製備分析用生物樣品的方法和設備的製作方法
2023-05-30 16:00:36 3
專利名稱：製備分析用生物樣品的方法和設備的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種製備分析用生物樣品的方法，以及實現上述製備分析用生物樣品的方法的設備。
自從人類基因組和其它物種基因組的排序完成以後，在特定細胞或組織的樣品內進行蛋白質的定性或定量分析在研究和工業上變得越來越重要。
關於蛋白質的化學分析方法，當代所謂大規模蛋白質化學分析(proteomics)方法是很有名地。該方法基於特定細胞或組織樣品的分解，藉助不同試劑對蛋白質進行提取和變性，以及單體蛋白質藉助於例如二維平面凝膠電泳方法的分解。以充足的數量和尺寸存在於原始蛋白質混合物內，並具有適當的移動能力的每個單體蛋白質顯示其作為一個墨點在與尺寸及淨電荷相關的特殊位置存在於凝膠內。在已知的蛋白質研究的實際工作中，多達幾千的蛋白質以這種方式從樣品中分離。基於組織不同狀態的比較，理論上有可能在合適軟體的幫助下藉助單個凝膠的疊加來測定蛋白質表達式的差異，該疊加的位置是準確的。特別是，在此過程中藉助位置比較，識別最新表述蛋白質及不再表述或已經表述蛋白質應該是可能的。
在每天的實際分析工作中，仍有關於上述目的的重大局限性。例如，已知的分析方法顯示出有限的再現性，因為自動化程度不足，在單體分析步驟中有很多不準確。關於單體蛋白質的位置，結果例如偏離多達幾個百分數。至於蛋白質的相應數量結果偏離多達二十個百分數。
除了在技術上完成已知方法有困難外，其動力病原論也不充分，即極罕見的蛋白質不能與頻繁出現的蛋白質並排地顯示。這些局限性使其不能藉助於依賴單體蛋白質可再現位置的適當軟體通過自動方式比較例如大量的凝膠。彼此輕微偏離的單體蛋白質墨點的位置增加了比較分析的不確定性。然而在蛋白質化學分析(proteome)研究中，仍然依賴於大量細胞組織的比較，所以前述已知方法的局限性是不能容忍的。
已知分析方法的變異或不準確及有限的再現性的一個重要原因是因為非標準化的樣品製備。
因而本發明的一個目的是進一步研究並獲得一種用於製備分析用生物樣品的方法，它能保證均一性及標準化，並可用於完全自動化的樣品製備。
此外，本發明的一個目的是提供一種用於實現製備分析用生物樣品的新方法的相應設備。
上述目的通過具有權利要求1特徵的方法及具有權利要求11特徵的設備獲得。
最佳實施例在從屬權利要求中被描述。
在根據本發明的用於製備分析用生物樣品的方法中，下述步驟被執行a)將生物樣品放置在二維載體上；b)在第一溫度T1時，將蛋白質沉澱或變性用的第一溶液L1添加到生物樣品和載體上，並保持預定的第一時間段Z1；c)在第二溫度T2時，留下蛋白質沉澱或變性用溶液L1或添加更多的蛋白質沉澱或變性用溶液L1，或添加第二種蛋白質沉澱或變性用溶液L2至該生物樣品和載體上，並保持預定的第二時間段Z2，其中T2比T1溫度低，且Z2長於、等於或短於Z1；d)乾燥樣品。通過根據本發明的用於製備樣品的方法，能夠保證均一、高標準的樣品被製備，並且相應地產生均一的樣品。因此，有可能藉助相應的電腦程式，將被分析和檢查的蛋白質以一種更好的方式被識別和檢定。測量結果顯示蛋白質識別的錯誤可能性減小了3至4個係數。此外，蛋白質自動識別的數量增加了至少16％。最後，製備樣品的新方法使採樣能完全自動化，因此有可能比較不同實驗室間的量化結果。
根據本發明方法的最佳實施例，樣品的乾燥發生在作為工藝步驟a1的工藝步驟a)和b)之間和/或作為工藝步驟b1的工藝步驟b)和a)之間。結果顯示要被檢測的生物樣品發生了進一步的均一化和濃縮，由此，根據工藝步驟a1)、b1)或d)的乾燥能夠藉助空氣或真空乾燥而發生。
根據本發明方法的又一最佳實施例，樣品在工藝步驟a)或a1)之後被冷凍，這作為步驟b2)。這種方式也更有利於獲得均一的蛋白質濃度和更穩定的蛋白質沉澱物，生物樣品可能是細胞或組織樣品或蛋白質與核酸的混合物或是含有蛋白質和/或碳水化合物和/或脂肪和/或核酸的高分子混合物。
根據本發明方法的另一最佳實施例，溶液L1和/或L2是有機溶劑和/或具有臨界PH值的溶液和/或具有臨界離子濃度的溶液和/或鹽溶液和/或含有金屬離子的溶液。因為隨著根據本發明製備樣品的方法的實現，有機溶劑甲醇、乙醇、丁醇和丙酮被證明特別有利。苦味酸、鞣酸、鎢酸、鉬酸、三氯乙酸、高氯酸和磺基水楊酸的溶解鹽被專門用作鹽溶液。-10℃到60℃的範圍已被證明是有利的溫度範圍T1。
根據本發明方法的另一最佳實施例，生物樣品在工藝步驟d)之後經受蛋白質和/或核酸測定方法和/或蛋白質化學分離方法和/或用於細胞結構的原位分析方法。
根據本發明用於完成上述製備分析用生物樣品的方法的設備顯示有至少一個腔，其用於容納樣品，或添加在至少一載體上的樣品，並且有至少一個溫度控制器，其用於控制和調節腔內的溫度。這有利地保證了將被處理的生物樣品在腔室內暴露於不同的溫度範圍。
在根據本發明設備的最佳實施例中，具有連續的前後設置的多個腔。但是，也有可能具有多個上下設置的腔，或具有至少一個設置在單個腔內的分隔壁。形成多腔室的結果是有可能便於給每個腔室分配一相應的溫度範圍或另一反應範圍。這就提高了樣品的處理量，因為例如不需要對單個腔室進行冷卻或加熱以獲得不同的溫度範圍。
根據本發明設備的另一最佳實施例，在一個或多個樣品載玻片上設置有多個載體。這也導致了樣品處理量的顯著提高，通過根據本發明的設備，由人工、半自動或自動操作執行和控制單個工藝步驟是可能的。
本發明進一步的細節、特徵和有益效果可從下述實施例及附圖中得到理解，其中
圖1是根據本發明第一實施例所述設備的示意圖，該設備用於完成製備分析用生物樣品的方法；圖2是根據圖1所述設備的示意圖，且樣品載波片已送入第一腔；
圖3是據圖1所述設備的示意圖，且樣品載波片已位於第二腔內；圖4是所述設備的示意圖，該設備用於完成根據本發明第二實施例的製備分析用生物樣品的方法；圖5是根據圖4所述設備操作原理的示意圖。
圖1是實現製備分析用生物樣品的方法的設備10的示意圖，所述設備具有位於室22內的第一腔12和第二腔20。具有多個載體24的樣品載波片26通過軌道28、30滑進及滑出第一腔12和第二腔20，生物樣品添加在載體上，樣品載波片26的運動是通過第一馬達32實現的。
還可以看出，室22或第一腔12能夠藉助蓋36關閉。第一腔12還裝備一真空泵16和用於引入使蛋白質沉澱或變性的各種溶液L1、L2、Ln的幾個連接件，該連接件被設計成使溶液能夠流入或流出腔12、20。還可以看出，第一腔12與第二腔20通過一可移動的分隔壁18分隔。分隔壁18的移動由第二馬達34控制。在第二腔20區域內設置一溫度控制器14』，其用於控制腔12、20內的溫度。可選擇地，一相應的溫度控制器14」也被設置在第一腔12內，腔12、20內的溫度有可能設定在-10℃至60℃溫度範圍內。除了上述自動或機動地移動分隔壁18外，當然其也能由手動實現。
但是可以設想，可以僅用一個腔(未顯示)代替兩個腔12、20。
在下文中，所述第一實施例的操作原理將藉助圖1至3被詳細描述。
設備10在全自動控制情況下，第一馬達32在程序控制時間段Z1、Z2內將載波盒26從第一腔12移至第二腔20並從第二腔20移回至第一腔12，上述工序重複很多次是有可能的。通過起動真空泵16，根據分隔壁18的位置，能夠在腔12內或在兩個腔12、20內產生真空，以用於乾燥載體24上的樣品或樣品載波片26上的樣品。經過必要的修正，溶液L1、L2、Ln經抽吸用於供應和排除與此同理。此處，同樣根據分隔壁1 8的位置，僅有第一腔12或兩個腔12、20都能充滿相應的溶液L1、L2、Ln並排空。
在第一工藝步驟a)，生物樣品被添加到二維載體24上。該生物樣品通常是細胞或組織樣品或蛋白質混合物或核酸或包含蛋白質和/或碳水化合物和/或脂肪和/或核酸的高分子混合物。用於細胞培養的細胞例如能容納在緩衝劑內，細胞密度被設定為如3×108個細胞。但是，對於低溫箱，也可能使用組織切片作為樣品。細胞數量或組織切片數量的選擇依賴於目的，即生物樣品在樣品製備完成後被提供的其它方法。這通常是蛋白質-和/或核酸測定方法和/或蛋白質-化學分離方法和/或用於細胞結構的原位分析方法。溶解在緩衝劑內的細胞被吸液管均勻地加入載體24內。或者，一個或多個組織切片被放在載體24上。根據樣品載波片26的尺寸，因而有可能接受多個載體24。在樣品載波片26送入設備10之前，分隔壁18被拉向外，於是第二腔20變得可從設置在其上的第一腔12出入。第二腔20隨後充滿第一蛋白質沉澱或變性溶液L1以正好到頂腔邊緣下。此處所描述的實施例中，第一溶液L1包括有機溶劑，如甲醇、乙醇、丁醇或丙酮。但是對於溶液L1和L2，也可能不僅包括有機溶液，而且包括具有臨界PH值的溶液和/或具有臨界離子濃度的溶液和/或鹽溶液和/或含金屬離子溶液，所述鹽溶液有可能含有溶解有苦味酸、鞣酸、鎢酸、鉬酸、三氯乙酸、高氯酸或磺基水楊酸的鹽。
在下一個工作步驟中，分隔壁18被推回起始位置，即進入將第一腔12與第二腔20分開的最終位置。接著，載波盒26放入設備10的軌道28、30並被送入第一腔12。設備10的蓋36也被關閉。接著，在下一個工作步驟中，通過真空泵16在第一腔12內生成真空。通過這種方式生物樣品根據步驟a1)被乾燥第一段時間。隨著乾燥工序a1)的完成，真空從第一腔12內排除。最後，第一腔12和第二腔20之間的分隔壁18再次移走，且載波盒26沉入充有第一溶液L1的第二腔20內。通過這種方式使蛋白質沉澱或變性的第一溶液L1在第一溫度T1時施加在生物樣品和載體24上，在此情況下，該第一溫度是室溫。通過與有機溶液L1的接觸，樣品中的蛋白質使得水從水化套中被提取。經過一預定時間段Z1後，該時間段例如是10秒，載波片26再次被推入腔12。這完成了工藝步驟b)。由於很短的暴露時間，所以僅有局部及輕微的水抽取，所以細胞內三維結構的蛋白質不受影響或僅受很小的影響。這樣蛋白質可以均勻地用於下一工藝步驟c)。在工藝步驟c)被執行前，分隔壁18再次被推回，於是兩個腔10、20被再次分隔。根據工藝步驟b1)，樣品現在通過真空泵16被再次乾燥。最後，隨著乾燥工藝的完成和真空從第一腔12內的排除，腔12、20之間的分隔壁18再次被移開。
在隨後的工藝步驟中，應用溫度控制器14』，腔10、20內的溫度被降低並設定在-20℃。由於生物樣品在第一腔12內被安排在有機溶劑L1的氣相中，根據工藝步驟b2)它們被冷凍。也有可能通過提供液態氮冷凍樣品。經過必要的修正，提供液態異戊烷在接近-130℃進行冷凍與此同理。其後，這些液體不得不再次從系統移走。在第二腔20內，由於其比冰點低很多，有機溶劑L1處於液態。特別是當丙酮被用作有機溶劑時。此後，帶有生物樣品的載波盒26降入第二腔20，於是根據工藝步驟c)，使蛋白質沉澱或變性的第一溶液L1在第二溫度T2下被再次施加到生物樣品和載體上。現在，樣品在第二腔20內保留一預定時間段Z2，如實施例所述，近似10分鐘。由於第一溶液L1在低溫T2的額外加入，細胞蛋白質的水套以平緩方式被原位抽取，因為準備的工藝步驟b)是均勻及完全的，所以已處理的生物樣品的蛋白質立體結構及蛋白質複合體被最大程度地維持。
此後，載波盒26再次送入第一腔12，分隔壁再次推入腔12、20之間並鎖定在該位置。在最後的工藝步驟d)中，將被製備好的樣品被乾燥。這是再次通過真空泵16進行的。但是，樣品的乾燥也有可能通過空氣乾燥。
設備10的實施例也允許不僅使用一種溶液L1，而且使用順次或同時充填並被抽吸走的多種溶液L2至Ln。
也可以省去設備10的分隔壁18。在此情況下，設備10僅包括一個腔12(未顯示)和一溫度控制器14』，腔12的上半部分被設想用於將通過抽吸而填充或除去的溶液L1、L2至Ln的氣相，下半部分被設想用於上述溶液的液相。整個工藝在預定時間段內被手動控制。對於這種型式的設備10，它也可能省去真空泵和馬達32、34。
此外，通過改變圖1至3中的設備10的腔12、20的高度，有可能使用不同的具有根據載體24的數量可變運載能力的載波盒26。這提高了能夠並行處理的樣品的數量。這樣，每個設備10例如可能同時處理10至50個樣品。也可能通過並行操作設備10提高要處理樣品的數量為任何數量。為此，單個真空泵16能被連接到使用相應連接件的多個設備10上。
圖4顯示了據第二實施例的用於實現製備分析用生物樣品的方法的設備的示意圖。能看出多個腔1，2，3…，n被連續設置，每個腔1，2，3…，n可以用相應的蓋D 1，D2，D3…，Dn關閉。
在下文中，此處顯示的第二實施例將根據其操作原理被詳細描述。樣品容納於其內的載波盒A或含樣品的載體被插入軌道B並設置於腔1上。此後，載波盒A降低進入腔1中，腔蓋D1藉助引導軌C被推到腔1上。接著，在腔1內產生真空。隨後真空乾燥工藝被完成，空氣充溢腔1，蓋D1移回其起始位置。載波盒A被升出腔1並回到引導軌B。當載波盒A移到腔2上時，它降入腔2中。蓋D2再次關閉腔2。在腔2內，使蛋白質沉澱或變性的第一溶液L1根據工藝步驟b)被添加。樣品載波片A從腔2移開後，樣品A相應地降入腔3中，根據工藝步驟b1)，樣品在腔3內乾燥。腔4用於完成工藝步驟c)，即，使蛋白質沉澱或變性的溶液在第二溫度T2時的再次添加，該溫度T2低於第一溫度T1，在本實施例中，溫度T1已在腔2中佔優勢。在所示的設備中，腔5用作根據步驟d)的使樣品進一步乾燥的真空腔。所有的其它腔都用於樣品的進一步處理。例如在腔6中，緩衝劑或第二溶液L2被加入樣品。經過必要修正，這同樣適用於具有其它緩衝劑溶液或其它使蛋白質沉澱或變性的溶液的腔7至9。此外，可以設計腔用於一個周期之後樣品的保存。並且，腔能夠包括一所謂的「細胞/組織取樣器」，它從試管或離心管內的載體上接受已處理過的樣品。
能夠看出，圖1至3中顯示的設備10內的同樣的工作步驟能通過根據第二實施例的線性設備完成。但是，每種反應在專門用於每種反應的單個腔1，2，3…，n內執行(參照圖5)。
在另一個未顯示的實施例中，設備的每個腔還能被設置為所謂圓盤傳送帶內的一個圓。
權利要求
1.一種製備分析用生物樣品的方法，其包括如下步驟a)將生物樣品放置在二維載體上；b)在第一溫度T1下將蛋白質沉澱或變性用第一溶液L1添加到生物樣品和載體上，並保持預定的第一時間段Z1；c)在第二溫度T2下，留下蛋白質沉澱或變性用溶液L1或添加更多的蛋白質沉澱或變性用溶液L1，或添加蛋白質沉澱或變性用溶液L2至生物樣品和載體上，並保持預定的第二時間段Z2，其中T2比T1溫度低，且Z2長於、等於或短於Z1；d)乾燥樣品。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於樣品的乾燥發生在作為工藝步驟a1的工藝步驟a)和b)之間和/或作為工藝步驟b1)的工藝步驟b)和c)之間。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於樣品的乾燥藉助空氣或真空乾燥而進行。
4.如上述權利要求中任一權利要求所述的方法，其特徵在於樣品在工藝步驟b)或b1)之後被冷凍，這作為步驟b2)。
5.如上述權利要求中任一權利要求所述的方法，其特徵在於所述生物樣品是細胞或組織樣品或蛋白質與核酸的混合物或是含有蛋白質和/或碳水化合物和/或脂肪和/或核酸的高分子混合物。
6.如上述權利要求中任一權利要求所述的方法，其特徵在於溶液L1和/或L2是有機溶劑和/或具有臨界PH值的溶液和/或具有臨界離子濃度的溶液和/或鹽溶液和/或含有金屬離子的溶液。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於所述有機溶劑是甲醇和/或乙醇和/或丁醇和/或丙酮。
8.如權利要求6所述的方法，其特徵在於所述鹽溶液包括苦味酸和/或鞣酸和/或鎢酸和/或鉬酸和/或三氯乙酸和/或高氯酸和/或磺基水楊酸的溶解鹽。
9.如上述權利要求中任一權利要求所述的方法，其特徵在於T1覆蓋了-10℃到60℃的溫度範圍。
10.如上述權利要求中任一權利要求所述的方法，其特徵在於生物樣品在工藝步驟d)之後經受蛋白質和/或核酸測定方法和/或蛋白質化學分離方法和/或用於細胞結構的原位分析方法。
11.如上述權利要求中任一權利要求所述的用於執行分析用生物樣品製備方法的設備，其特徵在於設備(10)包括至少一個腔(12，20)，其用於容納生物樣品，或添加在載體(24)上的樣品，並包括至少一個溫度控制器(14』，14」)，其用於控制和調節腔(12，20)內的溫度。
12.如權利要求11所述的設備，其特徵在於所述腔(12)被蓋(36)封閉。
13.如權利要求11或12所述的設備，其特徵在於所述設備(10)包括至少一個真空泵(16)，以便在腔(12，20)內產生真空。
14.如權利要求11、12或13所述的設備，其特徵在於所述腔(12，20)內設置有至少一個分隔壁(18)。
15.如權利要求14所述的設備，其特徵在於所述分隔壁(18)能被手動或自動地移走或移動。
16.如權利要求11至15中任一權利要求所述的設備，其特徵在於多個腔(1，2，3…，n)被順序地前後設置。
17.如權利要求11至15中任一權利要求所述的設備，其特徵在於多個腔(12，20)被上下設置。
18.如權利要求11至17中任一權利要求所述的設備，其特徵在於多個載體(24)被設置在一個或多個樣品載波片(26)上。
19.如權利要求11至18中任一權利要求所述的設備，其特徵在於每個工藝步驟被設備(10)手動、半自動或全自動地執行和控制。
全文摘要
本發明涉及一種製備分析用生物樣品的方法，其包括如下步驟a)將生物樣品放置在二維載體上；b)在第一溫度T1時，將蛋白質沉澱或變性用的第一溶液L1添加到生物樣品和載體上，並保持預定的第一時間段Z1；c)在第二溫度T2時，留下蛋白質沉澱或變性用溶液L1或添加更多的蛋白質沉澱或變性用溶液L1，或添加第二種蛋白質沉澱或變性用溶液L2至生物樣品和載體上，並保持預定的第二時間段Z2，其中T2比T1溫度低，且Z2長於、等於或短於Z1；d)乾燥樣品。本發明還涉及一種用於完成上述製備分析用生物樣品的方法的設備，與前述權利要求中的一個相一致，該設備(10)包括有至少一個腔(12)，其用於容納生物樣品或添加在至少一載體上的樣品，還包括至少一個溫度控制器(14)，其用於控制和調節腔(12)內的溫度。
文檔編號G01N33/48GK1507559SQ03800084
公開日2004年6月23日 申請日期2003年1月15日 優先權日2002年1月22日
發明者瓦爾特·舒伯特, 瓦爾特 舒伯特 申請人:瓦爾特·舒伯特, 瓦爾特 舒伯特