南方紅豆杉ssr-pcr反應體系及其應用的製作方法

2023-05-31 02:13:56

南方紅豆杉ssr-pcr反應體系及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明建立並優化了南方紅豆杉SSR-PCR反應體系。通過對南方紅豆杉SSR-PCR反應體系的影響因素（引物、dNTP、Taq?DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA）在多個水平上進行優化試驗，篩選出各反應因素的最佳水平，建立了南方紅豆杉SSR-PCR?20μL最佳反應體系：引物2μM、dNTP?40μM、Taq?DNA聚合酶1U、Mg2+1.0mM和模板DNA?75ng。該體系的建立能很好地滿足南方紅豆杉基因組DNA擴增要求，並為南方紅豆杉的SSR分子標記及遺傳多態性分析奠定了一定基礎。
【專利說明】南方紅豆杉SSR-PCR反應體系及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學領域，具體地說，涉及南方紅豆杉SSR-PCR反應體系及其 應用。

【背景技術】
[0002] 南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei )為裸子植物亞門（Cymmospermai ) 松杉綱（Coniferopside)紅?杉目（Taxales)紅?杉科（Taxaceae S. F. Gery)紅?杉屬 (Taxus Linn.)植物，是中國紅豆杉屬植物中分布最為廣泛的一個種，自然分布於亞熱帶各 省區。紅豆杉樹皮中因含有抗癌藥物成分紫杉醇導致其被大量砍伐或破壞，現已處於瀕危 狀態，在1999年我國國務院公布的《國家重點保護植物名錄(第一批)》中被列為國家一級 保護植物。南方紅豆杉材質優異，是高檔珍貴用材，其紫杉醇含量雖稍低於喜馬拉雅紅豆杉 等，但因早期速生、生物收穫量大，適宜短周期作業而具有巨大的藥用開發利用價值。
[0003] SSR (簡單重複序列，又稱微衛星DNA，Simple Sequence Repeats或 Microsatellite DNAs)標記是近年來發展起來的一種以特異引物PCR為基礎的分子標記 技術。與其它分子標記相比，以微衛星序列為基礎的SSR標記在鑑定上顯示了獨特的優越 性：SSR標記數量豐富，覆蓋整個基因組，揭示的多態性高；具有復等位基因的特性，提供的 信息量高；以孟德爾方式遺傳，呈共顯性；每個位點由設計的引物序列決定，便於不同實驗 室相互交流合作開發引物，獲得的資料能夠在不同的實驗室重複並共享；且操作簡便、穩定 性、重複性好。已成為目前應用最廣泛的第二代共顯性分子遺傳標記。
[0004] 因此，建立一個穩定可靠、重複性好的南方紅豆杉SSR-PCR反應體系，為進一步研 究南方紅豆杉遺傳多樣性及地理變化、種源遺傳分化等具有十分重要的意義。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供優化的南方紅豆杉SSR-PCR反應體系及其應用。
[0006] 為了實現本發明目的，本發明的南方紅豆杉SSR-PCR反應體系，所述反應體系總 體積20uL，其中，上、下遊引物各2μΜ、dNTP 40yM、Taq DNA聚合酶lU、Mg2+1.0mM和模板 DNA 75ng，以 ddH20 配製。
[0007] 其中，上遊引物 F :5 ' -TGCGGAGTCATGTACAACTTAA-3 ';下遊引物 R : 5 ^ -CCCTTGCTTTGTACCATATGTGA-3 ^。
[0008] PCR 擴增程序為：94°C 5min ;94°C 45s，56°C 45s，72°C 45s，35 個循環；60°C 30min〇
[0009] 其中，模板DNA的提取包括以下步驟：
[0010] (1)取-7(TC保存的南方紅豆杉嫩葉0· 5?lg，放入經液氮預冷的研缽中，加入液 氮研磨成粉末；
[0011] (2)將粉末快速轉移到2mL離心管中，加入lmL 65°C預熱的CTAB提取液，充分混 勻，65°C水浴30?45min。其間不時搖動離心管使之混勻；
[0012] (3)取出離心管，4°C 12000rpm離心lOmin，取上清到新離心管中；
[0013] (4)加入等體積的Tris平衡酚/氯仿/異戊醇（即Tris平衡酚、氯仿和異戊醇混 合液，其中，Tris平衡酚、氯仿和異戊醇的體積比為25 :24 :1)輕輕地顛倒混勻，放置lOmin， 4°C 12000rpm 離心 lOmin;
[0014] (5)重複步驟（4);
[0015] (6)吸上清到新離心管中，加入2-3倍體積的_20°C預冷無水乙醇和1/10體積醋 酸鈉，混勻，_20°C放置30min以上，沉澱DNA ;
[0016] (7)4°C 12000rpm離心10min，70%乙醇洗滌沉澱兩次，自然風乾，加入300-500yL 去離子水和2 μ L RNase溶解DNA，並於37°C水浴30min-lh ;
[0017] (8)溶解後的DNA再用氯仿/異戊醇（即氯仿和異戊醇的混合液，二者體積比為24: 1)抽提一次；
[0018] (9)沉澱用70%乙醇洗滌沉澱兩次，然後自然風乾後加入50 μ L去離子水；
[0019] (10) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及完整性，_20°C保存。
[0020] 本發明還提供所述SSR-PCR反應體系在南方紅豆杉SSR分子標記及輔助育種中的 應用。
[0021] 本發明建立並優化了南方紅豆杉SSR-PCR反應體系。通過對南方紅豆杉SSR-PCR 反應體系的影響因素（引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA)在多個水平上進行優化 試驗，篩選出各反應因素的最佳水平，建立了南方紅豆杉SSR-PCR 20 μ L最佳反應體系：弓丨 物2 μ M、dNTP 40 μ M、Taq DNA聚合酶lU、Mg2+l. OmM和模板DNA75ng。該體系的建立能很好 地滿足南方紅豆杉基因組DNA擴增要求，並為南方紅豆杉的SSR分子標記及遺傳多態性分 析奠定了一定基礎。
[0022] 通過建立一個穩定可靠、重複性好的南方紅豆杉SSR-PCR反應體系，為進一步研 究南方紅豆杉遺傳多樣性及地理變化、種源遺傳分化等奠定基礎，為開展植物分子輔助育 種、遺傳轉化及其轉基因等方面的研究提供有價值的理論依據，從而為科學制定南方紅豆 杉遺傳保育策略及種質資源利用提供分子遺傳學數據。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為本發明提取樣品的總DNA檢測結果；其中，Μ為DL15000DNA Marker :從上 到下分別為 15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp，1-93 泳道為樣本。
[0024] 圖2為本發明引物濃度對SSR-PCR擴增結果的影響；其中，Μ為DNA Marker，1? 5 引物濃度分別為 1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5μΜ。
[0025] 圖3為本發明dNTPs濃度對SSR-PCR擴增結果的影響；其中，Μ為DNA Marker，l? 5dNTPs 濃度分別為 10、20、30、40、50 μ Μ。
[0026] 圖4為本發明Taq DNA聚合酶濃度對SSR-PCR擴增結果；其中，Μ為DNA Marker， 1 ?5Taq DNA 聚合酶濃度分別為 0· 1、0· 25、0· 5、0· 75、L OU。
[0027] 圖5為本發明對SSR-PCR擴增結果的影響；其中，Μ為DNAMarker，1?5Mg2+濃度 分別為 〇· 5、1· 0、1· 5、2· 0、2· 5U。
[0028] 圖6為本發明模板DNA濃度對SSR-PCR擴增結果的影響；其中，Μ為DNA Marker， 1?5模板DNA濃度分別為65、70、75、80、85ng。
[0029] 圖7為本發明SSR-PCR引物對南方紅豆杉的個體擴增結果。

【具體實施方式】
[0030] 以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例 均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，或按照製造廠商說明書建議的條件。
[0031] 實施例南方紅豆杉SSR-PCR反應體系的優化
[0032] 1材料與方法
[0033] 1. 1樣品材料
[0034] 由中國林業科學研究院林業研究所邱德有教授提供的南方紅豆杉作為優化實驗 材料。
[0035] 1. 2基因組DNA的提取
[0036] 用改良CTAB法提取基因組DNA。提取的總DNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及 完整性，結果如圖1所述。核酸蛋白分析儀Nanodrop 8000測定結果顯示，A260/A280值位 於1. 7-1. 9之間。結果表明，用改良的CTAB方法提取，能夠得到高質量的DNA，可直接用於 SSR-PCR 反應。
[0037] 其中，模板DNA的提取包括以下步驟：
[0038] (1)取_70°C保存的南方紅豆杉嫩葉0. 5?lg，放入經液氮預冷的研缽中，加入液 氮研磨成粉末；
[0039] (2)將粉末快速轉移到2mL離心管中，加入lmL 65°C預熱的CTAB提取液，充分混 勻，65°C水浴30?45min。其間不時搖動離心管使之混勻；
[0040] (3)取出離心管，4°C 12000rpm離心10min，取上清到新離心管中；
[0041] (4)加入等體積的Tris平衡酚/氯仿/異戊醇(體積比25 :24 :1)輕輕地顛倒混 勻，放置 l〇min，4°C 12000rpm 離心 10min;
[0042] (5)重複步驟（4);
[0043] (6)吸上清到新離心管中，加入2-3倍體積的_20°C預冷無水乙醇和1/10體積醋 酸鈉，混勻，_20°C放置30min以上，沉澱DNA ;
[0044] (7)4°C 12000rpm離心10min，70%乙醇洗滌沉澱兩次，自然風乾，加入300-500yL 去離子水和2 μ L RNase溶解DNA，並於37°C水浴30min-lh ;
[0045] (8 )溶解後的DNA再用氯仿/異戊醇(體積比24 :1)抽提一次；
[0046] (9)沉澱用70%乙醇洗滌沉澱兩次，然後自然風乾後加入50 μ L去離子水；
[0047] (10) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及完整性，_20°C保存。
[0048] 1.3 SSR-PCR 程序
[0049] PCR反應在GeneAmp 9600 PCR儀上進行。PCR反應擴增程序：94°C預變性5min， 94°C變性45s，56°C復性45s，72°C延伸45s，進行35個循環，最後60°C延伸30min。
[0050] 1.4 SSR-PCR 體系
[0051] 為得到擴增穩定可靠、重複性好的SSR-PCR反應體系，對影響PCR的5個主要因 素(模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP和引物）分別進行了單因子多水平的優化實驗。 SSR-PCR反應的主要因素水平見表1。
[0052] 表1 SRAP-PCR反應的因素與水平
[0053]

【權利要求】
1. 南方紅豆杉SSR-PCR反應體系，其特徵在於，所述反應體系總體積20uL，其中，上、 下遊引物各 2 μ M、dNTP 40 μ M、Taq DNA 聚合酶 lU、Mg2+l. OmM 和模板 DNA 75ng，以 ddH20 配 制； 其中，上遊引物 F:5 ' -TGCGGAGTCATGTACAACTTAA-3 ';下遊引物 R: 5' -CCCTTGCTTTGTACCATATGTGA-3'。
2. 根據權利要求1所述的SSR-PCR反應體系，其特徵在於，PCR擴增程序為：94°C 51^11;941：458,561：458,721：458,35個循環；6〇1：3〇11^11。
3. 根據權利要求1或2所述的SSR-PCR反應體系，其特徵在於，模板DNA的提取包括以 下步驟： (1) 取-70°C保存的南方紅豆杉嫩葉0. 5?lg，放入經液氮預冷的研缽中，加入液氮研 磨成粉末； (2) 將粉末快速轉移到2mL離心管中，加入lmL 65°C預熱的CTAB提取液，充分混勻， 65°C水浴30?45min。其間不時搖動離心管使之混勻； (3) 取出離心管，4°C 12000rpm離心lOmin，取上清到新離心管中； (4) 加入等體積的Tris平衡酚/氯仿/異戊醇輕輕地顛倒混勻，放置10min，4°C 12000rpm離心lOmin ;其中，Tris平衡酚、氯仿、異戊醇的體積比為25 :24 :1 ; (5) 重複步驟（4); (6) 吸上清到新離心管中，加入2-3倍體積的-20°C預冷無水乙醇和1/10體積醋酸鈉， 混勻，-20°C放置30min以上，沉澱DNA ; (7) 4°C 12000rpm離心10min，70%乙醇洗滌沉澱兩次，自然風乾，加入300-500yL去 離子水和2 μ L RNase溶解DNA，並於37°C水浴30min-lh ; (8) 溶解後的DNA再用氯仿/異戊醇抽提一次；其中，氯仿、異戊醇的體積比為24 :1 ; (9) 沉澱用70%乙醇洗滌沉澱兩次，然後自然風乾後加入50 μ L去離子水； (10) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及完整性，-20°C保存。
4. 權利要求1-3任一項所述SSR-PCR反應體系在南方紅豆杉SSR分子標記及輔助育種 中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104099319SQ201310117573
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月7日 優先權日:2013年4月7日
【發明者】付偉, 任鶴, 朱振營, 黃新 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院