具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子及其應用的製作方法
2023-05-31 07:50:46
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及靶向藥物分子領域，具體涉及一種具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子及其應用。
背景技術：
癌症是威脅全球人類生命的最大殺手之一，癌症治療是當前醫學研究所面臨的一個重大挑戰。化學治療與手術治療、放射治療並列為癌症治療的三大基本手段，在癌症治療中佔有重要地位。但是，傳統的化療藥物由於其本身的諸多缺點和毒副作用，在殺死腫瘤細胞時,會給人體正常細胞也帶來嚴重的損傷,導致不同副作用的產生，比如骨髓抑制、白細胞減少、患者疲乏無力、抵抗力下降、易感染、發熱、出血等，大大降低了患者的生存質量，某些時候甚至由於出現嚴重的不良反應而被迫停止治療。
因此，減少化療藥物的耐藥，提高癌症治療療效，並克服化療的毒副作用和提高患者的生活質量是化療藥物研發的重要目標。當代化療藥物研發已經進入「精準」靶向藥物分子設計時代，針對已經明確的致癌位點，以「靶標-配體」的精準相互作用為基礎來設計相應的治療藥物，藥物進入體內會特異地選擇致癌位點來相結合發生作用，使腫瘤細胞特異性死亡，而不影響正常細胞、組織或器官的功能。近些年，不斷有小分子靶向抗腫瘤藥物的新產品上市，如吉非替尼、克唑替尼、埃克替尼等，還有數百個產品正處於臨床研發階段。
小分子靶向藥物的種類有多種，目前研究和利用能夠靶向性殺傷腫瘤細胞而在正常細胞位置保持分子結構的完整性和細胞無毒性的小分子藥物，相比於其他的靶向藥物將更加具有廣泛的應用價值。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子及其應用，其能夠在正常細胞位置保持分子結構的完整性和細胞無毒性，而在腫瘤細胞位置釋放出細胞殺傷性片段，從而實現對腫瘤細胞的選擇性殺傷；同時其對腫瘤細胞具有雙重靶向性。
本發明一方面提供了一種具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子,所述抗腫瘤多肽分子具有如下序列：ac-arg-gly-asp-gly-pro-leu-gly-leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2(rr22)，具體結構如下：
其中，arg為精氨酸，gly為甘氨酸，asp為天冬氨酸，pro為脯氨酸，ala為丙氨酸，ile為異亮氨酸；
所述抗腫瘤多肽分子能夠被基質金屬蛋白酶酶解，釋放出具有腫瘤細胞殺傷性的lr15片段，所述lr15片段為
leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2。
作為優選技術方案，所述抗腫瘤多肽分子含有：提高與癌細胞特異性結合能力的arg-gly-asp片段,具有基質金屬蛋白酶響應性的gly-pro-leu-gly-leu-ala片段，賦予分子疏水性的ile-ile-ile片段，以及利於分子與細胞相互作用的arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg片段。
本發明另一方面提供了由上述具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子製備得到的腫瘤細胞選擇性殺傷劑。由於上述技術方案所提供的抗腫瘤多肽分子具有arg-gly-asp片段，通過該片段可識別性結合腫瘤細胞表面的整合素，同時，所述抗腫瘤多肽分子能夠被基質金屬蛋白酶酶解，釋放出具有腫瘤細胞殺傷性的lr15片段
leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2，
因此，所述抗腫瘤多肽分子可製備成為腫瘤細胞選擇性殺傷劑。
作為優選技術方案，所述腫瘤細胞選擇性殺傷劑為將上述抗腫瘤多肽分子溶解於ph為7.0的tris緩衝液中。
本發明再一方面提供了由上述具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子在製備腫瘤細胞選擇性殺傷劑中的應用。
作為優選技術方案，所述抗腫瘤多肽分子的濃度≤100μm時，對人體和動物正常細胞不具有毒性；所述抗腫瘤多肽分子的濃度為50-100μm時，對人體腫瘤細胞具有高毒性和殺傷性。
作為優選技術方案，所述人體正常細胞選自人胚腎細胞293e和猴腎成纖維細胞cos7中的至少一種，所述腫瘤細胞選自人宮頸癌細胞hela、人肺癌細胞a549、人肝癌細胞hepg2中的至少一種。
與現有技術相比，本發明的優點和積極效果在於：
1、本發明提供的抗腫瘤多肽分子結構中具有提高與癌細胞特異性結合能力的片段,具有基質金屬蛋白酶響應性的片段，賦予分子疏水性的片段，以及利於分子與細胞相互作用的片段，含有ile-ile-ile片段的疏水性區域與arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg片段連接形成兩親性序列，具有細胞殺傷功能；不同的功能片段通過gly殘基連接，能夠保證這些片段的自由構象和功能發揮。
2、本發明提供的抗腫瘤多肽分子在正常細胞位置保持分子結構的完整性和細胞無毒性，而在腫瘤細胞位置釋放出細胞殺傷性片段，從而實現對腫瘤細胞的選擇性殺傷，具有「智能性」。
3、本發明提供的抗腫瘤多肽分子一方面通過rgd片段即arg-gly-asp片段識別性結合腫瘤細胞表面的整合素，另一方面能夠被腫瘤細胞所過量表達的基質金屬蛋白酶酶解從而釋放出細胞殺傷性片段，而對正常細胞無響應，從而使得該多肽分子具有雙重靶向性殺傷腫瘤細胞的功能。
4、本發明提供的抗腫瘤多肽分子可用於製備腫瘤細胞選擇性殺傷劑，在多肽分子的濃度≤100μm時，對人體以及動物的正常細胞不具有毒性，但是濃度為50-100μm時，對人體腫瘤細胞具有高毒性和殺傷性。
附圖說明
圖1為本發明實施例所提供的不同種類的細胞在抗腫瘤多肽分子rr22存在下培養48h的存活率表徵圖；
圖2(a)為本發明實施例所提供的多肽分子rr22在基質金屬蛋白酶mmp7處理前(上圖)和後(下圖)的質譜結果圖；
圖2(b)為本發明實施例所提供的多肽分子rr22被基質金屬蛋白酶mmp7酶解的理論片段釋放圖；
圖3為本發明實施例所提供的正常細胞和癌細胞在不同多肽分子(a)gr19,(b)lr15存在下培養48h的存活率表徵圖。
具體實施方式
下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
本發明實施例提供了一種具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子,還提供了上述具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子在製備腫瘤細胞選擇性殺傷劑中的應用。
為了更清楚詳細地介紹本發明實施例所提供的具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子，以下將結合具體實施例進行說明。
實施例1
具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子的合成(以合成0.25mmol肽分子為例)
1、材料
(1)稱取負載量為0.318mmol/g的mbha樹脂0.982g，dcm溶脹一夜；
(2)配製濃度為0.2mol/l的下列胺基酸的dmf(二甲基甲醯胺)溶液：
fmoc-ala-oh(n-芴甲氧羰醯基-丙氨酸)：體積11ml，質量0.82g；
fmoc-gly-oh(n-芴甲氧羰醯基-甘氨酸)：體積56ml，質量1.90g；
fmoc-pro-oh(n-芴甲氧羰醯基-脯氨酸)：體積11ml，質量0.74g；
fmoc-ile-oh(n-芴甲氧羰醯基-異亮氨酸)：體積32ml，質量2.26g；
fmoc-lys(boc)-oh(n-芴甲氧羰醯基-n』-叔丁氧羰醯基-賴氨酸)：體積32ml，質量3.00g；
fmoc-arg(pbf)-oh(n-芴甲氧羰醯基-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯並呋喃-5-磺醯-精氨酸)：體積84ml，質量10.92g；
fmoc-leu-oh(n-芴甲氧羰醯基-亮氨酸)：體積21ml，質量1.51g；
fmoc-d-asp-otbu(n-芴甲氧羰基-d-天冬氨酸-1-叔丁酯)：體積1ml，質量0.96g；
配置上述溶液後，充分攪拌溶解，胺基酸用量均以2倍計算，保證充分反應。
(3)配製下列合成試劑：
a)活化劑(0.45mhbtu、0.45mhobt的dmf溶液)：稱取11.44ghbtu和4.07ghobt充分溶解於67mldmf溶液；
b)活化鹼(2mdiea的dmf溶液)：量取11.84ml二異丙基乙胺(diea)和22.17mldmf充分混合；
c)脫保護劑(20％(v/v)哌啶/0.1mhobt的dmf溶液)：量取74.8ml哌啶，稱取5.05ghobt充分溶解於300ml的dmf溶液；
d)蓋帽劑(20％(v/v)乙酸酐、0.125mdiea、0.015mhobt的dmf溶液):量取2.2ml乙酸酐、0.24mldiea，稱取0.0223ghobt，充分溶解於8.8mldmf溶液；
e)裂解劑(體積比tfa:tis:water＝95:2.5:2.5)：量取14.25mltfa，0.375mltis，0.375mlwater充分混合。
(4)利用cem公司的liberty微波多肽合成儀、應用fmoc固相合成法合成多肽，得到尚未裂解的連接有樹脂的多肽粗產品。
(5)反應完成後將反應液轉移到旋蒸瓶內，在35℃條件下真空旋轉蒸發，除去dcm(二氯甲烷)、tfa等殘餘液體。用滴管將旋轉蒸發後的液體逐滴加入7-8倍殘液體積的冰乙醚內，靜置產生沉澱後，用高速冷凍離心機在9000rpm、4℃條件下離心10min，反覆乙醚沉澱，離心5-6次。除去上層清液，保留沉澱，通風櫥內待乙醚揮發完之後，向沉澱中加超純水，超聲搖勻，放入冰箱中預凍1h，再使用凍幹機-60℃冷凍乾燥24h左右，得到純化產品，即兩親性多肽，於-20℃密封保存。
實施例2
具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子的細胞毒性試驗
首先在無菌的96孔板中接種100μl密度為1×105細胞/ml的細胞，置於37℃培養箱中24h，待其貼壁後將孔板中的培養液吸出，向每個孔中加入100μl新鮮培養液和100μl經過過濾的不同濃度的多肽溶液，每個濃度設立4個平行abspeptide，另外用只加tris(三羥甲基氨基甲烷)緩衝液、不加多肽的孔作為對照組abstris，之後將孔板重新置於37℃培養箱中48h，作用完成後，向每個孔中加入20μl濃度為5mg/ml的mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)溶液，培養箱中繼續培養4h，之後將孔板中的液體吸出，在每個孔中加入150μl的二甲基亞碸，並向空白孔中加入等量的二甲基亞碸作為調零孔absblank，然後將孔板置於搖床上震蕩10min使之充分混勻，最後用酶標儀測定570nm處的吸光值。細胞存活率的計算公式為：
細胞存活率＝1-(abstris-abspeptide)/(abstris-absblank)
由圖1可以看出，多肽分子的濃度在100μm以下與細胞共培養48小時，人胚腎細胞293e、猴腎成纖維細胞cos7的存活率都在90％以上，也就是說該多肽分子在濃度100μm以下時對所研究的人體和動物的正常細胞基本沒有毒性；而50μm濃度以上細胞共培養48小時，對人宮頸癌細胞hela、人肺癌細胞a549、人肝癌細胞hepg2有明顯殺傷，存活率降至50％以下，因此，由圖1可知，該肽分子100μm濃度以下對人體癌細胞具有選擇性殺傷能力。
實施例3
酶解試驗
用ph7.0的tris緩衝液配製多肽分子：
ac-arg-gly-asp-gly-pro-leu-gly-leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2(rr22)的溶液，其濃度為100μm，取出部分溶液加入基質金屬蛋白酶mmp7作用，對樣品進行質譜表徵。
結果如圖2所示，圖2(a)的質譜圖和圖2(b)均表明基質金屬蛋白酶mmp7可以成功酶解多肽分子，釋放出兩親性的
leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2(lr15)片段。
實施例4
不同多肽分子的細胞毒性試驗
作為對比控制實驗，合成如下分子：
(a)
ac-gly-pro-leu-gly-leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2(gr19)；
(b)實施例3的lr15；
測試上述三種多肽分子gr19和lr15的細胞毒性，具體實驗方法與實施例2相同，與實施例2的多肽分子
ac-arg-gly-asp-gly-pro-leu-gly-leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2(rr22)進行細胞毒性對比。
結果如圖3所示。上述3個分子對正常細胞和腫瘤細胞都有明顯毒性，而沒有選擇性。其中，gr19不具有細胞選擇性殺傷能力與rr22的細胞選擇性殺傷能力對比，說明rgd片段即arg-gly-asp片段對腫瘤細胞的特異性結合提高了分子的細胞選擇性殺傷能力；lr15的細胞殺傷能力來源於其兩親性結構，與rr22在100μm濃度以下不具有對正常細胞的殺傷能力對比，說明只有在腫瘤細胞環境中，過量表達的mmp7酶酶解rr22分子釋放出lr15片段之後，才激活了分子的細胞殺傷能力，因此，本發明的抗腫瘤多肽分子具有「智能性」和雙重靶向性。