改進的腦膜炎雙球菌多糖結合菌苗的製作方法

2023-05-31 02:26:16

專利名稱：改進的腦膜炎雙球菌多糖結合菌苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及化學改性的腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)B血清群多糖。本發明也提供多種菌苗，在該苗中相應改性的多糖與蛋白質載體結合。
由腦膜炎雙球菌B血清群和大腸桿菌(E.coli)K1引起的腦膜炎仍是世界上主要的健康問題。B型腦膜炎發生於地方性和流行性，並約佔全部記錄的腦膜炎雙球菌腦膜炎病例的一半，而K1-陽性大腸桿菌是新生兒腦膜炎的主要起因。現在尚無商業性的抗由腦膜炎雙球菌B血清群和大腸桿菌K1引起的疾病菌苗。在很大程度上這是由於這樣一個事實，即腦膜炎雙球菌B血清群多糖(GBMP)在人體中僅產生很微弱的免疫。近來有某些報導基於GBMP與外膜蛋白質形成複合體的選擇菌苗，然而迄今還沒有這些菌苗對人體有效的明顯證據。
近來，發展了基於含成化學改性的(N-丙醯化的)B血清群多糖-蛋白質(N-Pr-GBMP-蛋白質)結合物菌苗的新概念。該菌苗在鼠中誘導IgG抗體的高滴度。該抗體不僅是預防性的，而且同未改性的GBMP(即-N-乙醯基-GBMP)交叉反應。這一概念已公開在美國專利NO.4727136中並要求保護(1988年2月23日授權與Harold J.Jennings等人)。
已經指出，例如在美國專利NO.4727136中公開的增加交叉反應抗體的菌苗只是在犧牲極限免疫耐受性時才是有成效的。這種假設被一般抗原決定簇證實是含理的，該抗原決定簇由天然N-Ac-GBMP和人及動物組織中的α-(2-8)-連接的唾液酸殘基(最少需要10個殘基)鏈組成(Jennings，Contrib.Microbiol.Immunol.Basel，Karger，1989，Vol.10，151-165)。這些聚唾液基(polysialosyl)鏈的功能作為製備抗原並且大部分在胚胎中性細胞粘連方面與胚胎階段有關(Finne et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1983，112，482)。在出生後的成長過程中，這種抗原是向下降調節(Friedlander et al，J.Cell Biol.1985，101，412)，但它在成年人在患病肌肉再生期間(Cashman at el，Ann.Neuron.，1987，21，481)在腫瘤細胞(Roth et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，1988，85，299)以及在天然K細胞(NK)和CD3+T細胞(Husmann et al，Eur.J.Immunol.，1989，19，1761)中表現出來。儘管至今對這些胎兒抗原的極限碉受性尚未形成結論，但通常認為，由於這種交叉反應，一些許可機構對N-Pr-GBMP-蛋白質結合物要進行仔細研究，因為在它被批准商品出售之前需做證明該菌苗安全性的複雜實驗，結果導致相當大的花費並延誤時間。
本發明的一個目的是開發一種具有免疫特性的菌苗，其免疫特性強於N-Pr-GBMP蛋白質。本發明的另一目的是提供一種顯示與GBMP交叉反應實質降低的菌苗。
本發明的一個方面，是提供具有唾液酸殘基N-乙醯基(C2)被C4-C8醯基取代的改性腦膜炎雙球菌B血清群多糖。
本發明的另一方面，是提供一種抗原結合物，該結合物含有結合到合適的免疫蛋白質上的N-C4-C8醯基多糖，並具有增強的致免疫性及誘導實質上降低的交叉反應抗體。
本發明的又一方面，是提供一種菌苗，該菌苗含有與合適載體或稀釋劑結合的N-C4-C8醯基多糖-蛋白質結合物。本發明的菌苗也可含有對人體適用的治療有效量的輔助劑，例如磷酸鋁或氫氧化鋁。
本發明的再一方面，是提供一種哺乳動物抗腦膜炎雙球菌和大腸桿菌K1感染的免疫方法，該方法包括將免疫有效量的本發明菌苗通過腸胃外給藥於受到這種感染的哺乳動物，包括人。該菌苗的典型給藥量為每千克體重約1-50微克，例如每千克體重5-25微克。
另一方面，本發明提供了能夠預防由腦膜炎雙球菌B血清群和大腸桿菌K1引起的腦膜炎的γ-球蛋白餾分。該γ-球蛋白餾分通過用本發明的菌苗免疫哺乳動物而產生。然後將該γ-球蛋白餾分給藥於一個個體，以提供預防或治療由上述微生物正在引起的感染。由此可認為，本發明的免疫菌苗結合物由於它的良好致免疫性及最低誘導GBMP交叉反應抗體，它可作為治療抗血清的來源。本發明的結合物也可用於增加單克隆抗體，並有可能用於抗遺傳型抗體。
在我們的最近實驗中已發現，由上述的Jennings等人的美國專利4727136中公開的N-Pr-GBMP-蛋白質結合物誘導的大多數殺菌和預防抗體與GBMP交叉反應抗體無關。實際上，大多數預防活性包含在與GBMP不交叉反應的N-Pr-GBMP特殊抗體種群中。根據這一點，可認為N-Pr-GBMP在腦膜炎雙球菌B血清群表面複製一種獨有的殺菌抗原決定簇。
本發明是以能夠含成化學改性的GBMP′s這一發現為基礎，該GBMP複製殺菌抗原決定簇，並且在其結合形式上，它不僅顯示增強的致免疫性，而且也基本上免避同GBMP交叉反應的抗體誘導。
為實現本發明，一系列不同的化學改性的GBMP′s已分別被含成並與蛋白質結合，隨後將結合物注射入鼠中，並與由N-Pr-GBMP-蛋白質結合物產生的效果相比較。意想不到的是，已經發現N-C4-C8醯基GBMP蛋白質結合物基本上複製殺菌抗原決定簇，並可以基本上降低交叉反應抗體的誘導，這種結合物的例子如正丁醯基、異丁醯基、正戊醯基、異戊醯基、新戊醯基、己醯基、庚醯基和辛醯基以及特別是N-丁醯基(N-Bu)GBMP-蛋白質結合物。
利用現有技術中公知的方法從腦膜炎雙球菌中分離出腦膜炎雙球菌B血清群多糖。結合上述方法，腦膜炎雙球菌B血清群(株9818B)於37℃在發酵桶中生長，生長時用每升蒸餾水中含30克脫水Todd Hewitt Broth(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)。在發酵桶中生長之前，該凍幹株在37℃的蠟罐中於5%(V/V)Sheeps′Blood Agar(Difco Laboratories，Dotroit，Michigan)平皿上初始生長。然後將細菌轉移至盛在Erlenmyer曲頸瓶中的1.0升Todd Hewitt Broth(如上述)中，以190轉/分的速度在37℃下搖動該曲頸瓶7小時。然後將該接種物轉移到發酵桶中。在發酵桶中生長(16小時)後，通過添加福馬林使最終濃度達到0.75%而殺死細菌。細菌通過連續離心分離出，並且除了蛋白質通過攪拌含90%冷的(4℃)而不是熱的(50-60℃)的苯酚的原多糖溶液進引提取的以外，基本上按照Bundle等人在J.Biol.Chem.，249，4797-4801(1974)中所述進行純化。該後一種處理過程保證產生高分子量形式的GBNP。
大腸桿菌(018K1H7)(NRCC 4283)於37℃的發酵桶中在含有脫水Brain Heart Infusion(BHI;37克/升)(Difco Laboratiories，Detroit，Michigan)的蒸餾水中生長。在發酵桶中生長之前，該凍幹株在Erlenmeyer曲頸瓶中的50ml BHI溶液(與上述相同)中生長，在37℃下以200轉/分的速度搖動曲頸瓶7小時。然後這種生長轉移到1.5升BHI(如上述)中並在如上述相同條件下生長7小時。然後將接種物轉移到發酵桶中。
分離和純化大腸桿菌K1囊多糖所用的工藝過程與上述分離腦膜炎雙球菌B血清群多糖工藝過程完全一樣。
應指出的是，有關上述的分離和純化工藝過程並不是唯一可使用的，而其他公開的工藝過程也是適用的，例如Watson等人在J.Immunol.，81，331(1958)中描述的和在上述美國專利4727136中公開的那些工藝過程。
天然多糖進行N-脫去乙醯基，以在分子的唾液酸殘基部分形成一個反應胺基。用任何已知的方法可發生N-脫乙醯作用，例如在增高溫度(如約90-110℃)和pH值約為13-14的鹼性水培養基中。合適的鹼性水培養基是鹼金屬氫氧化物水滌液，例如約2M濃度的氫氧化鈉。另外，肼的水溶液也可使用。N-脫乙醯作用程度可以從約30%至100%變化，這取於具體條件。優選的是達到約90-100% N-脫乙醯作用。N-脫去乙醯基產物可通過例如冷卻、中和來回收，如需要可純化，並凍幹。
在進行N-脫乙醯作用之前，天然多糖具有約500000-800000道爾頓範圍的平均分子量。由於N-脫乙醯作用的結果，產生具有平均分子量在約10000-50000道爾頓範圍的多糖片段。
N-脫去乙醯基的多糖片段然後再N-醯化，以產生相應的N-醯化產物。N-醯化作用可通過下述步驟實現，即將N-脫去乙醯基的多糖溶解在pH為7.5-9.0的水培養基中，繼之加入合適的醯基酐，醯基酐可選擇地與乙醇一起加入，以增加溶解度，並冷卻到10℃以下，一直到反應完成為止。如果需要，反應培養基可以純化，如通過滲析，然後回收N-醯化產物，典型的是通過凍幹。反應在約10-20小時內基本完成。用分析技術，典型的是用1Hnmr(核磁共振)測定N-醯化作用程度，該作用程度至少為90%，並可能接近100%。N-醯化作用並不導致片段分子量任何明顯降低。
根據本發明，為了結合作用的效果，優選具有平均分子量相當於約30-200個唾液酸殘基的N-醯化物質。這一般通過使用Ultrag el(商標)AcA44(顆粒直徑60-140μm)柱，用PBS作洗脫液對N-醯化的GBMP進行凝膠過濾而得到。另外，也可使用合適尺寸的膜。
本發明使用平均分子量為10000-40000道爾頓，例如10000-15000道爾頓的N-醯化物質。這可通過收集含有上述平均分子量範圍的N-醯化的GBMP物質的柱洗脫液餾分而得到。根據本發明，高平均分子量的，例如在30000-40000道爾頓範圍的N-醯化物質也是適用的。
本發明的菌苗通過將N-醯化的多糖同一種合適的免疫載體蛋白質結合而產生。最好，載體蛋白質本身是免疫原。合適的載體蛋白質例子是破傷風類毒素、白喉類毒素、交叉反應物質(CRMs)，最好是CRM197(從Sclavo Ltd.，Siena，Italy獲得)，以及細菌蛋白質載體，如腦膜炎雙球菌外膜蛋白質類。
可以作用任何一種結合作用方式使改性的多糖片段與載體蛋白質結合。優選的方法是在美國專利4356170中公開的方法，即將末端醛基團(藉助順式-連位羥基基團的氧化作用)引入N-醯化的多糖，並通過還原性胺化作用使醛基團與蛋白質氨基團偶合。因此，多糖和蛋白質通過-CH2-NH-蛋白質鍵而連接。
然而應當說明的是，本發明的結合菌苗並不限於通過還原性胺化作用而產生的那些。因此，也可按照Schneerson，R.等人在b型流感嗜血桿菌多糖-蛋白質結合物的製備、特性和致免疫性(J.Exp.Med.，1952，361-476(1980))中的描述和美國專利4644059(授與Lance K.Gordon)的描述，用已二醯肼間隔基將N-醯化的多糖與載體蛋白質結合來生產菌苗。另外，也可用Merck發展的二元間隔基技術(按照Marburg，s.，等人在「Biomolecular Chemistry of Macrom oleculesSynthesis of Bacteial Polysaccharide Conjugates With Neisseria Meningitidis Membrane Protein」，J.Am.Chem.Soc.，108，5282-5287(1986)中的描述)，或者可能用還原末端方法(參閱授與Anderson的美國專利4673574)。
所得到的N-醯化的多糖-蛋白質結合物不具有有效交聯，並且在水溶液中是可溶的。對菌苗的使用來說，這使及本發明的結合物成為良好的選擇對象。
所得到的本發明的N-醯化的多糖-蛋白質結合物已在鼠中做過體外試驗，結果普遍表明，與N-丙醯化的多糖相比，它具有改進的免疫性能。另外，觀察到基本上降低形成交叉反應抗體。根據這一點，可以相信本發明的菌苗可用於抵抗由腦膜炎雙球菌B血清群或大腸桿菌K1引起的腦膜炎。特別感興趣的是，該菌苗可預防人的嬰幼兒最易感染的細菌腦膜炎。
本發明的菌苗典型地是通過將結合物分散於任何適宜的可藥用的載體中而形成，所述的載體例如生理鹽水或其他可注射的液體。該菌苗腸胃外給藥，如皮下的、腹膜內的或肌肉的。在菌苗中也可存在常用的添加劑，例如穩定劑如乳糖或山梨醇，及輔助劑如磷酸鋁、氫氧化鋁或硫酸鋁。該菌苗也可能結合成為複合菌苗的一部分。
用於人的嬰幼兒的菌苗的合適劑量通常在每千克體重約5-25微克或約1-10微克範圍內。
實施例用下面非限制性實施例來說明本發明。為評定之目的已製備N-乙醯基、N-丙醯基、N-丁醯基、N-異丁醯基、N-戊醯基和N-己醯基-GBMP-蛋白質結合物，而結果在實施例中論述。
用於製備結合物的材料和方法(a)材料從Sigma Chemicals Co.，St.Louis，Mo.購得丙酸酐、丁酸酐、異丁酸酐、戊酸酐和己酸酐及多聚乙醯神經氨酸。由於多聚乙醯神經氨酸在結構上與腦膜炎雙球菌B血清群多糖(GBMP)相同，所以以後把它當作GBMP。從Institut Armand Frappier，Laval，Quebec購得破傷風類毒素(TT)，而其單體形式(用於所有結合作用)是按照上述製備措施經過一個Bio-Gel(商標)A0.5(200-400目)柱(1.6×90cm)(Bio-Rad，Richmond，CA.)平衡並用0.01M磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)(pH7.4)進行洗脫而獲得的。
(b)GBMP的N-脫乙醯作用將GBMP(Na+鹽)(1.0g)溶解在5ml2M的NaOH溶液中，隨後加入NaBH4(150mg)，在一個螺旋蓋Teflon(商標)容器(60ml)中將該溶液在110℃加熱6小時。這種工藝規程基本上與J.Immunol.，134，2651(1985)和美國專利4727136(兩者的作者都是Harold J.Jennings等人)中公開的工藝規程相同。然後冷卻的稀釋溶液在4℃對著蒸餾水進行完全滲析，並凍幹。達到N-脫去乙醯基的GBMP的事實由在N-脫去己醯基的GBMP的1H-nmr光譜中甲基乙醯氨基信號(單獨在σ2.07)消失而得到證實。
(c)GBMP的N-醯化作用將N-脫去乙醯基的GBMP(1.0g)溶解在50ml 15%NaHCO3水溶液中。向5份獨立的等分溶液(100ml上述溶液)中分別加入丙酸酐、丁酸酐、異丁酸酐、戊酸酐和己酸酐。這些試劑是在室溫下於3小時時間內以3×0.5ml的等分量加入的，而用0.5NNaOH使溶液的pH保持在8.0。在每次加入酐的同時加入甲醇(0.5ml)，以增加其溶解度。最後在4℃下將溶液攪拌16小時，在4℃下對著蒸餾水進行完全滲析，並凍幹。獲得單獨的N-丙醯基化的、N-丁醯基化的、N-異丁醯基化的、N-戊醯基化的和N-己醯基化的GBMP，其產率都超出90%。在每種情況下，通過在N-脫去乙醯基的GBMP的相應的1H-nmr光譜中的消失證實N-醯化作用基本完成。
(d)不同N-醯化的GBMP片段尺寸使用Ultragel(商標)AcA44(顆粒直徑60-140um)柱(IBF)以得到所需平均分子量的N-醯化的GBMP物質，收集用FLPC(見下面)在KD0.5-KD0.7測量的來自柱的洗脫餾分，滲析並凍幹。這種KD的範圍與約30-50個唾液酸殘基的N-醯化的GBMP(平均分子量為10000-15000道爾頓，典型的是12000道爾頓)相一致。也可收集並結合與具有平均分子量為30000-40000道爾頓片段相對應的KD0.2-KD0.4範圍內的餾分。因此，對在KD0.2-0.7範圍內洗脫的N-醯化的物質是特別感興趣的。
(e)多糖結合物通過高碘酸鹽氧化(見美國專利4356170)將末端酐基引入N-醯化的GBMP。室溫下在暗處在0.1MNaIO4(偏高碘酸鈉)(10ml)水溶液中將上面的N-醯化的GBMP片段氧化2小時。然後通過加入1ml1，2-亞乙基二醇將過量高碘酸鹽消耗掉，隨後在4℃下將該溶液完全滲析，並凍幹。在N-脫乙醯作用過程中(除GBMP外)使用NaBH4使每個N-醯化的GBMP的末端還原性唾液酸殘基轉變為開鏈多羥基化合物殘基。這種類型的殘基對高碘酸鹽是敏感的(見J.Immunol.，127，1011(1981)和美國專利4356170，Harold J.Jennings et al)，因此，在兩端都導致酐基團引入N-醯化的GBMP片段。
將100mg氧化的片段溶解在2ml0.1M的NaHCO3(PH8.1)緩衝液中，並向這種溶液添加20mgTT。最後，接著添加40mg氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)，在室溫下慢慢攪拌溶液。在結合過程中使用含Superose(商標名)12HR10/30(Pharmacia)的凝膠過濾柱進行FPLC，在PBS緩衝液(PH7.2)中以1ml/分的速度流動，在214nm處測量蛋白質和N-醯化的片段。片段的KD＝0.6，TT的KD＝0.39及結合物的KD＝0.23。當所有TT耗盡時，這種結合反應就完成了，TT耗儘是按照對應於KD0.39組分的FPLC色譜峰值損失測定的。在大多數情況下，結合反應在2天內可完成，但允許總反應時間為4天。在凝膠過濾之前，潛在的未反應的醛基最後用20mg氫化硼鈉進行還原。
通過使用生物凝膠(Bio Gel)柱進行凝膠過濾、用PBS作洗脫液使多糖-TT結合物與多糖片段分離。含有結合物的洗脫液逆著蒸餾水進行滲析並冷凍乾燥。N-醯化的GBMP-TT結合物含有12-30%、通常是12-20%的唾液酸，這種唾液酸是用間苯二酚方法測定的(這種方法見Svennerholm，L.，Quantitative Resorcinol-Hydrochloric Acid Method，Biochim.Biophys.Acta.24，604(1957))。這表明該結合物具有的多糖與TT的克分子比為2-31。
免疫作用和免疫測定(a)免疫作用的程序20隻雌性白色CFI鼠(出生8-10周)每隻單獨用存在於Freund完全輔藥(FCA)(Difco，Detroit，MI)中的N-醯化的GBMP-TT結合物進行3次腹膜內免疫(每隔3星期進行一次)。每次免疫都含有足夠的結合物(10-12μg)以便含有2μg唾液酸。在第3次注射後第11天鼠出現貧血。下面實驗通過血清完成。
(b)放射性抗原結合測定這種測定按照改進的放射性免疫法測定抗體量(Farr)技術在體外使用[3H]-標記的GBMP(Jennings H.J.，et al，Determinant Specificities of the Groups B and C polysaccharides of Neisseria meningitidis，J.Immunol.，134，2651(1985))或者[3H]-標記的N-Pr-GBMP(Jennings H.J.，et al，Unigue Intermolecular Bactericidel Epitope involving the HomeSialo Polysaccharide Capsule on the Cell Surface of Group B Neisseria meningitidis and Escherichie coli K1.J.Immunol.，142，3585-3591(1989))進行。用於放射性抗原結合測定的反應混合物通過將20μl混合抗血清用PBS稀釋至100μl，在Eppendorf聚丙烯微量試管中，與在50μlPBS中的[3H]標記的GBMP和[3H]-標記的N-Pr-GBMP混合而獲得，所述的混合抗血清取自每隻單獨用N-醯化的GBMP-TT結合物免疫的20隻鼠群。在4℃培育16小時後，在4℃向試管中加入150μl飽合硫酸銨(PH7.0)並攪拌試管，在4℃保持30分鐘。將試管以15000轉/分離心處理10分鐘並從試管中取出130μl兩等分試樣。將兩等分試樣與2ml水及一種含甲苯閃爍體(ACS含水閃爍體)混合併在液體閃爍計數器中對混合物進行計數。結果示於表1中。
表 1[3H]-標記的N-AC-GBMP與各種鼠的抗-N-醯基-GBMP-TT結合物血清的結合抗血清結合%a1 2 3 4N-Pr-GBMP-TT 40 40 39 12N-Bu-GBMP-TT 4 4 7 4N-Iso Bu-GBMP-TT 9 / / /N-Pen-GBMP-TT 36 / / /N-Hex-GBMP-TT 16 / / /a表示對取自20隻免疫鼠的混合抗血清做的四次結合實驗。
在表1和其他表中使用的縮寫詞N-Ac、N-Pr、N-Bu、N-IsoBu、N-Pen和N-Hex分別代表N-乙醯基、N-丙醯基、N-丁醯基、N-異丁醯基、N-戊醯基和N-已醯基。
數字1、2、3、4是4次重複實驗結果。表1清楚地表明N-Ac-GBMP(其中載有相同的抗原決定簇如胎兒的N-CAM)與N-Bu-GBMP、N-IsoBu-GBMP、N-Pen-GBMP和N-Hex-GBMP誘導的抗血清的結合少於與N-Pr-GBMP誘導的抗血清的結合。由此從表1可以推知N-Bu、N-IsoBu、N-Pen和N-Hex多糖結合物比N-Pr結合物增加交叉反應抗體要少。
(c)定量沉澱素分析這些實驗按照Kabat和Mayer方法(Experimental Immunochemi stry charlesc.Thomas，springfield，p，22(1961))進行。100μl抗N-醯基GBMP-TT血清等分試樣(在PBS中稀釋至5倍)在試管中與總體積為200μl(用PBS調節)的增高濃度的N-乙醯基(多聚乙醯神經氨糖酸)，N-丙醯基，N-丁醯基，N-異丁醯基，N-戊醯基和N-已醯基GBMP進行反應。在這些實驗中使用這些衍生物的高分子量餾分，它們由Ultragel AcA 44柱(KD0.4，通過FPLC測量)的洗脫而獲得，這種柱預先用於測定N-醯化的GBMP片段尺寸。這些試管伴隨每日混合在4℃培育4天，然後離心處理，抗體蛋白質數量按照Lowry等人的方法-用福林(Folin)酚試劑測定蛋白質(J.Biol.Chem.1933，265(1951))進行測定，結果示於表2表 2使用不同的N-醯基GBMP作為沉澱抗原時，鼠的抗N-醯基-GBMP-TT血清的沉澱a抗血清 N-醯基-GBMP抗原N-乙 N-丙 N-丁 N-戊 N-已醯基 醯基 醯基 醯基 醯基N-Pr-GBMP-TT 0.16 0.40 0.20 0.15 0.15N-Bu-GBMP-TT 0.04 1.15 2.60 3.20 1.90N-Pen-GBMP-TT 0.13 0.38 0.44 6.35 3.55N-Hex-GBMP-TT 0.02 0.08 0.80 4.15 4.40
a表示以mg/ml抗血清表示的已沉澱的抗體最大數量。
關於交叉活性，表2第1欄表明，與N-Pr結合物相比，N-Bu和N-Hex結合物產生極少量交叉反應抗體。也可以看出，N-Pen結合物較N-Pr結合物產生的交叉反應抗體少。關於致免疫性(以相同應答表示)，由表2可以看出，N-Bu-(2.60)，N-Pen-(6.35)和N-Hex-(4.40)GBMP-TT結合物比N-Pr-GBMP-TT結合物(0.40)是更致免疫的。
(d)ELISA給EIA微量滴定板(Flowlabs，Mississauga，Ontario，Canada)的井塗上濃度為10μg/ml的溶於PBS中的或GBMP-、NPrGBMP-或NBu-GBMP10-BSA結合物溶液，每個井塗上100μl。該板在4℃放置18小時，在塗抹後，在室溫將這些板用1%的溶於PBS的牛血清白蛋白溶液衝洗10分鐘(阻塞步驟)。然後用在PBS中連續稀釋10倍的100μl抗-鼠-N-醯基GBMP-TT結合物血清填入這些井中並在室溫下將這些板培育1小時。用SBT衝洗後，在室溫用50μl山羊抗鼠免疫球蛋白過氧化物酶標記的結合物(Kirkegard and Perry Laboratories)的相應稀釋液培育1小時，然後吸出井中的物質並用SBT將板洗滌5次。最後向每個井中加入50μl四亞甲基藍色過氧化物酶培養基(TMB)(Kirkegard and Perry Laboratories)，10分鐘後使用Multisc an分光光度計(Flow Laboratories，Mississauga，Ont.)。結果示於表3。
表 3
混合鼠抗-N-醯基-GBMP-TT結合物血清對N-醯基-GBMP-BSA結合物的ELISA滴度塗敷抗原抗血清滴度aa,N-Pr-GBMPba,N-Bu-GBMPba,N-IsoBu-GBMPbN-AC-GBMP-BSA 7800 1000 7000N-Pr-GBMP-BSA 40000 39000 9800N-Bu-GBMP-BSA 26000 52000 9700N-IsoBu-GBMP-BSA / / 25000a滴度(GM)＝50%的稀釋溶液在450nm處最大吸光度的倒數。
b表示在鼠中由同系化合物N-醯基-GBMP-TT結合物誘導的N-醯基特殊抗血清。
關於交叉反應性，由表3可以看出，N-Bu-GBMP-TT結合物對N-AC-GBMP的交叉反應抗體的增加(1000)比N-Pr-GBMP-TT結合物(7800)少。其原因在於，GBMP與由N-Pr-GBMP-TT結合物誘導的抗體的解釋適用於與由N-Bu-GBMP-TT結合物誘導的抗體的結合。類似的解釋適用於N-IsoBu-GBMP-TT結合物。
關於致免疫性。如同繫結合的滴度52000(N-Bu)和40000(N-Pr)所示，N-Bu結合物比N-Pr結合物是更致免疫的。
(e)放射性結合抑制測定為了提高大分子尺寸化的N-醯基GBMP的濃度，向20μl的鼠抗-N-Pr-GBMP-TT結合物抗血清中添加抑制劑(溶於80μlPBS)，其數量是在沒有抑制劑時足以結合50%的(3H)-標記的N-Pr-GBMP。試管在37℃培育1小時並加入50μl溶於PBS中的(3H)-標記的-N-Pr-GBMP。在平靜之後，按照上述放射性抗原結合測定法進行精確測定。作用下式計算抑制百分數抑制百分數＝100×[(有抑制劑的每分鐘計數-無抑制劑的每分鐘計數)/(無抗體的每分鐘計數-無抑制劑的每分鐘計數)]結果列於表4。
表 4(3H)-標記的N-Pr-GBMP與IgG2a′IgG2b(A)a和IgG(B)a抗體誘導的鼠抗N-Pr-GBMP-TT結合物的結合抑制抑制劑bA BN-AC-GBMP 50.0 50.0N-Pr-GBMP 0.6 0.3N-Bu-GBMP 0.3 0.2N-IsoBu-GBMP 50.0 /N-Pen-GBMP 2.3 2.5N-Hex-GBMP 10.2 10.0a是鼠的多克隆抗N-Pr-GBMP-TT血清餾分(Jennings等人在J.Immuol.，142，3585-3591(1938)中已描述)b是產生50%抑制作用的抑制劑的微克數。
殺菌測定 這些測定按照Jennigs等人在J.Exp.Med.，165，1207-1211(1987)中描述的方法進行。
腦膜炎雙球菌株B(M986)用於這些測定。結果列於表5
表 5(3H)-標記的-N-Pr-GBMP與各種鼠抗N-醯基-GBMP-TT結合物血清結合和相應的抗血清的殺菌滴度抗血清抗血清a(μl) 殺菌滴度bN-Pr-GBMP-TT 13 128N-Bu-GBMP-TT 10 64N-IsoBu-GBMP-TT ND 64N-Pen-GBMP-TT 24 64N-Hex-GBMP-TT 100 8N-Ac-GBMP-TT 100 8a是要求50%結合的抗血清(用PBS稀釋至5倍)的μl數b是稀釋實驗某種稀釋差別，例如128與64相比，在實驗誤差之內。
表4表明，N-Bu-GBMP象N-Pr-GBMP一樣是一種對N-Pr-GBMP與其自身的同系抗體結合的良好抑制劑。因此，用N-Bu-GBMP代替N-Pr-GBMP不會使N-Pr-GBMP所具有的性能顯著損失。表5表明，N-Bu-GBMP象N-Pr-GBMP一樣也結合由N-Pr-GBMP-TT結合物誘導的抗體。由N-Bu-GBMP-TT和N-Pr-GBMP-TT結合物兩者誘導的抗血清具有類似的殺菌滴度。這些數據表示，N-Bu-GBMP，N-IsoBu-GBMP和N-Pen-GBMP的摸擬在腦膜炎雙球菌B血清群表面殺菌抗原決定簇的能力與N-Pr-GBMP相當。
權利要求
1.一種含有結合到合適免疫蛋白質上的腦膜炎雙球菌B血清群多糖的結合物，其中該腦膜炎雙球菌B血清群多糖具有的唾液酸殘基N-乙醯基被N-C4-C8-醯基取代。
2.一種權利要求1所述的結合物，其中醯基選自正丁基，異丁基，戊基，己基，庚基和辛基。
3.一種權利要求2所述的結合物，其中醯基選自正丁基，異丁基，戊基和己基。
4.一種權利要求1所述的結合物，其中蛋白質選自破傷風類毒素、白喉類毒素、交叉反應物質(CRM)和細菌蛋白質載體。
5.一種權利要求1所述的結合物，其中蛋白質和多糖是通過-CH2-NH-蛋白鍵共價健合的。
6.權利要求4所述的結合物，其中CRM是CRM197。
全文摘要
所具有的唾液酸殘基N-乙醯基被N-醯基取代而改性的腦膜炎雙球菌B血清群多糖(GBMP)顯示出增強的免疫反應。此外，與未改性腦膜炎雙球菌B血清群和大腸桿菌(E.coli)K1囊多糖及其有共同抗原決定簇的其他組織細胞交叉反應的抗體誘導減到最小程度。改性的多糖與一種生理上可接受的蛋白質(例如破傷風類毒素)的結合誘導特殊預防抗體的產生，該抗體具有不可忽視水平的GBMP交叉反應抗體，因此能夠預防由腦膜炎雙球菌B血清群和大腸桿菌K1引起的感染。
文檔編號A61P31/04GK1096516SQ9311946
公開日1994年12月21日 申請日期1993年11月22日 優先權日1989年12月14日
發明者哈羅德·J·詹寧斯, 弗朗西斯·米瓊 申請人:加拿大國家研究委員會