楓糖尿病相關基因突變、其檢測方法及其用途

2023-05-31 02:17:01 1

楓糖尿病相關基因突變、其檢測方法及其用途
【專利摘要】本發明涉及疾病相關突變基因領域，特別是常染色體隱性遺傳性胺基酸代謝病基因突變，楓糖尿病相關基因突變，更特別是楓糖尿病相關基因突變、其檢測方法及其用途。
【專利說明】楓糖尿病相關基因突變、其檢測方法及其用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及疾病相關突變基因領域，特別是常染色體隱性遺傳性胺基酸代謝病基 因突變，楓糖尿病相關基因突變。

【背景技術】
[0002] 楓糖尿病（Maple Syrup Urine Disease, MSUD)是一種常染色體隱性遺傳性氨基 酸代謝病，主要是由於以下原因所致：支鏈胺基酸α-酮酸脫氫酶複合體的基因缺陷，使支 鏈胺基酸(主要包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）轉氨基反應後形成的相應支鏈α -酮酸不 能氧化脫羧，組織中支鏈胺基酸和支鏈α-酮酸異常增高，體液排出α-酮酸，因而出現類 似楓糖的氣味，並且由此而得名。同時，由於蓄積體內的支鏈胺基酸及其α-酮酸衍生物對 腦組織有毒性作用，可以抑制髓鞘生成，幹擾腦內蛋白合成，抑制神經遞質功能，使發育中 的腦組織受到嚴重損害。特殊氣味和嚴重腦病是本病非常明顯的兩個特點。目前，本病共 分成如下5種類型：經典型、中間型、間隙型、維生素 Β1治療有效型和二氫硫辛醯胺醯基脫 氫酶（Ε3)缺乏型，其中最後一種類型非常罕見。
[0003] 楓糖尿病在新生兒中的患病率是1/18萬。遺傳缺陷是線粒體中存在的BCKD多酶 複合體中的Ε1、Ε2和Ε33亞基的基因突變。BCKD多酶複合體是一種存在於線粒體中的多酶 複合體，其功能是催化從支鏈胺基酸降解而產生的3種支鏈α酮酸的氧化性脫羧。酶複合 體圍繞一立方體核心含有24個相同的雙氫脂醯轉環酶（dihydrolipoyltranscylase，Ε2) 亞基，這些亞基通過離子相互作用連接在一起。此外，還有支鏈α酮酸脫羧酶（El)、特異性 激酶（E3)和特異性磷酸酶。特異性激酶和磷酸酶通過可逆性磷酸化來調節BCKD複合物活 性。E1是雜四聚體，由2個Ε?α和2個Ε?β亞基組成。E3為同二聚體。Elα、Elβ、E2和 Ε3的編碼基因都可發生突變而導致BCKD多酶複合體活性降低。Ε1是焦磷酸硫胺素（ΤΡΡ) 依賴性酶，由2個El a和2個Ε1 β形成a 2 β 2四聚體，分子量為170kD。El a和Ε1 β基 因座分別定位在19q和6ρ，均可發生突變。El a基因突變則可阻礙其與正常的El β聚合 成四聚體，使El a迅速被降解，從而使支鏈a酮酸脫羧酶活性降低或完全喪失；或者只形 成α β二聚體，也可形成低分子量的四聚體。Wynn等研究了 IA型楓糖尿病患者中El a與 Ε?β的聚合障礙後指出：在被研究的El a突變如果在假定的焦磷酸硫胺素結合袋，則對E1 亞基的聚合無影響；如果涉及到C末端芳香性殘基的突變，則阻礙亞基聚合動力學和天然 的α 2β 2結構的形成。El α亞基的突變使支鏈α-酮酸脫羧酶活性降低或完全喪失。
[0004] 確定新的MSUD基因的致病突變，對開展MUSD的分子診斷具有重要意義。


【發明內容】

[0005] 本發明人通過廣泛而深入的研究，在一個MUSD患者中發現了編碼支鏈a -酮酸脫 氫酶複合體El- α亞基的基因 BCKDHA基因的複合雜合突變：錯義突變c. 392A>G (即El- a 亞基蛋白的突變P. Tyrl31Cys)和EX2-4DUP。該複合雜合突變導致BCKDHA基因失去正常功 能，從而導致MUSD發生。發明人在此基礎上完成了此發明。
[0006] 本發明涉及MUSD病基因的複合雜合突變，具體為：BCKDHA基因的錯義突變 c. 392A>G (即支鏈α-酮酸脫氫酶複合體El-α亞基蛋白的錯義突變p.Tyrl31Cys)和 EX2-4DUP(指在一條染色體上，BCKDHA基因的2-4號外顯子的拷貝數增加1倍，即出現外顯 子2-3-4-2-3-4的結構）。其中，BCKDHA基因編碼支鏈α-酮酸脫氫酶複合體El-α亞基。
[0007] 在第一方面，本發明涉及MUSD病的生物標記物，即BCKDHA基因或支鏈α-酮酸 脫氫酶複合體Ε1- α亞基蛋白的雜合突變，所述生物標記物是如下的突變BCKDHA基因或 El-α亞基蛋白：BCKDHA基因的錯義突變c.392A>G (即支鏈α-酮酸脫氫酶複合體El-α 亞基蛋白的錯義突變P. Tyrl31Cys)和EX2-4DUP。
[0008] 在一個實施方案中，本發明的突變BCKDHA基因為具有以下突變的SEQ ID NO: 1 : 錯義突變 c. 392A>G 和 EX2-4DUP。
[0009] 在一個實施方案中，本發明的突變的支鏈α -酮酸脫氫酶複合體El-α亞基蛋白 為具有以下突變的SEQ ID N0:2:錯義突變p.Tyrl31Cys和EX2-4DUP。
[0010] 在第二方面，本發明涉及一種檢測MUSD病或檢查其易感性的方法，所述方法包括 檢測受試者的BCKDHA基因或支鏈α-酮酸脫氫酶複合體El-α亞基蛋白中是否存在突變 位點，如果有突變位點，則所述受試者被鑑定為患有MUSD病或易患MUSD病，或者其後代會 患有MUSD病或易患MUSD病，所述突變為BCKDHA基因的錯義突變c. 392A>G(即支鏈α -酮 酸脫氫酶複合體Ε1- α亞基蛋白的錯義突變p. Tyrl31Cys)和/或EX2-4DUP。
[0011] 在一個實施方案中，BCKDHA基因的cDNA序列為SEQ ID NO: 1的序列表不。
[0012] 在一個實施方案中，El-α亞基蛋白為SEQ ID N0:2的序列表示。
[0013] 在一個實施方案中，本發明的檢測MUSD病的方法包括如下兩組引物擴增的步驟：
[0014] SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 ;
[0015] SEQ ID NO:5 至 SEQ ID NO: 10。
[0016] 在一個實施方案中，本發明的檢測MUSD病的方法中檢測突變位點通過選自如下 的技術進行：測序、電泳、核酸雜交、PCR、逆轉錄酶鏈反應和變性高效液相色譜，基於螢光 標記技術的DNA測序。
[0017] 在本發明第二方面的方法中，優選檢測BCKDHA基因的錯義突變c. 392A>G(即支鏈 α -酮酸脫氫酶複合體E1- α亞基蛋白的錯義突變p. Tyrl31Cys)和/或EX2-4DUP。
[0018] 在第三方面，本發明涉及一種檢測突變BCKDHA基因或支鏈α -酮酸脫氫酶複合體 El-α亞基蛋白的方法，所述方法包括檢測受試者的BCKDHA基因（即支鏈α-酮酸脫氫酶復 合體El-α亞基蛋白）中是否存在BCKDHA基因的錯義突變c.392A>G (即支鏈α-酮酸脫 氫酶複合體Ε1- α亞基蛋白的錯義突變p. Tyrl31Cys)和/或EX2-4DUP。
[0019] 在一個實施方案中，BCKDHA基因為SEQ ID NO: 1的序列表示。
[0020] 在一個實施方案中，El-α亞基蛋白為SEQ ID N0:2的序列表示。
[0021] 在一個實施方案中，本發明的檢測突變BCKDHA基因或El-α亞基蛋白的方法包括 如下兩組引物擴增的步驟：
[0022] SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 ;
[0023] SEQ ID NO:5 至 SEQ ID NO: 10。
[0024] 在一個實施方案中，本發明的檢測突變BCKDHA基因或El-α亞基蛋白的方法中檢 測突變位點通過選自如下的技術進行：測序、電泳、核酸雜交、PCR、逆轉錄酶鏈反應和變性 高效液相色譜，基於螢光標記技術的DNA測序。
[0025] 在第四方面，本發明涉及通過PCR檢測突變BCKDHA基因或支鏈α -酮酸脫氫酶復 合體El- α亞基蛋白中使用的引物對，所述突變是BCKDHA基因的錯義突變c. 392A>G (即支 鏈α -酮酸脫氫酶複合體El- α亞基蛋白的錯義突變p. Tyrl31Cys)和/或EX2-4DUP。
[0026] 其中所述引物對分別基於選自如下的位鉻在基因組序列或cDNA序列上前後設 計，使得擴增該位鉻：BCKDHA基因 cDNA序列第392位和/或外顯子2-4。
[0027] 在第五方面，本發明涉及與突變BCKDHA基因互補的核酸探針，所述突變是BCKDHA 基因的錯義突變c. 392A>G和/或EX2-4DUP。
[0028] 所述探針與突變BCKDHA基因的互補區包括選自如下的基因組序列或cDNA序列上 的位鉻：BCKDHA基因cDNA序列第392位和/或外顯子2-4。
[0029] 在第六方面，本發明涉及檢測突變BCKDHA基因或支鏈α-酮酸脫氫酶複合體 Ε1- α亞基蛋白的試劑盒，包含一組或多組引物對，其中所述突變是BCKDHA基因的錯義突 變c. 392A>G (即支鏈α-酮酸脫氫酶複合體El-α亞基蛋白的錯義突變p.Tyrl31Cys)和 / 或 EX2-4DUP。
[0030] 其中所述引物對分別基於選自如下的位鉻在基因組序列或cDNA序列上設計，使 得其擴增產物涵蓋該位鉻：BCKDHA基因 cDNA序列第392位和/或外顯子2-4。
[0031] 在一個實施方案中，所述檢測突變BCKDHA基因或支鏈α-酮酸脫氫酶複合體 ΕΙ-α亞基蛋白的試劑盒包括如下兩組引物：
[0032] SEQ ID Ν0:3 和 SEQ ID Ν0:4 ;
[0033] SEQ ID NO:5 至 SEQ ID NO: 10。
[0034] 在第七方面，本發明涉及檢測突變BCKDHA基因或支鏈a-酮酸脫氫酶複合體 El- α亞基蛋白的試劑盒，包含一個或多個核酸探針，所述突變是BCKDHA基因的錯義突變 c. 392A>G 和 / 或 EX2-4DUP。
[0035] 所述探針與突變BCKDHA基因上包含選自如下位鉻的基因組序列或cDNA序列上的 區域互補：BCKDHA基因 cDNA序列第392位和/或外顯子2-4。
[0036] 本發明人發現，本發明的BCKDHA基因的c. 392A>G和EX2-4DUP的複合雜合突變即 致病；而本發明的BCKDHA基因的c. 392A>G和EX2-4DUP任一種的雜合突變並不致病，如雜 合錯義突變c. 392A>G (p. Tyrl31Cys)存在於患者的母親中，雜合突變EX2-4DUP存在於患 者的父親中，他們並未患病。
[0037] 本發明的BCKDHA基因中的複合雜合突變，可以用于楓糖尿病病變的檢測和診斷。 本發明發現了 MUSD病相關基因的複合雜合突變，對這些基因突變的檢測可能用於MUSD病 患者的輔助診斷，並且可能有利於明確MUSD病患者的分子診斷。因此，本發明的檢測複合 雜合突變BCKDHA基因（或El-α亞基蛋白）和/或EX2-4DUP的方法可以用於診斷MUSD病 或其易感性的目的，例如產前診斷、植入前遺傳學診斷（PGD)、患者篩查。然而，本發明的方 法並不僅限於用於診斷疾病的目的。
[0038] 另外，本發明的檢測突變BCKDHA基因和/或El-α亞基蛋白的方法也可以用於非 診斷疾病的目的。所述的非檢測疾病的目的包括但不限於研究SNP分布和多態性，用於家 族演化研究。本發明可以對MUSD病的發病機理提供重要線索，對MUSD病的診斷治療具有 十分重要的意義。這樣的應用也是本領域技術人員可以理解的。
[0039] 例如，根據本文的描述可以看出，有些個體攜帶本發明所述的突變BCKDHA基因 (或支鏈α-酮酸脫氫酶複合體ΕΙ-α亞基蛋白）或者攜帶本發明所述的EX2-4DUP但不患 MUSD病，例如僅一條染色體攜帶突變的雜合基因型。對這部分人群的檢測可以任何不涉及 診斷疾病的目的，因為這些個體並不患病。但對於他們進行檢測的結果可以作為例如有用 信息使用，例如作為育前檢查的重要指標，指導生育，或者用於突變攜帶者篩查，或者作為 SNP分布和多態性研究的工具或者追蹤基因突變或家族演化。
[0040] 因此，本研究豐富了 MSUD基因的致病突變譜，對開展MUSD的分子診斷具有重要意 義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1 :患者（即先證者Ρ610)和其父母（Ρ609是父親，Ρ611是母親）的BCKDHA基因 的sanger測序
[0042] 圖2:患者、其父母和正常人對照的BCKDHA基因的QPCR測序結果。其中P610是 患者，P611是患者母親，P609是患者父親；N108為正常人。
[0043] BCKDHA基因的cDNA序列（SEQ ID N0:1 ;下劃線部分為EX2-4 ;加框的為第392 位）：
[0044] ATGGCGGTAGCGATCGCTGCAGCGAGGGTCTGGCGGCTAAACCGTGGTTTGAGCCAGGCTGCCCTCCTG CTGCTGCGGCAGCCTGGGGCTCGGGGACTGGCTAGATCTCACCCCCCCAGGCAGCAGCAGCAGTTTTCATCTCTGGA TGACAAGCCCCAGTTCCCAGGGGCCTCGGCGGAGTTTATAGATAAGTTGGAATTCATCCAGCCCAACGTCATCTCTG GAATCCCCATCTACCGCGTCATGGACCGGCAAGGCCAGATCATCAACCCCAGCGAGGACCCCCACCTGCCGAAGGAG MGGTGCTGAAGCTCTACAAGAGCATGACACTGCTTAACACCATGGACCGCATCCTCTATGAGTCTCAGCGGCAGGGC CGGATCTCCTTCTP|CATGACCAACTATGGTGAGGAGGGCACGCACGTGGGGAGTGCCGCCGCCCTGGACMCACGGA CCTGGTGTTTGGCCAGTACCGGGAGGCAGGTGTGCTGATGTATCGGGACTACCCCCTGGAACTATTCATGGCCCAGT GCTATGGCAACATCAGTGACTTGGGCAAGGGGCGCCAGATGCCTGTCCACTACGGCTGCAAGGAACGCCACTTCGTC ACTATCTCCTCTCCACTGGCCACGCAGATCCCTCAGGCGGTGGGGGCGGCGTACGCAGCCAAGCGGGCCAATGCCAA CAGGGTCGTCATCTGTTACTTCGGCGAGGGGGCAGCCAGTGAGGGGGACGCCCATGCCGGCTTCAACTTCGCTGCCA CACTTGAGTGCCCCATCATCTTCTTCTGCCGGAACAATGGCTACGCCATCTCCACGCCCACCTCTGAGCAGTATCGC GGCGATGGCATTGCAGCACGAGGCCCCGGGTATGGCATCATGTCAATCCGCGTGGATGGTAATGATGTGTTTGCCGT ATACAACGCCACAAAGGAGGCCCGACGGCGGGCTGTGGCAGAGAACCAGCCCTTCCTCATCGAGGCCATGACCTACA GGATCGGGCACCACAGCACCAGTGACGACAGTTCAGCGTACCGCTCGGTGGATGAGGTCAATTACTGGGATAAACAG GACCACCCCATCTCCCGGCTGCGGCACTATCTGCTGAGCCAAGGCTGGTGGGATGAGGAGCAGGAGAAGGCCTGGAG GAAGCAGTCCCGCAGGAAGGTGATGGAGGCCTTTGAGCAGGCCGAGCGGAAGCCCAAACCCAACCCCAACCTACTCT TCTCAGACGTGTATCAGGAGATGCCCGCCCAGCTCCGCAAGCAGCAGGAGTCTCTGGCCCGCCACCTGCAGACCTAC GGGGAGCACTACCCACTGGATCACTTCGATAAGTGA
[0045] El-α亞基蛋白的胺基酸序列（SEQ ID N0:2 ;下劃線為EX2-4編碼的胺基酸；加框 的為第131位）：
[0046] MAVAIAAARVffRLNRGLSQAALLLLRQPGARGLARSHPPRQQQQFSSLDDKPQFPGASAEFIDKLEFIQ PNVISGIPIYRVMDRQGQIINPSEDPHLPKEKVLKLYKSMTLLNTMDRIL面ESQRQGRISFYMTNYGEEGTHVGSAA ALDNTDLVFGQYREAGVLMYRDYPLELFMAQCYGNISDLGKGRQMPVHYGCKERHFVTISSPLATQIPQAVGAAYAA KRANANRWICYFGEGAASE ⑶ AHAGFNFAATLECPIIFFCRNNGYAISTPTSEQYRGDGIAARGPGYGMSIRVDG NDVFAVYNATKEARRRAVAENQPFLIEAMTYRIGHHSTSDDSSAYRSVDEVNYWDKQDHPISRLRHYLLSQGWWDEE QEKAWRKQSRRKVMEAFEQAERKPKPNPNLLFSDVYQEMPAQLRKQQESLARHLQTYGEHYPLDHFDK

【具體實施方式】
[0047] 本研究對一個被診斷為MSUD的患者進行BCKDHA、BCKDHB、DBT、DLD基因的捕獲測 序。測序後進行變異檢測。然後，將檢測的變異與dbSNP資料庫、千人基因組資料庫、HapMap 資料庫、HGMD資料庫、LSMD資料庫和正常人的數據進行比較，最後找到BCKDHA基因的未報 道過的複合雜合突變：BCKDHA基因的錯義突變c. 392A>G (或支鏈α-酮酸脫氫酶複合體 El-α亞基蛋白的錯義突變p. Tyrl31Cys)和EX2-4DUP。其中，基因BCKDHA編碼支鏈α-酮 酸脫氫酶複合體ΕΙ-α亞基。
[0048] 樣本採集
[0049] 我們接受了一個到醫院就診的來自北京的MUSD患者，3歲，其生產過程正常沒有 窒息情況，6個月是被診斷為肌遲緩，經一系列檢查，其MRI和腦電圖均不正常。其血漿的定 量胺基酸分析結果顯示，亮氨酸+異亮氨酸總量為715. 4808 μ Μ (參考值120-190 μ Μ)，酪 氨酸總量為452. 3789 μ Μ (參考值200-425 μ Μ)。我們採集了該患者和其父母親的外周血 並提取了基因組DNA。除此之外，本研究還採集了 455個正常人的外周血並提取了其基因組 DNA。
[0050] 與所有受試者或其監護人籤訂書面的知情許可。
[0051] 晶片設計、文庫構建和高通量測序
[0052] 發明人用定製的捕獲晶片（NimblGen，Roche)結合Solexa Hiseq2000高通量測序 技術對該患者的BCKDHA、BCKDHB、DBT、DLD基因進行了捕獲測序，具體如下：
[0053] 1)我們設計了一張捕獲晶片（NimblGen，Roche)對4個基因的外顯子、剪接位點和 鄰近的內含子序列進行捕獲。
[0054] 2)將基因組DNA隨機打斷成150_200bp左右的片段，隨後在片段兩端分別連接上 接頭，製備文庫(參見http://www. illumina. com/提供的Illumina/Solexa標準建庫說明 書)。
[0055] 3)文庫經純化後經過ligation-mediated PCR(LM-PCR)的線性擴增與定製的捕 獲陣列進行雜交富集，再經過LM-PCR的線性擴增後進行上機測序。測序平臺為Illumina Hiseq2000,讀取長度為90bp。
[0056] 變異檢測、注釋及與資料庫比較
[0057] 1)測序後獲得的原始數據由Illumina basecalling Softwarel. 7進行處 理。然後過濾低質量讀段和包含接頭汙染讀段。使用BWA (versi〇n0.5.9-rl6)(可參 見 Li H, Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics2010;26(5) :589-595)將高質量讀段比對到參考基因組，獲得 比對到基因組上的唯一比對讀段。然後利用SOAPsnp (可參見：Li R，Li Y，Fang X，Yang H, et al, SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing. Genome Res2009, 19(6) :1124-1132.，通過參照將其全文併入本文）和 GATK (version vl. 0· 4705)(可參見McKenna, A, Hanna M, Banks E, et al. The genome analysis toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research2010;20(9) :1297-1303)分別進行 SNP 和 indel 的檢測。
[0058] 2)對於檢出的SNP和indel變異，我們利用內部的流程進行注釋，即確定變異所處 基因組環境，以及變異的類型。我們關注非同義突變，剪接受體/供體位點突變和編碼區插 入和缺失突變這三類最有可能與疾病相關的突變。我們將檢出的變異和dbSNP資料庫、千 人基因組資料庫、HapMap資料庫、HGMD資料庫和LSMD資料庫等公共資料庫以及正常人的數 據進行了比較。我們選出了 HGMD資料庫和LSMD資料庫中包含的變異以及位於編碼區和剪 接位點區的先前未報導過的變異，然後和我們的內部對照資料庫進行比較。對於位於疾病 已知基因上的候選致病突變，我們進行了 sanger驗證。
[0059] 通過上述分析，我們在該患者的BCKDHA基因中發現未報導過的複合雜合突變：錯 義突變 c. 392A>G(p. Tyrl31Cys)和 EX2-4DUP。其中，雜合錯義突變 c. 392A>G(p. Tyrl31Cys) 存在於患者的母親中，雜合突變EX2-4DUP存在於患者的父親中，因此可判斷為複合雜合突 變。我們的結果表明BCKDHA基因的功能缺失突變是導致楓糖尿病（MUSD)的原因。
[0060] 在本文中使用的靶向捕獲測序又稱為目標區域捕獲測序，就是將研究者感興趣的 基因組區域定製探針並與基因組DNA進行晶片雜交（NimbleGen Sequence Capture array) 或溶液雜交（Agilent Sure-Select System),將目標基因區域DNA富集後再利用新一代測 序技術進行測序的研究策略。目標區域可以是連續的DNA序列，也可以是分布在同一染色 體不同區域或不同染色體上的片段。目前，由於其高通量、低成本和大大縮短的實驗周期， 目標區域測序逐漸在臨床分子診斷中得到廣泛應用。
[0061] 在本發明中，採用本領域通用表示法表示突變。c. 392A>G表示cDNA第392位核苷 酸由A變成G ;p. Tyrl31Cys表示蛋白質水平第131位密碼子由Tyr變成Cys ;EX2-4DUP表 示cDNA和/或蛋白質水平外顯子2-4重複。
[0062] 在本發明中，除非另外說明，否則A和/或B，等價於以下三種情況：A ;B ;A和B。
[0063] 對於本發明說明書和權利要求書中，提及基因序列，本領域技術人員應當理解，實 際包括互補雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說明書和權利要求書中，雖然多數 情況下只給出了一條鏈，但實際上也公開了與之互補的另一條鏈。例如提及BCKDHA基因的 cDNA序列，實際上可以包括/或不包括該序列以及其互補序列。例如，提及SEQ ID NO: 1, 實際可以包括其互補序列。本領域技術人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測另一條鏈，反 之亦然。
[0064] 本申請中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公開其中一種，意味著另一種也被 公開。例如提及BCKDHA基因的cDNA序列，實際也包括相應的RNA序列。
[0065] 下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理 解，下面的實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體 技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社）或者按照產品說明書進行。所用 試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0066] 實施例1
[0067] 基因組提取
[0068] 採集所有受試者的外周血，利用QIAamp DNA BloodMiNi Kit (Qiagen, Hilden, Germany)依照製造商提供的方案提取基因組DNA。
[0069] 實施例2
[0070] 晶片設計、文庫構建和高通量測序
[0071] 本發明人設計了一張捕獲晶片（NimblGen，Roche)對 BCKDHA、BCKDHB、DBT 和 DLD 這4個基因的外顯子、剪接位點和鄰近的內含子序列進行捕獲。
[0072] 文庫構建的方法可參考Illumina公司提供的方案（http://www. illumina. com/)。現簡單描述如下：利用超聲波儀（Covaris S2, Massachusetts, USA)將基因組DNA隨 機打斷成200-300bp的片段。取1 μ g (用Nanodrop定量）純化DNA片段用T4DNA聚合酶、 T4磷酸核苷酸激酶和大腸桿菌（Escherichia coli)DNA聚合酶的Klenow片段進行處理，補 平5'突出末端和去除3'突出末端。在3'末端添加 A鹼基以後再連接上接頭序列。添加 接頭以後，利用包含8bp標籤序列（barcode sequence)的PCR引物進行4個循環的PCR得 到捕獲前的文庫。將10個文庫混合後與捕獲晶片進行72小時雜交。雜交完成以後，利用 300ml 洗脫緩衝液（SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit ;Qiagen, Valencia, CA, USA) 對結合到晶片上的DNA片段進行洗脫。在自製的洗脫設備上95°C洗脫20分鐘，然後添加 200ml洗脫緩衝液進行一次重複洗脫。參照Illumina標準的成簇和測序的方案，我們利用 Illumina Hiseq2000進行了測序，讀取長度為90bp。
[0073] 實施例3
[0074] 變異檢測、注釋及與資料庫比較
[0075] 1)測序完成以後，利用Illuminal. 3. 4進行圖像分析、錯誤率估計和鹼基讀取，獲 得原始數據。然後過濾低質量讀段（read)和包含接頭汙染讀段。我們將包含超過10%的N 鹼基的讀段、50%的質量值小於5的鹼基佔讀段使用BWA將高質量讀段比對到參考基因組， 獲得比對到基因組上的唯一比對讀段。然後利用SOAPsnp和GATK分別進行SNP和indel 的檢測。
[0076] 2)對於檢出的SNP和indel變異，我們利用內部的流程進行注釋，即確定變異所 處基因組環境，以及變異的類型。我們關注非同義突變，剪接受體/供體位點突變和編碼區 插入和缺失突變這三類最有可能與疾病相關的突變。我們將檢出的變異和dbSNP資料庫、 千人基因組資料庫、HapMap資料庫、HGMD資料庫和LSMD資料庫等公共資料庫進行了比較。 我們選出了 HGMD資料庫和LSMD資料庫中包含的變異以及位於編碼區和剪接位點區的先前 未報導過的變異，然後和我們的內部對照資料庫進行比較。
[0077] 發現BCKDHA基因的未報導過的複合雜合突變：錯義突變c. 392A>G(p. Tyrl31Cys) 和 EX2-4DUP。
[0078] 實施例4
[0079] 分別對家系內1個患者樣本和2個非患者樣本進行Sanger測序，確定錯義突變 c.392A>G (p.Tyrl31Cys)。具體方法步驟如下：
[0080] 1) DNA 提取：
[0081] 採集患者和其父母的外周靜脈血用QIAamp DNA BloodMiNi Kit(Qiagen, Hilden, Germany)方法提取基因組DNA,DNA用於以下步驟2)反應體系中的DNA 模板。
[0082] 2)引物設計及PCR擴增反應
[0083] a)引物序列
[0084] 用於擴增該突變c. 392A>G位點的引物：
[0085] 上遊引物 F :AGCAGTCTGGCAGCGTCTTCTTA (SEQ ID N0:3)
[0086] 下遊引物 R :GCTCCTTAGACCTTCCTGGCACTA (SEQ ID N0:4)
[0087] b)反應體系：
[0088] 反應採用25 μ 1體系，其中：酶及緩衝溶液均購自KATARA公司。
[0089]

【權利要求】
1. 一種楓糖尿病的生物標記物，所述生物標記物包括突變的BCKDHA基因和/或支鏈 α-酮酸脫氫酶複合體El-α亞基蛋白， BCKDHA基因的突變是c. 392A>G，支鏈α-酮酸脫氫酶複合體El-α亞基蛋白的突變是 ρ·Tyrl31Cys〇
2. 權利要求1的生物標記物，所述生物標記物還包括EX2-4DUP。
3. 權利要求1或2的生物標記物，所述突變BCKDHA基因為SEQ ID NO: 1的序列中具有 以下突變： c.392A>G。
4. 一種檢測受試者的BCKDHA基因和/或支鏈α -酮酸脫氫酶複合體El- α亞基蛋白 中是否存在突變位點以及拷貝數變異的方法，所述突變位點以及拷貝數變異選自如下任一 種或其組合： BCKDHA基因突變c. 392A>G，支鏈α -酮酸脫氫酶複合體El-α亞基蛋白突變 ρ·Tyrl31Cys ;和 EX2-4DUP。
5. 權利要求4的方法，包括如下至少一組引物擴增的步驟： SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 ; SEQ ID NO:5 至 SEQ ID NO:10。
6. 檢測突變BCKDHA基因和/或支鏈a-酮酸脫氫酶複合體El-α亞基蛋白中使用的 引物對，所述突變是選自如下任一種或其組合： BCKDHA基因突變c. 392A>G，支鏈α -酮酸脫氫酶複合體El-a亞基蛋白突變 ρ·Tyrl31Cys ;和 EX2-4DUP, 其中所述引物對分別基於選自如下的位鉻在基因組序列或cDNA序列上前後設計，使 得擴增該位鉻：BCKDHA基因 cDNA序列第392位。
7. 與突變BCKDHA基因互補的核酸探針，所述突變是選自如下任一種或其組合： BCKDHA 基因突變 c. 392A>G， 所述探針與突變BCKDHA基因的互補區包括選自如下的基因組序列或cDNA序列上的位 鉻：BCKDHA基因 cDNA序列第392。
8. 檢測突變BCKDHA基因和/或支鏈α-酮酸脫氫酶複合體El-a亞基蛋白的試劑盒， 包含一組或多組引物對，並且/或者包含一個或多個核酸探針，其中所述突變是選自如下 任一種或其組合： BCKDHA基因突變c. 392A>G，支鏈α -酮酸脫氫酶複合體El-a亞基蛋白突變 ρ·Tyrl31Cys ;和 EX2-4DUP, 其中所述引物對分別基於選自如下的位鉻在基因組序列或cDNA序列上設計，使得其 擴增產物涵蓋該位鉻：BCKDHA基因 cDNA序列第392位。
9. 權利要求8的試劑盒，所述引物對選自如下的一組或兩組： SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 ; SEQ ID NO:5 至 SEQ ID NO:10。
【文檔編號】C12Q1/68GK104099349SQ201310118898
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月8日 優先權日:2013年4月8日
【發明者】魏曉明, 朱倩 申請人:深圳華大基因科技有限公司