果示於表1中。如表1所示，對甘氨酸具有抗性的AGRI10-52菌株比起親本菌株積累了更多的XMP。
基本培養基的組成g/L葡萄糖 90.0脲 7.2穀氨酸一鈉鹽 20.0Mamenou(T-N) 1.4KH2PO415.0K2HPO415.0
MgSO4·7H2O 10.0CaCl2·2H2O 0.1MnCl2·4H2O 0.01ZnSO4·7H2O 0.001FeSO4·7H2O 0.01生物素 0.00003泛酸鈣 0.01鹽酸硫胺素 0.005腺嘌呤 0.025鳥嘌呤 0.025pH(用氫氧化鉀調節) 7.2表1
注釋+生長；-沒有生長實施例2對多粘菌素B具有抗性的突變株的選擇多粘菌素B是一種有效地抵抗革蘭氏陰性細菌的多肽抗生素。人們認為細菌的細胞膜是所述抗生素的目標。本發明的發明人發現高濃度(40-50g/ml)的多粘菌素B抑制了革蘭氏陽性細菌產氨棒桿菌的生長。賦予了對多粘菌素B的抗性的突變可以作用於胞質膜並且模擬了應激條件，其中包括XMP流出轉運蛋白。從而選出對由所述藥物所致的生長抑制作用具有抗性的突變株。
用NTG處理產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)，並且將細胞平鋪在如實施例1所述的PYM培養基上，而所述培養基含有45μg/ml、或50μg/ml、或55μg/ml或者60μg/ml的多粘菌素。將接種的平板在30℃下培養5天。從呈現出的菌落中，選出了產率最高的菌株產氨棒桿菌AGRI101-51(VKPM B-8010)。
將該菌株以及親本菌株產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)分別在如實施例1的種子培養基中在通氣情況下於32℃下培養20小時。然後，將0.3ml所得的培養物接種到盛於20×200mm試管中的3ml實施例1的發酵培養基中，並且在旋轉搖床上在32℃下培養72小時。在培養後，通過已知的方法測定培養基中XMP的積累量。
結果示於表2中。如表2所示，對多粘菌素具有抗性的AGRI101-51菌株比起親本菌株積累了更多的XMP。
表2
參見表1的注釋實施例3對利福平具有抗性的突變株的選擇利福平及其衍生物為通過結合到酶的β-亞單位並阻止轉錄開始來抑制依賴於DNA的RNA聚合酶活性的抗生素[Hartman等人，1967《Biochim.Biophys.Acta》145，843-844；Linn等人，1975《細菌學雜誌》(J.Bacteriol.)122，1387-1390]。已經報導了針對利福平抗性的突變對不同細菌的複合代謝過程具有多效的影響[Kane等人，1979《細菌學雜誌》(J.Bacteriol.)137，1028-1030；Jin與Gross，1989《細菌學雜誌》(J.Bacteriol.)171，5229-5231；Livshits與Sukhodolets，1973《Genetika》9，102-111]，而這類似於對已經條件的響應。因此，選出了對由利福平所致的生長抑制作用具有抗性的突變株並且測試了它的XMP的產率。
將親本菌株產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)劃線接種到實施例1的PYM培養基上，所述培養基含有5、15、30或50μg/ml的利福平(而非甘氨酸)，並且將接種的平板在34℃下培養3天。從自發呈現出的菌落中選出對利福平具有抗性的突變株。在這些突變株中，選出產率最高的菌株產氨棒桿菌AGRI93-38(VKPM B-8003)。
將該菌株以及親本菌株產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)分別在如實施例1的種子培養基中在通氣情況下於32℃下培養20小時。然後，將0.3ml所得的培養物接種到盛於20×200mm試管中的3ml實施例1的發酵培養基中，並且在旋轉搖床上在32℃下培養72小時。在培養後，通過已知的方法測定培養基中XMP的積累量。
結果示於表3中。如表3所示，對利福平具有抗性的AGRI93-38菌株比起親本菌株積累了大約多出10％的XMP。
表3
參見表1的注釋實施例4對寡黴素具有抗性的突變株的選擇寡黴素是一種眾所周知的磷酸化抑制劑，它通過F0/F1ATP酶阻礙ATP的合成。克服了所述抗生素作用的突變可能已經提高了產生ATP的活性。反過來，產生ATP的激活可能對轉運蛋白介導的嘌呤核苷酸的分泌具有積極的作用。
採用實施例1所述的步驟，從菌株產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)中選出對50或100μg/ml寡黴素具有抗性的一系列突變株，只是其中使用了寡黴素而非甘氨酸。它們中的一些證實了要比親本菌株的產率高。當如實施例1進行平行測定時，最佳突變株產氨棒桿菌AGRI67-52(VKPM B-8004)比起親本菌株產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)積累了大約多出22％的XMP。
表4
參見表1的注釋實施例5對羰基氰化間氯苯腙具有抗性的突變株的選擇羰基氰化間氯苯腙(CCCP)是眾所周知的解偶聯劑，它廢止了呼吸鏈和磷酸化系統之間的專性聯繫。克服了所述藥物的這種作用的突變可以增強細胞的能量代謝並提高了產生ATP的活性。反過來，產生ATP的激活可能對轉運蛋白介導的嘌呤核苷酸的分泌具有積極的作用。
用NTG處理產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)，並將細胞平鋪到如實施例1的PYM培養基上，其中所述培養基含有2、4或6μg/ml的CCCP、而非甘氨酸。將接種的平板在30℃下培養5天。從呈現出的菌落當中，選出產率最高的菌株產氨棒桿菌AGRI97-52(VKPM B-8008)。將該菌株以及親本菌株產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPMB-8009)分別在如實施例1的種子培養基中在通氣情況下於32℃下培養20小時。然後，將0.3ml所得的培養物接種到盛於20×200mm試管中的3ml實施例1的發酵培養基中，並且在旋轉搖床上在32℃下培養72小時。在培養後，通過已知的方法測定培養基中XMP的積累量。
結果示於表5中。如表5所示，菌株AGRI97-52比起親本菌株積累了大約多出15％的XMP。
表5
參見表1的注釋實施例6對甲硫氨酸亞碸具有抗性的突變株的選擇高濃度的DL-甲硫氨酸及其類似物、穀氨醯胺拮抗劑、DL-甲硫氨酸亞碸抑制了XMP產生菌株產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPMB-8009)的生長。已知枯草芽孢桿菌的甲硫氨酸亞碸抗性突變株生產鳥苷的能力有所改善(Matsui等人，《應用環境微生物學》(Appl.Environ.Microbiol.)34，337-341，1977；Matsui等人，《農業生物化學》(Agric.Biol.Chem.)43(6)，1317-1323，1979；Matsui等人，《農業生物化學》(Agric.Biol.Chem.)46(9)，2347-2352，1982)。從而得到了對所述類似物具有抗性的突變株。
如實施例1那樣用NTG處理產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPMB-8009)，將等分試樣引入到20×200mm試管中，並於32℃下在旋轉搖床上在具有下列組成(見下文)的基本培養基中振蕩培養20小時。然後收集細胞並將其平鋪在含有瓊脂以及若干種抑制劑組合的基本培養基上1.DL-甲硫氨酸亞碸(5mg/ml)+DL-甲硫氨酸(7.5mg/ml)；2.DL-甲硫氨酸亞碸(10mg/ml)+DL-甲硫氨酸(7.5mg/ml)；3.DL-甲硫氨酸亞碸(5mg/ml)+DL-甲硫氨酸(20mg/ml)；4.DL-甲硫氨酸亞碸(10mg/ml)+DL-甲硫氨酸(20mg/ml)；基本培養基的組成g/L葡萄糖 20.0脲 2.0KH2PO41.0K2HPO43.0MgSO4·7H2O 0.3CaCl2·2H2O 0.1MnCl2·4H2O 0.0036ZnSO4·7H2O 0.001FeSO4·7H2O 0.01生物素 0.00003泛酸鈣 0.01鹽酸硫胺素 0.005腺嘌呤 0.025鳥嘌呤 0.025pH(用氫氧化鉀調節) 7.2瓊脂(在固體培養基中) 20.0將培養了4至8天後出現的突變株挑出並且測試其XMP的產率。在這些菌株當中，選出菌株產氨棒桿菌AGRI11-51(VKPM B-8005)。將該菌株以及親本菌株產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)分別在如實施例1的種子培養基中在通氣情況下於32℃下培養20小時。然後，將0.3ml所得的培養物接種到盛於20×200mm試管中的3ml實施例1的發酵培養基中，並且在旋轉搖床上在32℃下培養72小時。在培養後，通過已知的方法測定培養基中XMP的積累量。結果示於表6中。如表6所示，菌株AGRI11-51比起親本菌株積累了大約多出31％的XMP。
表6
參見表1的注釋實施例7對甲硫氨酸碸具有抗性的突變株的選擇高濃度的另一種甲硫氨酸類似物、即DL-甲硫氨酸碸也抑制了XMP產生菌株產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPM B-8009)的生長。採用實施例6所述的步驟得到了對所述類似物具有抗性的突變株，其中除了僅僅採用了下列抑制劑的組合DL-甲硫氨酸碸(10mg/ml)+DL-甲硫氨酸(20mg/ml)。
在培養了4至8天後出現的突變株當中，選出菌株產氨棒桿菌AGRI47-51(VKPMB-8007)。將該菌株以及親本菌株產氨棒桿菌AGRI45-11(VKPMB-8009)分別在如實施例1的種子培養基中在通氣情況下於32℃下培養20小時。然後，將0.3ml所得的培養物接種到盛於20×200mm試管中的3ml實施例1的發酵培養基中，並且在旋轉搖床上在32℃下培養72小時。結果示於表7中。
表7
參見表1的注釋如表7所示，AGRI47-51菌株比起親本菌株積累了大約多出36％的XMP。
權利要求
1.棒狀菌，所述的棒狀菌對由抑制劑所致的生長抑制作用具有抗性並且具有生產5』-一磷酸黃苷的能力，所述的抑制劑選自細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑、磷酸化抑制劑、解偶聯劑、RNA-聚合酶抑制劑和甲硫氨酸類似物。
2.棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產5』-一磷酸黃苷的能力並且對甘氨酸具有抗性。
3.棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產5』-一磷酸黃苷的能力並且對多粘菌素具有抗性。
4.棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產5』-一磷酸黃苷的能力並且對寡黴素具有抗性。
5.棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產5』-一磷酸黃苷的能力並且對羰基氰化間氯苯腙(CCCP)具有抗性。
6.棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產5』-一磷酸黃苷的能力並且對利福平具有抗性。
7.棒狀菌，所述的棒狀菌具有生產5』-一磷酸黃苷的能力並且對甲硫氨酸類似物具有抗性，其中所述的甲硫氨酸類似物選自DL-甲硫氨酸亞碸、L-甲硫氨酸亞碸、DL-甲硫氨酸碸以及L-甲硫氨酸碸。
8.根據權利要求
1至7之任一項的棒狀菌，其中所述的細菌屬於產氨棒桿菌。
9.根據權利要求
2的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 10-52(VKPM B-8006)。
10.根據權利要求
3的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 101-51(VKPM B-8010)。
11.根據權利要求
4的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 67-52(VKPM B-8004)。
12.根據權利要求
5的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 97-52(VKPM B-8008)。
13.根據權利要求
6的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 93-38(VKPM B-8003)。
14.根據權利要求
7的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 11-51(VKPM B-8005)。
15.根據權利要求
7的棒狀菌，其中所述的細菌為產氨棒桿菌AGRI 47-51(VKPM B-8007)。
16.一種通過發酵生產5』-一磷酸黃苷的方法，該方法包括下列步驟在培養基中培養權利要求
1至15之任一項的細菌以便在培養物中生產和積累5』-一磷酸黃苷，以及從中回收所述的5』-一磷酸黃苷。
專利摘要
通過培養細菌以及從中回收5』－一磷酸黃苷來生產5』－一磷酸黃苷,其中所述的細菌對生長抑制作用具有抗性並且具有生產5』－一磷酸黃苷的能力以便在培養物中生產和積累5』－一磷酸黃苷,而所述的抑制作用是由選自細胞膜生物合成和/或功能的抑制劑、磷酸化抑制劑、解偶聯劑、RNA—聚合酶抑制劑和甲硫氨酸類似物組成的抑制劑導致的。
文檔編號C12P19/00GKCN1362524SQ01130250
公開日2002年8月7日 申請日期2001年11月22日
發明者V·A·裡希特斯, L·A·卡澤裡諾瓦, S·V·格龍斯基, E·A·庫圖科瓦, N·P·扎卡塔瓦 申請人:味之素株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan