上皮幹細胞的擴展方法

2023-05-30 16:04:01

專利名稱：上皮幹細胞的擴展方法
技術領域：
本發明涉及上皮幹細胞和角膜緣幹細胞缺損以及，更具體的說，涉及這種上皮幹細胞缺損問題中的治療或移植方法，例如重建角膜表面。
當角膜緣缺損是單側或非對稱性的雙側時，建議施用自體角膜緣組織移植術。對自體角膜緣移植方法的主要的擔憂是一個或兩個角膜緣的移植物-不得不取自健康的其它眼睛的角膜要跨越2到3個小時的範圍。已經有報導描述了供體眼睛的潛在的併發症。對兔子的實驗也說明如果先移走角膜緣接著從供體眼中隨後移走中央上皮角膜，就會發生角膜緣缺損。Pellegrini等，柳葉刀1997；349990-993，報導了為了給兩個角膜緣完全缺損的患者重建角膜表面，在3T3成纖維細胞飼養層上擴展移植的角膜上皮細胞層。
最近，Kim和Tseng，Cornea 1995；15473-84已經說明了用羊膜移植作為底物替代在重建角膜緣幹細胞完全缺損的兔子角膜表面中是有效的。

發明內容
本發明的一個實施例中，從健康眼取的一小塊角膜緣生物活組織的角膜緣幹細胞和上皮細胞，在培養基中在一個特殊處理過的羊膜上擴展。用這種羊膜作為底物有助於修復沒有炎症的角膜緣基質並擴展角膜緣幹細胞群和上皮幹細胞群。所得到的「產品」可以作為移植物被移植到剝落的角膜表面，接著進行角膜切除術以去除維管組織內生長。對於除了眼睛以外的被破壞的部分，健康上皮細胞的生物活組織來自具有相同或相近的生物/組織特性-即同損壞區具有組織相容性的鄰近組織區域。
優選的實施方案角膜緣活組織檢測在健康眼上進行，它可能是患者的另外一隻眼睛或者來自於另一個生命個體的眼睛。用Betadine(聚維酮碘)對眼瞼消毒。在滅菌條件下，用No.66 Beaver刀片(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)通過片狀角膜切除術從角膜緣分離並從表面角膜基質中切除含有上皮細胞和部分角膜基質組織的1到2mm2角膜緣組織。將該組織放置在一個含有1.5ml培養基的35mm的培養皿上，每毫升培養基含有DMEM(Dulbecco′s改進的Eagle′s培養基)以及Ham′s F12(比率1∶1)，添加0.5％DMSO(二甲基亞碸)，2ug小鼠EGF(上皮生長因子)，1ug牛胰島素，0.1ug霍亂毒素以及5％胎牛血清並迅速將其放置在實驗室的滅菌的、層流罩超靜臺中培養。
根據Tseng SCG在Am.J.Opthalmol 1997；124765-774和Tseng的美國專利6,452,142中的報導獲得、處理並保存用作培養體系的羊膜(購自Bio Tissue，Miami，F1.)，文中的教導在此引入。使用前，將基膜朝上的羊膜平滑地附著到培養平皿上並於37℃和5％CO2以及95％空氣中，在潮溼的恆溫箱中過夜。根據前面的描述加上一些改進，進行角膜緣外植體培養(Tsai和Tseng，Invest Opthalmol Vis Sci 1988；2997-108；和Tsai等.，Invest Opthalmol Vis Sci 1994；353865-2875)。帶有上皮幹細胞的角膜外植體被種植/轉移到含有1ml上述培養基的35mm平皿中的羊膜的基膜側面上，以替代這些參考中所教導的轉移到塑料基質上。為了重建角膜，每兩天更換一次培養基，並將培養物保持2到3星期以使上皮幹細胞生長並且擴展形成直徑約為2到3釐米的覆蓋範圍。對其它組織的修復，如果需要，可以或多或少地使用上皮幹細胞層區。
繼續角膜修復的實施例，接著角膜緣的外周切割術，去除眼前結膜下疤痕和發炎的組織使鞏膜裸露出來。利用No.57和66 Beaver刀片通過片狀角膜切除術去除角膜維管組織，手術方式和為同種移植角膜緣移植術所描述的(Tsai和Tseng Cornea 1994；13389-400)相似。對於那些有部分到完全形膜緣損壞但是具有正常的中央角膜的患者，則用培養的帶有羊膜的角膜緣幹細胞作為切割角膜緣移植物，或者角膜緣等價物，根據受試者眼睛的尺寸進行精加工，並移植到相應的受試角膜緣區(從90度到360度)。對於那些角膜緣和角膜表面完全損壞的患者，這種新的移植物被用作一個完整的片狀角膜組織，或者角膜緣角膜等價物，並用片狀角膜成形術移植以覆蓋整個區域。
在處理過的羊膜基質上培養的合適大小的上皮幹細胞層的上皮側向上附著並覆蓋到整個缺損上，這可以通過螢光染色或者鬆弛附著的原始外植體容易地鑑定。然後將移植物固定在損壞部位。對於損壞的角膜，可以通過角膜側面上間斷的10-0尼龍縫線固定，以及用間斷的8-0Vicryl縫線固定有鞏膜支抗的周圍結膜邊緣。在整個過程中，要通過覆上透明質酸鈉(透明質酸鹽)Healon(Pharmacia Upjohn AB，Uppsala，瑞典)來防止培養的上皮幹細胞層暴露、乾燥以及擦傷。在手術的最後，可以從羊膜去除原始的外植體組織。如果該移植物在角膜之上，就將眼睛壓貼過夜，第二天放上一個治療用接觸透鏡，過一個星期；第一周每天四次局部施用1％氫強的松醋酸鹽溶液，後兩周每天兩次，接著根據手術部位周圍結膜發炎的嚴重程度每天施用兩次0.1％氟米龍2到3個月。
如上所述，在特別處理的羊膜的基膜側面上培養外植體。兩到三周後，上皮幹細胞在羊膜上生長形成了2到3cm2大小的薄層。平板封固製備物顯示幹細胞層對PAS和Alcian藍染色顯示陰性；並且裸露的羊膜被染成紫色。組織學檢測說明上皮層是由其邊緣的4到5層幹細胞層和在邊緣和原始外植體組織區域之間1到4個細胞層組成的。超微結構檢測顯示存在有廣泛且鬆散的細胞間隙和基質膜結構，在基底細胞-羊膜結合處有電子密集基質的聚集。
關於本發明治療眼睛的一個具體的實施方案，根據Snellen視力表顯示在隨後的平均(±SD)14.8±1.9個月期間有不同程度的視力改善。在2到4天內所有的眼睛顯示出了完全的上皮再生，平均周期(±SD)為2.7±0.8天。重建的角膜表面在1到2周內顯示出炎症和血管化的消退。手術一個月後，角膜的澄清度改善並且光滑而溼潤。
根據角膜緣的損壞面積，培養的上皮幹細胞在經特殊製備的羊膜基質上擴展，可以用其作為角膜緣的等價物或角膜緣-角膜等價物。
為了移植而去除了一片相當大的角膜緣而造成的供體眼睛的角膜緣缺損已經在兔子中有報導。因此，本發明的這種新方法和所得到的移植物實質上減少了供體眼潛在的併發症，這是因為僅僅去除了一小片角膜緣。而且，這種方法可以用於非對稱性的兩側角膜緣缺損。在特別預處理的羊膜上來自體內的自體上皮幹細胞的擴展提供了在2到3周內用於移植手術的充足的上皮幹細胞。對於雙側角膜緣完全缺損的患者，應當按照本發明考慮使用相匹配的來源、另一個生命體以及親屬個體的角膜緣。
將以獨特預處理的羊膜作為基底的自體上皮幹細胞用於移植也提供了所有羊膜移植術所固有的有益效果，包括有利於上皮形成，減少炎症和疤痕，以及當下面的基質組織被破壞時可替換基質。最重要的是，按照Tseng預處理的羊膜為要保存和擴展的上皮幹細胞提供了天然基質，形成了角膜重建所必需的自體細胞群。此外，因為僅僅是自體細胞被移植，在移植手術後不需要免疫抑制。對於以這種方式進行的同種異體幹細胞移植，排斥率應當減少，這是由於僅僅移植了上皮幹細胞而沒有其它類型的細胞。
正如上面闡明的，這種獨特的移植和其形成的方法，是通過利用特殊處理的羊膜，擴展其上來自外植體的上皮幹細胞，這在眼科手術以外也有用途，例如，皮膚燒傷部位的修復；尤其是當必須使供體部位的外植體較小時。同樣，從小的外植體得到的生物活組織不一定是角膜緣組織。外植體將具有健康組織，含有上皮幹細胞並且同要移植的受試部位有組織相容性。如果生物活組織不能來自同受試部位相同的身體部分，可以選擇相應的類似的身體部分作為外植體；正如在優選的實施例中的情況，損壞的眼睛是受試部位而另外的眼睛-健康的眼睛-提供供體外植體。
應當認為一種獨特的並且有創造性的外科移植物及其外科移植手術方法已經被充分公開，並且對於本領域技術人員來說不需要充分的試驗過程就可以實施，對於在本發明權利要求所定義的精神和範圍內進行的改進也是如此。
權利要求
1.一種施用到受試部位的外科移植物，所述的移植物含有羊膜和在所述羊膜上擴展的上皮幹細胞。
2.根據權利要求1的外科移植物，其中所述的羊膜具有一個基膜側面；並且所述的上皮幹細胞在所述的基膜側面上擴展。
3.根據權利要求1的外科移植物，其中所述的羊膜具有一個基質側面，該基質側面施用到受試部位的所述移植物的側面。
4.根據權利要求1的外科移植物，其中在健康眼睛上進行的角膜緣生物活組織檢測得到的角膜緣組織是所述上皮幹細胞的來源。
5.根據權利要求4的外科移植物，其中所述的角膜緣組織是自體的。
6.根據權利要求4的外科移植物，其中所述的角膜緣組織是異體的。
7.根據權利要求6的外科移植物，其中所述的角膜緣組織來自屍體。
8.根據權利要求4的外科移植物，其中所述的角膜緣組織的表面積大約為1-2mm2。
9.根據權利要求1的外科移植物，其中所述的羊膜具有一個基膜側面；並且在所述羊膜的基膜側面上來自體內地培養所述的上皮幹細胞。
10.根據權利要求9的外科移植物，其中所述的上皮幹細胞源自在培養基中處理過的組織並且接著轉移到所述羊膜上。
11.根據權利要求10的外科移植物，其中所述的羊膜具有細胞和完整的細胞外基質；並且在所述來自體內的培養之前，殺死所述膜的細胞，但是保持所述細胞外基質的完整性。
12.根據權利要求11的外科移植物，其中所述的擴展的上皮幹細胞具有作為其原始角膜緣外植體的來自健康眼睛的組織。
13.根據權利要求12的外科移植物，其中受試部位是眼睛；並且在所述移植物施用給受試部位後，所述的角膜緣外植體組織不要求成為移植物的一個組成部分。
14.根據權利要求12的外科移植物，其中所述的移植物是用於具有部分到全部角膜緣損壞而中央角膜正常的受試部位的切割角膜緣移植物。
15.根據權利要求12的外科移植物，其中所述的移植物是用於角膜緣和角膜表面完全損壞的受試部位的一個完整的片狀角膜組織。
16.根據權利要求1的外科移植物，其中所述的上皮幹細胞的來源為來自與受試部位相應的生物和組織相容性的取自健康部位的生物活組織。
17.一種用於損壞的受試部位的外科移植物的製備方法，所述的方法包括的步驟是a)從健康供體部位獲得生物活組織，所述的生物活組織含有上皮幹細胞；b)將所述的生物活組織作為外植體放置於羊膜上；以及c)使所述的上皮幹細胞在所述的羊膜上擴展。
18.根據權利要求17的方法，其中所述的羊膜具有一個基膜側面；並且所述的放置於羊膜上的步驟包括將所述的外植體封固到所述羊膜的基膜側面。
19.根據權利要求18的方法，其中所述的封固使得所述擴展的上皮細胞定位朝向有關被損壞的受試部位。
20.根據權利要求17的方法，其中所述的獲得生物活組織的步驟包括；對健康眼睛實施角膜緣活組織檢測。
21.根據權利要求20的方法，其中所述的實施步驟是在同種異體眼睛上進行。
22.根據權利要求17的方法，其中所述獲得的生物活組織來自組織相容的供體部位。
23.根據權利要求17的方法，其中使所述的上皮幹細胞在所述的羊膜上擴展的步驟包括在所述放置於羊膜上的步驟前在培養基中培養所述的外植體。
24.根據權利要求23的方法，其中所述的培養步驟是來自體內的。
25.根據權利要求17的方法，其中所述的羊膜具有細胞和細胞外基質；並且其中所述的使上皮幹細胞在所述的羊膜上擴展的步驟包括，在所述的放置於羊膜上的步驟之前殺死所述羊膜的細胞，但保持其細胞外基質。
26.根據權利要求17的方法，其中使上皮幹細胞在所述的羊膜上擴展的步驟包括培養所述帶有外植體的羊膜一段足夠的時間以使所述上皮幹細胞擴展到直徑為2到3釐米的範圍。
27.根據權利要求26的方法，其中所述的培養包括利用大約每兩天更換的培養基培養三個星期。
28.根據權利要求17的方法，包括在將所述移植物用外科手術固定在受試部位之後從所述的羊膜去除所述的外植體。
全文摘要
上皮幹細胞移植術，在特別處理過的羊膜上來自體內地培養上皮幹細胞，同羊膜一起回收具有擴展的上皮幹細胞的外科移植物。製備這種移植物的方法以及移植物本身提供了簡單而有效的方法以重建損壞的組織，一個優選的實施例是角膜組織。上皮幹細胞的來源可以是來自健康的自體和同種異體組織的生物活組織的一小塊外植體。處理羊膜殺死細胞但使細胞外基質保存下來。
文檔編號A61L27/38GK1426289SQ01808164
公開日2003年6月25日 申請日期2001年4月25日 優先權日2000年4月27日
發明者雷·瑞芳·蔡 申請人:雷·瑞芳·蔡, 傑夫·垂拱·曾