一種小球藻抑菌肽的製備方法

2023-05-31 07:28:21

一種小球藻抑菌肽的製備方法
【專利摘要】本發明提供了一種小球藻抑菌肽的製備方法。本發明以小球藻為原料，利用超低溫冷凍、低溫超高壓連續流細胞破碎結合超聲波處理工藝，對小球藻有效破壁獲得可溶性蛋白質，進而用生物酶法獲得抑菌效果明顯的抑菌肽。由於小球藻具有細胞壁異常堅固，壁內蛋白含量高的特點，發明的技術要點在於超低溫冷凍、低溫超高壓連續流細胞破碎結合超聲波處理工藝對小球藻進行處理，對小球藻有效破壁增加可溶性蛋白質含量，通過合適酶的選取與水解度的控制可以獲得抑菌效果好的抑菌肽。
【專利說明】一種小球藻抑菌肽的製備方法 (一）

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種小球藻抑菌肽的製備方法。 (二）

【背景技術】
[0002] 國外學者在20世紀40年代就開始了對海洋抗菌活性物質的研究，50年前從海 洋生物中發現並成功研製了第一個海洋新抗生素頭孢菌素，開創了開發新海洋抗生 素的先河。自1944年Pratt首次從小球藻（Chlorella)中分離到有抗菌活性的小球藻素 (chlorellin)脂肪酸混合物以來，從藻類提取對人類致病菌有殺滅作用物質的科學研究日 益深化。1962年Starr等發現夏威夷藍藻Lyngbyamajuscula的甲醇提取物具有抗菌活 性。此後Susann研究不同的藍藻，發現其能產生多種抗菌物質，可作為抗生素的重要來源。 1988 年Murakami從甲藻Alexan-driumhiranoi中分離得到goniodominA(60)，具有較強 的抗真菌活性。1988年Richard等研究表明，微藻提取物對革蘭氏陽性菌--枯草芽孢杆 菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用，而對革蘭氏陰性菌-大腸桿菌均無抑制作用。Kellam 等1988年對132種海水微藻和400種淡水微藻的有機溶劑提取物進行抗菌活性篩選，結果 發現其中18種海水微藻及6種淡水微藻具有抗菌活性，表明海水微藻更具開發潛力。1989 年Kellam等又從132種海洋微藻種發現27種具有抗菌活性，且海洋微藻的有機相提取物 對細菌有較強抑制效果，而水相提取物幾乎都沒有抗菌活性。1991年Igarashi等指出藻 類分泌物對對蝦育苗池中細菌有抑制作用。1999年，Naviner等發現硅藻中的中肋骨條藻 Skeletonemacostatum的水相提取液能抑制大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌及一些 海洋細菌的生長。2006年，Herrero等[從杜氏鹽藻中發現了 15種不同的揮發性化合物 (主要是棕櫚酸、a-亞麻酸、油酸等）具有抗菌活性。
[0003] 微藻抗菌物質具體作用機理目前沒有明確定論，認識比較深入的作用機理主要包 括：對菌體細胞結構和功能的破壞；對菌體代謝過程的影響；對菌體核酸等生物合成的幹 擾，而菌體通常不會對宿主產生明顯的毒性。有些微藻中含有毒素成分，如引起赤潮的雙鞭 毛藻產生的石房蛤毒素（Saxitoxin)，其LD5(I為5?10i!g/kg，是一種極強的神經毒素。某 些微藻毒素在適度的微劑量下具有良好的抗腫瘤、抗病毒等活性，同時也可能通過神經系 統的毒性達到抑制微生物的效果，已成為海洋活性物質的研究熱點之一。從海洋藍藻鞘絲 藻Lyngbyamajuscule中提取到的毒素majusculamideC，對骨髓瘤細胞和HIV病毒具有 很強的抑制作用，同時也是一種較好的微生物抑制劑。微藻毒素所產生的抑菌效果應該是 其毒性作用的體現之一，對菌體和宿主均產生明顯抑制或毒性作用，一般不單獨作為抗菌 物質使用。此外還有眾多學者對多種不同種類微藻的抗菌活性進行了篩選，大量的研究表 明，許多微藻含有結構獨特的抗菌物質，其有效成分逐漸被確定，已知的有脂肪酸、其它有 機酸、溴酚、酚類抑制劑、丹寧、類萜、肽類、多糖和其它碳水化合物及酚類，在一種微藻中可 能含有以上幾種不同的抗菌成分，發揮不同的抗菌作用，整體表現出協同抗菌能力，不同種 類的微藻中也可能存在同一種抗菌物質。由於微藻抗菌成分的多樣性，不同藻類對細菌和 真菌的抑制活性也有明顯的差異。
[0004] 國內在微藻抗生素的研究和開發方面起步較晚，20世紀80年代開始有零星報導， 經過20多年的積累，才逐漸成為研究熱點之一。1988年鄭天凌用紙片法、塗布法和液體法 研究了小等鞭金藻Prymnesiumparvum的培養液和細胞抽提物對10株腸道菌或非腸道菌 的抗菌作用，發現對其中8個菌株有抗菌作用。2004年葉錦林等研究了紫球藻提取液及其 多糖溶液抗病原細菌、真菌性能，表明兩者對革蘭氏陽性細菌的抑菌作用較為明顯。2006 年尹鴻萍等對小鼠腹腔注射感染金黃色葡萄球菌，再對其施用鹽藻多糖，結果發現l〇〇mg/ kg和200mg/kg劑量組的鹽藻多糖能顯著增加感染小鼠24h內存活數，表現出一定的抗菌能 力。2007年，王芹等對22種微藻的藻粉萃取液進行了抗菌實驗，發現不同提取溶劑對抗菌 活性有一定影響，但提取液對革蘭氏陽性菌和陰性菌生長的抑制作用並無明顯差別。2010 年張學超等研究表明等鞭金藻、三角褐指藻、扁藻的水溶性物質及脂溶性物質對鰻弧菌有 抑制作用，等鞭金藻、三角褐指藻的水溶性物質及等鞭金藻、三角褐指藻、扁藻的脂溶性物 質對假單胞菌有抑制作用。但目前國內的工作與國外研究相比，尚缺乏深度，存在一些亟需 解決的問題。
[0005] 食品工業發展的關鍵問題之一就是食品的保鮮防腐問題。據統計，全世界每年約 有10%-20%的食品損失於各種腐敗，其中主要是由微生物造成的腐敗。而防腐劑與有害微 生物指標超過國家標準的食品也屢見不鮮，防腐劑的安全性問題越來越受到人們的重視。 因此，開發廣譜抑菌、高效、無毒的天然防腐劑是食品工業發展的必然趨勢。近年來，天然抑 菌物質的研究報告很多，其中抑菌效果好的植物可以作為抑菌物質的潛在替代源，從而具 有了研究的應用價值和經濟價值。
[0006] 自然界中微藻有3萬多種，但目前被人類利用開發的只有十餘種。小球藻 (ChlorellapyrenoidosaFACHB5)是一類普生性單細胞藻類。小球藻具有生態分布廣、可 快速生長和繁殖、易於培養等優點，是地球上動植物中唯一能在20h增長4倍的生物，具有 很高的應用價值。以小球藻酶水解抑菌肽作為天然防腐劑用於食品中來達到抑菌的目的， 不但在食品加工業將有廣闊的應用前景，並且在環境保護等方面做出了一定貢獻。 (三）
【發明內容】

[0007] 本發明目的是提供一種以小球藻為原料，利用超低溫冷凍、高壓蒸煮結合超聲波 處理工藝，對小球藻有效破壁，以增加其可溶性蛋白質含量，並進一步採用不同蛋白酶對獲 得的蛋白質進行酶解，獲得抑菌效果明顯的抑菌肽。
[0008] 本發明採用的技術方案是：
[0009] -種小球藻抑菌肽的製備方法，所述方法包括：
[0010] (1)小球藻蛋白質的預處理：取小球藻粉，加入適量水混合均勻，在-50?-40°c下 冷凍2?3h後，室溫下融化，補加水至料液比為1 (g) :20?40 (mL)，放入超聲波萃取儀 中，在20?30°C、20?30KHz下超聲波處理10?20min後，再採用低溫超高壓連續流細胞 破碎儀，在4?6°C、180?200Mpa壓力下處理5?8min後，在40?60°C、20?30KHz下 超聲提取2?3小時，提取後離心（10000r/min，離心20min)，得到上清液1和濾渣1 ;
[0011] (2)濾渣1按步驟（1)方法重複提取3次，依次得到上清液2、上清液3和上清液 4,合併上清液1?4,得到小球藻提取液；
[0012] (3)將小球藻提取液濃縮，加入足量80?95%乙醇溶液，在-4°C條件下靜置12? 24h，離心，取沉澱物，用水溶解後濃縮，冷凍乾燥得小球藻蛋白；
[0013] (4)取小球藻蛋白，加入至酶解緩衝液中至其質量濃度為5?10%，胰蛋白酶添加 為1000?2000U/mL，在pH8. 0、37°C下進行酶解反應40?60min後，結束酶解反應，酶解液 經聚碸膜進行膜過濾，
[0014] 收集分子量在1?20kD的濃縮液，得到所述小球藻抑菌肽。所述，
[0015] 酶解緩衝液為常規適用於胰蛋白酶酶解反應的緩衝液。
[0016] 具體的，步驟（3)酶解緩衝液為20mM、pH8. 0的Tris-HCl緩衝液，配製方法是分 別配製Tris與HC1溶液，再按比例混合兩種溶液，配製方法如下：分別配製0.lmol/LTris 水溶液(稱取1.214gTris，定容1000mL)與0.lmol/LHC1溶液(量取860uL濃鹽酸，定容 1000mL)，再取 100mL的 0.lmol/LTris與 58. 4mL的 0.lmol/L稀HC1，混勻定容至 500mL， 即得 20mM，pH8. 0 的Tris-HCl緩衝液。
[0017] 本發明以小球藻為原料，利用超低溫冷凍、低溫超高壓連續流細胞破碎結合超聲 波處理工藝，對小球藻有效破壁獲得可溶性蛋白質，進而用生物酶法獲得抑菌效果明顯的 抑菌肽。由於小球藻具有細胞壁異常堅固，壁內蛋白含量高的特點，發明的技術要點在於超 低溫冷凍、低溫超高壓連續流細胞破碎結合超聲波處理工藝對小球藻進行處理，對小球藻 有效破壁增加可溶性蛋白質含量，通過合適酶的選取與水解度的控制可以獲得抑菌效果好 的抑菌肽。
[0018] 與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在：
[0019] (1)針對小球藻細胞壁異常堅固的特點，首先通過一種比較溫和的破壁方式，可 以避免高溫對原料所造成的營養損失等不良影響，也是使細胞破裂較為徹底的方法，即先 在-50°c冷凍、再在室溫緩慢融化的超低溫冷凍的方法，使小球藻異常堅固的細胞壁變得松 脆。再利用超聲波產生的空化作用、機械作用加速細胞壁的破碎，促進胞內物質的溶出。在 此基礎上，進一步採用低溫超高壓連續流細胞破碎法，利用超高壓能量使樣品通過狹縫瞬 間釋放，在剪切效應、空穴效應、碰撞效應的作用下使細胞破碎，使物質均質、分散、乳化、顆 粒納米化。細胞破碎全過程在4°C?6°C的低溫循環水浴中進行，保持原有物質活性和性 能。小球藻經上述預處理後，採用超聲波法進行工藝優化，整個工藝過程完全是單純的物理 方法使小球藻有效破壁，具有能耗低、效率高、不破壞有效成分等優點，獲得的小球藻可溶 性蛋白營養、安全、無汙染。
[0020] (2)本發明所得產品純度高，其中蛋白質含量可高達60%以上，比傳統的熱水浸提 得到的蛋白質提高了 7. 47倍，比單獨超低溫冷凍後浸提得到的蛋白質提高了 4. 84倍，t匕 單獨超聲浸提得到的蛋白質提高了 5. 69倍，比超低溫冷凍結合超聲波處理浸提得到的蛋 白質提高了 2. 60倍，比超低溫冷凍、超高壓結合超聲波處理浸提得到的蛋白質提高了 1. 15 倍；工藝條件溫和，綠色環保，符合保健食品的生產要求。
[0021] (3)本發明對製備的小球藻蛋白質，採用溫和的生物酶法，即胰蛋白酶進行酶解， 當酶解時間為40min時，小球藻蛋白質酶解原液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制率均 可達到100%，遠遠優於酶解前的10%和11%的抑菌率。
[0022] (4)本發明所獲得的抑菌肽來自天然小球藻材料，原料易得成本低，安全無毒。 (四）【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為蛋白質標準曲線；
[0024] 圖2為提取溫度對小球藻蛋白質提取率的影響；
[0025] 圖3為液料比對小球藻蛋白質提取率的影響；
[0026] 圖4為提取時間對小球藻蛋白質提取率的影響。 (五）【具體實施方式】
[0027] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於 此：
[0028] 實施例1 :
[0029] 1.小球藻蛋白的提取工藝優化研究
[0030] 1. 1材料與試劑
[0031] 小球藻乾粉，來自浙江省杭州華丹農產品有限公司；Bio-RadProteinAssay 試劑盒，購自Bio-RadLaboratoriesInc;硫酸銅，硫酸鉀，硫酸，硼酸，甲基紅指示劑 (C15H15N302)，溴甲酚綠指示劑（C21H14Br405S)，亞甲基藍指示劑（C16H18C1N3S? 3H20 )，氫氧化鈉， 95%乙醇，硼酸溶液（20g/L)，混合指示液（2份甲基紅乙醇溶液與1份亞甲基藍乙醇溶液臨 用時混合)。
[0032] 1. 2實驗儀器
[0033] 酶聯免疫檢測儀（Model-550)，美國Bio-Rad公司JN-02C低溫超高壓連續流細胞 破碎機，廣州聚能生物科技有限公司；高速冷凍離心機（5415R)，德國Eppendorf公司；電子 天平（BS224S);凱氏定氮儀（KDY-9820 )AL04型電子天平、HH-2型水浴鍋、DHG-9240A型鼓 風乾燥箱、DL-5M離心機(配更換轉頭)、SANYO超低溫冰箱。
[0034] 1. 3實驗方法
[0035] 1. 3. 1小球藻中蛋白質總量測定。採用凱氏定氮法（GB5009. 5-2010)。
[0036] 1. 3. 2提取液中蛋白含量測定
[0037] 採用Bio-RadProteinAssay法，按試劑盒說明操作，每個樣本設3個平行孔。 同時以標準牛血清蛋白的質量濃度（分別為0? 05mg/mL，0.lmg/mL，0. 2mg/mL，0. 3mg/mL, 0. 4mg/mL，0. 5mg/mL)為橫坐標，0D595值為縱坐標繪製標準曲線，作為定量的依據。
[0038] 1. 3. 3小球藻蛋白質的預處理及提取率
[0039] 取小球藻粉40g，加200mL水混合均勻，在_50°C超低溫冷凍3h後，室溫下融化，補 水至1000mL，放入超聲波萃取儀中，在20°C，30KHz下超聲波處理10min，再採用低溫超高壓 連續流細胞破碎儀，在180Mpa壓力下處理6min後，再次採用超聲波技術提取小球藻蛋白 質，超聲波功率設定在30KHz，提取時間、溫度與料液比按下述1. 3. 4的提取工藝試驗，每次 提取後離心（l〇〇〇〇r/min，離心20min)，取濾渣按1. 3. 4的提取工藝條件循環提取3次，合 並4次上清液。蛋白質提取率按下式計算：
[0040]

【權利要求】
1. 一種小球藻抑菌肽的製備方法，所述方法包括： (1) 取小球藻粉，加入適量水混合均勻，在-50?-40°C下冷凍2?3h後，室溫下融化， 補加水至料液比為1 :20?40,放入超聲波萃取儀中，在20?30°C、20?30KHz下超聲波 處理10?20min後，再採用低溫超高壓連續流細胞破碎儀，在4?6°C、180?200Mpa壓力 下處理5?8min後，在40?60°C、20?30KHz下超聲提取2?3小時，提取後離心，得到 上清液1和濾渣1 ; (2) 濾渣1按步驟（1)方法重複提取3次，依次得到上清液2、上清液3和上清液4,合 並上清液1?4,得到小球藻提取液； (3) 將小球藻提取液濃縮，加入足量80?95%乙醇溶液，在-4°C條件下靜置12?24h， 離心，取沉澱物，用水溶解後濃縮，冷凍乾燥得小球藻蛋白； (4) 取小球藻蛋白，加入酶解緩衝液中至其質量濃度為5?10%，胰蛋白酶添加為 1000?2000U/mL，在pH8. 0、37°C下進行酶解反應40?60min後，結束酶解反應，酶解液經 聚碸膜進行膜過濾，收集分子量在1?20kD的濃縮液，得到所述小球藻抑菌肽。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟（3 )酶解緩衝液為2 OmM、pH8. 0的 Tris-HCl緩衝液。
【文檔編號】C12P21/06GK104342472SQ201310320983
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月26日 優先權日:2013年7月26日
【發明者】張擁軍, 張高帆, 唐王裔, 孫佳悅, 唐旋, 陳麗莎, 朱麗雲 申請人:中國計量學院