一種製備胰島素分泌細胞的方法及其專用培養基組合物的製作方法

2023-05-31 06:46:01

專利名稱：一種製備胰島素分泌細胞的方法及其專用培養基組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種製備胰島素分泌細胞的方法及其專用培養基組合物。
背景技術：
"糖尿病"是一種血液中的葡萄糖容易堆積過多的疾病。國外給它的別名叫"沉默的殺手"(Silent Killer)，特別是"成人型糖尿病"，四十歲以上的中年人染患率特別高，在日本，四十歲以上的人口中佔10%，即十人當中就有一位"糖尿病"患者。一旦患上"糖尿病"，將減少壽命十年之多，且可能發生的併發症遍及全身。多年來，醫學界一直致力於對糖尿病的研究。這是因為一旦患上「糖尿病」，人體的麻煩隨其而至，因為免疫功能減弱，容易感染由感冒、肺炎、肺結核所引起的各種感染疾病，而且不易治癒。並且選擇性地破壞細胞，吞噬細胞。抗癌細胞的防禦機能會大大減弱，至使癌細胞活躍、聚集。難怪有這樣的說法，一旦得了「糖尿病」，壽命減去十多年。因此許多人對糖尿病談之而色變，千方百計的治療。糖尿病(Diabetes)分I型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊類型的糖尿病。在糖尿病患者中，2型糖尿病所佔的比例約為95 %。胰島素是人體胰腺B細胞分泌的身體內唯一的降血糖激素。胰島素是由胰島3細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質激素。胰島素是機體內唯一降低血糖的激素，同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成。外源性胰島素主要用來糖尿病治療，糖尿病患者早期使用胰島素和超強抗氧化劑如(注射用硫辛酸、口服蝦青素等)有望出現較長時間的蜜月期，胰島素注射不會有成癮和依賴性。幹細胞是一種具有自我更新能力和多系分化潛能的原始細胞，是細胞移植的理想細胞。在個體發育過程中 ，存在各種形式的幹細胞，如胚胎幹細胞，多能幹細胞以及各種組織中的定向幹細胞如造血幹細胞、神經幹細胞等。但在實際應用上卻面臨倫理的挑戰或取材的限制。間充質幹細胞(MSC)是存在於人體組織中具有多系分化潛能的一種亞全能幹細胞群，因其在特定環境下可誘導分化為多種組織細胞，且具有免疫源性低，移植後能形成穩定嵌合等特點，故可作為一種理想的供異基因移植的細胞。因為MSC亞全能幹細胞可獲得向內胚層組織分化的潛在能力，容易取材，來源更為豐富且不受倫理限制及沒有成瘤危險，所以使用間充質幹細胞體外誘導獲得胰島素分泌細胞在臨床上具有更高的應用價值。

發明內容
本發明的目的是提供一種製備胰島素分泌細胞的方法及其專用培養基組合物。本發明提供了一種將間充質幹細胞誘導為胰島素分泌細胞的培養基組合物(培養基組合物甲)，由培養基A、培養基B和培養基C組成；所述培養基A由動物細胞基礎培養基和溶質組成；所述溶質及其在所述培養基A中的濃度如下-A.75ml/L-5.25ml/L 胎牛血清和 4.75ng/mL_5.25ng/mL activin A ；所述培養基B由動物細胞基礎培養基和溶質組成；所述溶質及其在所述培養基B 中的濃度如下:0.95 X 10 5mol/L_l.05 X 10 5mol/L 維甲酸、19ng/ml_21ng/ml EGF> 19ng/ml-21ng/ml bFGF、l.9mmol/L-2.lmmol/L 穀氨酸胺、體積濃度為 0.95 % -1.05% 的非必需胺基酸和體積濃度為1.9% -2.1%的B27 ；所述培養基C由動物細胞基礎培養基和溶質組成；所述溶質及其在所述培養基 C 中的濃度如下-A.5ml/L-5.5ml/L 月臺牛血清、19ng/ml_21ng/ml exendin_4、9.5ng/ml-10.5ng/ml activin A、9.5mmoI /1,-10.5mmol/L 尼克酸胺、體積濃度為 1.9% -2.1 的B27和體積濃度為0.95% -1.05%的N2。所述動物 細胞基礎培養基為高糖DMEM培養基或DMEM/F12培養基。所述培養基A由高糖DMEM培養基和溶質組成；所述溶質及其在培養基A中的濃度如下:5ml/L胎牛血清和5ng/mL activin A。所述培養基B由DMEM/F12培養基和溶質組成；所述溶質及其在培養基B中的濃度如下:lCT5mol/L維甲酸、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、2mmol/L穀氨醯胺、體積濃度為I %的非必需胺基酸和體積濃度為2%的B27。所述培養基C由高糖DMEM培養基和溶質組成；所述溶質及其在培養基C中的濃度如下:5ml/L 胎牛血清、20ng/ml exendin-4、10ng/ml activin A、lOmmol/L 尼克醯胺、體積濃度為2 %的B27和體積濃度為I %的N2。所述B27為購自GIBCO公司，產品目錄號為17504-044的產品。所述N2為購自GIBCO公司，產品目錄號為17502-048的產品。所述非必需胺基酸為GIBCO公司，產品目錄號為11140的產品。維甲酸購自Sigma公司，產品目錄號為R2625。人活化素A(Activin A):英國PeproTech公司，產品目錄號為120-14。EGF(epidermal growth factor,表皮細胞生長因子):Pepro Tech 公司，產品目錄號為 100-15。bFGF(basic fibroblast growth factor,喊性成纖維細胞生長因子):Sigma公司，產品目錄號為F0291。exendin-4:Sigma公司，產品目錄號為E7144。本發明還提供了一種將間充質幹細胞誘導為胰島素分泌細胞方法，是將間充質幹細胞依次用所述培養基A、所述培養基B和所述培養基C進行培養，得到胰島素分泌細胞。所述方法可包括如下步驟:(I)將間充質幹細胞接種於所述培養基A中，培養4-6天(具體可為5天)；(2)將完成步驟⑴的細胞轉接於所述培養基B中，培養6-8天；(3)將完成步驟(2)的細胞轉接於所述培養基C中，培養7-10天(具體可為8天)，得到胰島素分泌細胞。所述步驟(I)中，所述間充質幹細胞在所述培養基A中的初始濃度可為2 X IO5個/ml-1 X IO6 個 /ml (具體可為 5 X IO5 個 /ml)。所述方法中，整個培養過程的培養條件可為:在37°C、50ml/L CO2、空氣相對溼度為95%的培養箱中培養。所述培養基組合物甲在將間充質幹細胞誘導為胰島素分泌細胞中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明還保護一種將限定性內胚層細胞誘導為胰腺幹細胞和/或胰腺祖細胞的培養基，為以上任一所述培養基B。所述培養基在將限定性內胚層細胞誘導為胰腺幹細胞和/或胰腺祖細胞中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明還保護一種將間充質幹細胞誘導為胰腺幹細胞和/或胰腺祖細胞的培養基組合物(培養基組合物乙)，由以上任一所述培養基A和以上任一所述培養基B組成。所述培養基組合物乙在將間充質幹細胞誘導為胰腺幹細胞和/或胰腺祖細胞中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明還保護一種將限定性內胚層細胞誘導為胰島素分泌細胞的培養基組合物(培養基組合物丙)，由以上任一所述培養基B和以上任一所述培養基C組成。所述培養基組合物丙在將限定性內胚層細胞誘導為胰島素分泌細胞中的應用也屬於本發明的保護範圍。以上任一所述的間充質幹細胞具體可為臍帶來源的間充質幹細胞。以上任一所述的間充質幹細胞具體可為人間充質幹細胞。以上任一所述的間充質幹細胞具體可為第3代間充質幹細胞。所述間充質幹細胞為細胞因子⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、Flk-1和HLA-ABC均為陽性，細胞因子⑶34、⑶106、⑶117和HLA-DR均為陰性的細胞。所述限定性內胚層細胞為Foxa2和Soxl7表達量高於所述間充質幹細胞的細胞。所述胰腺幹細胞和/或胰腺祖細胞為Pdxl、Ngn3和Pax4表達量高於所述間充質幹細胞的細胞。所述胰島素分泌細胞為Insulin、C-peptide和Glut_2表達量高於所述間充質幹細胞的細胞。`間充質幹細胞經過三步誘導法可在體外一次獲得限定性內胚層細胞，胰腺幹/祖細胞及胰島素分泌細胞，各階段細胞可表達相應的特異性基因，並且最後獲得的胰島素分泌細胞具有胰島素分泌功能及對葡萄糖的反應性。本發明的誘導培養方法，適合於各種組織來源的間充質幹細胞，該誘導培養方法無病毒導入、易操作、效率高。首先培養得到的限定性內胚層細胞表達限定性內胚層標誌Foxa2, Soxl7,獲得效率能夠達到90%以上；隨後培養得到的胰腺幹/祖細胞表達胰腺幹/祖細胞標誌Pdxl，Ngn3，Pax4，獲得效率能夠達到70%以上；最後培養得到的胰島素分泌細胞(表達B細胞標誌胰島素，C-肽)，獲得效率能夠達到95%以上，並且獲得的細胞在體外具有胰島素分泌功能及對葡萄糖的應答功能。本發明方法得到的胰島素分泌細胞可應用於體內治療糖尿病導致的胰腺損傷，重建胰島功能，為治療糖尿病提供了實驗依據和臨床研究證據，為細胞移植治療提供了新的途徑。


圖1為人間充質幹細胞(胰島素分泌細胞的種子細胞)的形態。圖2為人間充質幹細胞(胰島素分泌細胞的種子細胞)的免疫表型檢測結果。圖3為人間充質幹細胞體外分化得到的限定性內胚層細胞的形態。圖4為人間充質幹細胞體外分化得到的限定性內胚層細胞的免疫細胞螢光染色檢測結果。圖5為人間充質幹細胞體外分化得到的限定性內胚層細胞的實時定量PCR檢測結果。
圖6為限定性內胚層細胞體外分化得到的胰腺幹細胞/胰腺祖細胞的形態。圖7為限定性內胚層細胞體外分化得到的胰腺幹細胞/胰腺祖細胞的免疫細胞螢光檢測結果。圖8為限定性內胚層細胞體外分化得到的胰腺幹細胞/胰腺祖細胞實時定量PCR檢測結果。圖9為胰腺幹細胞/胰腺祖細胞體外分化得到的胰島素分泌細胞的形態。圖10為胰腺幹細胞/胰腺祖細胞體外分化得到的胰島素分泌細胞的免疫細胞螢光染色檢測結果。圖11為胰腺幹細胞/胰腺祖細胞體外分化得到的胰島素分泌細胞的實時定量PCR檢測結果。圖12為胰腺幹細胞/胰腺祖細胞體外分化得到的胰島素分泌細胞的胰島素分泌總量檢測結果。圖13為胰腺幹細 胞/胰腺祖細胞體外分化得到的胰島素分泌細胞的胰島素釋放情況檢測結果。
具體實施例方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。青黴素、鏈黴素和胰蛋白酶-EDTA購自GIBCO公司。Trizol購自美國Invitrogen公司，Oligo dT、M-MLV逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTP和RNA酶抑制劑購自日本Takara公司。小鼠抗人foxa2單克隆抗體、小鼠抗人Insulin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。山羊抗人Soxl7單克隆抗體、小鼠抗人pdxl單克隆抗體、小鼠抗人ngn3單克隆抗體購自美國R&D公司。兔抗人C-肽多克隆抗體購自英國ABcam公司。異硫氰酸標記的山羊抗小鼠IgG、羅丹明標記的山羊抗小鼠IgG、羅丹明標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋公司。羅丹明標記的小鼠抗山羊IgG:購自北京中杉金橋公司。KRBH緩衝液:120mM NaCl、5mM KC1、2.5mM CaCl2U.1mM MgCl2,25mM NaHC03、0.1%(質量百分含量)BSA，其餘為IOmM HEPES緩衝液。實施例1、培養基的製備DMEM/F12培養基(又稱DF12培養基)和高糖DMEM培養基購自GIBCO公司。胎牛血清(FCS)購自GIBCO公司。尼克醯胺均購自Sigma公司。穀氨醯胺:GIBC0公司，產品目錄號為25030-081。維甲酸購自Sigma公司，產品目錄號為R2625。人活化素A (Activin
A):英國 Pepro Tech 公司，產品目錄號為 120-14。EGF(epidermal growth factor,表皮細胞生長因子):Pepro Tech 公司，產品目錄號為 100-15。bFGF(basic fibroblast growthfactor,鹼性成纖維細胞生長因子):Sigma公司，產品目錄號為F0291。exendin-4:Sigma公司，產品目錄號為E7144。B27:GIBC0公司，產品目錄號為17504-044。N2:GIBC0公司，產品目錄號為17502-048。非必需胺基酸:GIBC0公司，產品目錄號為11140。
培養基由高糖DMEM培養基和溶質組成；所述溶質及其在培養基A中的濃度如下:5ml/L 胎牛血清和 5ng/mL activin A。培養基B由DMEM/F12培養基和溶質組成；所述溶質及其在培養基B中的濃度如下:lCT5mol/L維甲酸、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、2mmol/L穀氨醯胺、體積濃度為I %的非必需胺基酸和體積濃度為2%的B27。培養基C由高糖DMEM培養基和溶質組成；所述溶質及其在培養基C中的濃度如下:5ml/L 胎牛血清、20ng/ml exendin-4、10ng/ml activin A、lOmmol/L 尼克酸胺、體積濃度為2 %的B27和體積濃度為I %的N2。實施例2、人胰島素分泌細胞的序貫誘導培養(培養基組合甲的應用)一、製備第3代間充質幹細胞1、無菌收集離體臍帶(來源為人)，在生物安全櫃中剪取約IOcm長的臍帶，用細胞洗滌液清洗血汙；用解剖刀去除外被羊膜、2條臍靜脈和I條臍動脈，得到華爾通氏膠(動靜脈之間的胚胎粘液樣結締組織)。2、將華爾通氏膠剪碎成肉糜狀，轉移到離心管中，用0.75g/LII型膠原酶消化2_3小時，用100目篩網過濾並收集濾液，室溫1200rpm離心10分鐘，收集細胞。3、將步驟2的細胞在37°C、50ml/L CO2、空氣相對溼度為95%的培養箱中進行培養，當細胞達70% -80%匯合時，用lg/L胰蛋白酶(Gibco公司)常規消化，細胞按照1: 3進行傳代，得到第I代間充質細胞。4、將第I代間充質細 胞在37°C、50ml/L CO2、空氣相對溼度為95%的培養箱中國進行培養，達70%-80%匯合，用D-Hank’s液洗2遍，用lg/L胰蛋白酶(Gibco公司)常規消化，細胞按照1: 3進行傳代，得到第2代間充質細胞。5、將第2代間充質細胞在37°C、50ml/L CO2、空氣相對溼度為95%的培養箱中進行培養，達70% -80%匯合，用D-Hank’s液洗2遍，然後用lg/L的胰蛋白酶(Gibco公司)常規消化，室溫1200rpm離心6分鐘，收集細胞。6、將步驟5的細胞在37°C、50ml/L CO2、空氣相對溼度為95%的培養箱中培養4_6小時，待細胞貼壁後棄除培養基，用D-Hank』 s洗2遍，記作第3代間充質幹細胞。二、採用培養基組合甲進行誘導培養1、第一階段的培養(I)在6孔板中加入培養基A，每孔2000微升。(2)在步驟(I)的6孔板中接種第3代間充質幹細胞(使其在培養基中的濃度為5父105個/!111)，在371:、501111/1 CO2、空氣相對溼度為95%的培養箱中培養5天(每2天吸棄上清並加入2000微升新的培養基A)。2、第二階段的培養吸棄步驟I的6孔板中的上清，加入培養基B，每孔2000微升，在37°C、50ml/LC02、空氣相對溼度為95%的培養箱中培養6天(每2天吸棄上清並加入2000微升新的培養基B)。3、第三階段的培養吸棄步驟2的6孔板中的上清，加入培養基C，每孔2000微升，在37°C、50ml/LC02、空氣相對溼度為95%的培養箱中培養8天(每2天吸棄上清並加入2000微升新的培養基C)，室溫1200rpm離心6分鐘，收集細胞(沉澱)。三、誘導效果的鑑定1、第3代間充質幹細胞的免疫表型測定步驟一得到的第3代間充質幹細胞的細胞形態見圖1。用間接免疫螢光法檢測第3代間充質幹細胞的表型，用異硫氰酸螢光素(FITC)標記的小鼠抗人 CD29、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106, CDl 17、Flk-1、HLA-ABC 和HLA-DR抗體(抗體均購自BD公司)標記後進行流式檢測，流式細胞儀為ACXURI C6 (BectonDickinson)。結果見圖2，橫坐標表示細胞螢光強度，縱坐標表示細胞數；P2表示所選細胞群體。表型結果顯示，第3代間充質幹細胞的⑶29、⑶44、CD73、⑶90、⑶105、Flk-l和HLA-ABC均為陽性，⑶34、⑶106、⑶117和HLA-DR分子均為陰性。2、人間充質幹細胞誘導分化為限定性內胚層細胞的鑑定(I)形態鑑定在培養基A中培養6天後細胞達80% -90%匯合，培養過程中細胞的形態變化如下:培養1-2天，細胞基本為梭形，少數呈鵝卵石樣上皮細胞形態，梭形細胞的百分比大於90% ;培養4-6天後，細胞體積明顯增大，排列緊密，梭形細胞比例減少，多數細胞呈現鵝卵石樣上皮細胞形態，鵝卵石樣細胞的百分比大於90%，在培養基A中培養4天的細胞見圖3。

(2)免疫螢光染色鑑定將步驟二的I中培養5天的細胞(將第3代間充質幹細胞作為對照)進行免疫螢光染色，檢測限定性內胚層標誌Foxa2和Soxl7的表達情況。檢測Foxa2的具體方法如下:細胞以80%冰乙醇固定，PBS清洗後以含1% BSA的PBST緩衝液封閉；然後用小鼠抗人Foxa2單克隆抗體(工作濃度為1: 50稀釋)作為一抗室溫孵育I小時；用PBS緩衝液清洗後，再以異硫氰酸(綠色螢光)標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗室溫孵育30分鐘；用PBS緩衝液清洗後用Hoechst 33342染色液(Sigma)復染細胞核(蘭色螢光)，在螢光顯微鏡下觀察(Olympus)。第3代間充質幹細胞均不顯示綠色螢光，為陰性結果。採用培養基A誘導培養後的細胞90%以上顯示綠色螢光。檢測Soxl7的具體方法同Foxa2的具體方法，差別僅在於採用山羊抗人Soxl7單克隆抗體(工作濃度為1: 100稀釋)作為一抗，採用羅丹明(紅色螢光)標記的小鼠抗山羊IgG作為二抗。第3代間充質幹細胞均不顯示紅色螢光，為陰性結果。採用培養基A誘導培養後的細胞90%以上顯示紅色螢光。結果見圖4 (A為採用培養基A誘導培養後的細胞，B為第3代間充質幹細胞)。結果表明，採用培養基A誘導培養後大部分細胞為Foxa2和Soxl7陽性。(3)實時定量PCR分析取步驟二的I中培養5天的細胞(將第3代間充質幹細胞作為對照)，提取總RNA並反轉錄為cDNA，通過實時定量PCR鑑定Foxa2基因和Soxl7基因的表達情況。採用人GAPDH作為各基因的對照，所用的引物如下:用於擴增Foxa2基因的引物為:上遊引物:5』-CTGAGCGAGATCTACCAGTGGA-3，；
下遊引物:5』 -CAGTCGTTGAAGGAGAGCGAGT-3 』。用於擴增Soxl7基因的引物為:上遊引物:5，-GCATGACTCCGGTGTGAATCT-3，；下遊引物:5，-TCACACGTCAGGATAGTTGCAGT-3，。用於擴增GAPDH的引物為:上遊引物:5，-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3，；下遊引物:5』 -GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3 』。採用Λ ,CT法計算各基因的相對表達量。以第3代間充質幹細胞的foxa2基因(或soxl7基因)的表達量為1，計算採用培養基A誘導培養後的細胞中各個基因的相對表達量。採用培養基A誘導培·養後的細胞中，foxa2基因的相對表達量為10.80，soxl7基因的相對表達量為4.77。結果見圖5。以上鑑定結果表明，採用培養基A誘導培養後的細胞主要為人限定性內胚層細胞(表達限定性內胚層細胞的特異性標誌基因，並顯示限定性內胚層細胞的形態)。3、限定性內胚層細胞分化為胰腺幹細胞、胰腺祖細胞和β前體細胞的鑑定(I)形態鑑定在培養基B中培養6天，培養過程中細胞的形態變化如下:細胞逐漸變小並呈團狀聚集狀態。在培養基B中培養6天的細胞見圖6。(2)免疫螢光染色鑑定將步驟二的2中培養6天的細胞(將第3代間充質幹細胞作為對照)進行免疫螢光染色，分別檢測胰腺幹細胞標誌Pdxl和胰腺內分泌祖細胞標誌Ngn3的表達情況。檢測Pdxl的具體方法同Foxa2的具體方法，差別僅在於採用小鼠抗人Pdxl單克隆抗體(工作濃度為1: 100稀釋)作為一抗。第3代間充質幹細胞均不顯示綠色螢光，為陰性結果。採用培養基B誘導培養後的細胞70%以上顯示綠色螢光。檢測Ngn3的具體方法同Foxa2的具體方法，差別僅在於採用小鼠抗人Ngn3單克隆抗體(工作濃度為1: 100稀釋)作為一抗。第3代間充質幹細胞均不顯示綠色螢光，為陰性結果。採用培養基B誘導培養後的細胞70%以上顯示綠色螢光。結果見圖7 (A為採用培養基B誘導培養後的細胞，B為第3代間充質幹細胞)。結果表明，採用培養基B誘導培養後大部分細胞為Pdxl和Ngn3陽性。(3)實時定量PCR分析取步驟二的2中培養6天的細胞(將第3代間充質幹細胞作為對照)，提取總RNA並反轉錄為cDNA，通過實時定量PCR分別鑑定Pdxl基因、Ngn3基因和Pax4基因(胰腺內分泌祖細胞標誌)的表達情況。採用人GAPDH作為各基因的對照，所用的引物如下:用於擴增Pdxl的引物為:上遊引物:5』 -TACTGGATTGGCGTTGTTTGTGGC-3，；下遊引物:5』 -AGGGAGCCTTCCAATGTGTATGGT-3 』。用於擴增Ngn3的引物為:上遊引物:5』 -TAAGAGCGAGTTGGCACTGAGCAA-3 』 ；下遊引物:5』 -TTTGAGTCAGCGCCCAGATGTAGT-3，。用於擴增Pax4的引物為:
上遊引物:5』-AATTCCCTGGACTCAGGACTGCTT-3』 ；下遊引物:5，-TTCCAAGCCATACAGTAGTGGGCA-3，。 用於擴增GAPDH的引物為:上遊引物:5』-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3』 ；下遊引物:5』 -GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3，。採用「CT法計算各基因的相對表達量。以第3代間充質幹細胞的Pdxl基因(或Ngn3基因或Pax4基因)的表達量為1，計算採用培養基B誘導培養後的細胞中各個基因的相對表達量。採用培養基B誘導培養後的細胞中，pdxl基因的相對表達量為10.72，ngn3基因的相對表達量為14.07，pax4基因的相對表達量為5.18。結果見圖8。結果表明，採用培養基B培養後，人間充質幹細胞來源的限定性內胚層細胞表達胰腺幹細胞基因Pdxl、胰腺內分泌祖細胞基因Ngn3和胰腺內分泌祖細胞基因Pax4。以上鑑定結果表明，採用培養基B誘導培養後呈團狀聚集狀態的細胞即為胰腺幹細胞/胰腺祖細胞(該細胞表達胰腺幹細胞/胰腺祖細胞特異性標誌基因，並顯示出團狀聚集狀態，且該細胞進一步誘導可獲得胰島素分泌細胞)。4、胰腺幹細胞和胰腺祖細胞體外分化為胰島素分泌細胞的鑑定(I)形態鑑定在培養基C中培養8天後細胞呈團狀聚集狀態更加明顯，見圖9。(2)免疫螢光染色鑑定

將步驟二的3中培養8天的細胞(將第3代間充質幹細胞作為對照)進行免疫螢光染色，檢測胰島素分泌細胞標誌Insulin和C-peptide的表達情況。檢測Insulin的具體方法同Foxa2的具體方法，差別僅在於採用小鼠抗人Insulin單克隆抗體(工作濃度為1: 50稀釋)作為一抗，採用羅丹明(紅色螢光)標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗。第3代間充質幹細胞均不顯示紅色螢光，為陰性結果。採用培養基C誘導培養後的細胞95%以上顯示紅色螢光。 檢測C-peptide的具體方法同Foxa2的具體方法，差別僅在於採用兔抗人C-p印tide多克隆抗體(工作濃度為1: 100稀釋)作為一抗，採用羅丹明(紅色螢光)標記的山羊抗兔IgG作為二抗。第3代間充質幹細胞均不顯示紅色螢光，為陰性結果。採用培養基C誘導培養後的細胞95%以上顯示紅色螢光。結果見圖10 (A為採用培養基C誘導培養後的細胞，B為第3代間充質幹細胞)。結果表明，採用培養基C誘導培養後大部分細胞為Insulin和C-peptide陽性。(3)實時定量PCR分析取步驟二的3中培養8天的細胞(將第3代間充質幹細胞作為對照)，提取總RNA並反轉錄為cDNA，通過實時定量PCR鑑定Insulin基因和Glut-2基因的表達情況。採用人GAPDH作為各基因的對照，所用的引物如下:用於擴增Insulin基因的引物為:上遊引物:5』-AGAGGCCATCAAGCAGATCACTGT-3』 ；下遊引物:5，-CACAGGTGTTGGTTCACAAAGGCT-3，。用於擴增Glut-2基因的引物為:上遊引物:5，-AGCTGCATTCAGCAATTGGACCTG-3，；
下遊引物:5，-ATGTGAACAGGGTAAAGGCCAGGA-3，。 用於擴增GAPDH的引物為:上遊引物:5』-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3』 ；下遊引物:5』 -GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3，。採用「CT法計算各基因的相對表達量。以第3代間充質幹細胞的Insulin基因(或Glut-2基因)的表達量為1，計算採用培養基C誘導培養後的細胞中各個基因的相對表達量。採用培養基C誘導培養後的細胞中，insulin基因的相對表達量為6.31，Glut-2基因的相對表達量為7.80。結果見圖11。結果表明，採用培養基C培養後，脂肪間充質幹細胞來源的胰腺幹/祖細胞表達胰腺內分泌功能細胞相關基因Insulin和Glut-2。(4)胰島素分泌功能檢測①胰島素測定將步驟二的3中培養8天的細胞(將第3代間充質幹細胞作為對照)進行如下實驗:針對每個細胞孔，取所有培養上清，並對該孔內的細胞進行計數。將培養上清2000rpm離心lOmin，取上清液並用胰島素ELISA檢測試劑盒(EZHIASF_14K，MILLIP0RE)檢測胰島素含量(具體操作按照試劑盒說明書進行)。每5X IO5個採用培養基C誘導後的細胞分泌得到的胰島素總量為(346.3739 ±32.51489) μ U/ml,第3代間充質幹細胞分泌得到的胰島素總量為(17.69± 1.462954) μ U/ml (P < 0.01)。結果見圖12 (A為採用培養基C-1誘導培養後的細胞，B為第3代間充質幹細 胞)。②細胞C-肽分泌功能測定將步驟二的3中培養8天的細胞進行如下實驗:將5X IO5個細胞用PBS緩衝液洗滌3遍後，在ImL KRBH緩衝液中孵育6小時(3-6小時均可)，然後將細胞置於ImL含5.5mM葡萄糖的KRBH緩衝液中孵育I小時，收集上清液(溶液甲)，再然後將細胞置於ImL含22mM葡萄糖的KRBH緩衝液中孵育I小時，收集上清液(上清液乙)。使用C-肽ELISA試劑盒(EZHCP-20K，MILLIPORE)分別檢測溶液甲和溶液乙中C-肽的含量(具體測定方法參考試劑盒說明書)。上清液甲中C-肽釋放水平為(195.10±8.88)pmol/L/h(P<0.01)，該水平代表胰島素從頭合成量。上清液乙中C-肽釋放水平達到(340.99±7.91)pmol/L/h(P < 0.01)。結果見圖13。結果表明，採用培養基C-1誘導後的細胞在體外具有對葡萄糖應答的胰島素分泌功能。結果表明，採用培養基C-1誘導培養後的細胞為胰島素分泌細胞(該細胞表達胰島素分泌細胞特異性標誌基因，並顯示出體外分泌胰島素的能力及對葡萄糖的反應性)。
權利要求
1.將間充質幹細胞誘導為胰島素分泌細胞的培養基組合物，由培養基A、培養基B和培養基C組成； 所述培養基A由動物細胞基礎培養基和溶質組成；所述溶質及其在所述培養基A中的濃度如下-A- 75ml/L-5.25ml/L 胎牛血清和 4.75ng/mL_5.25ng/mL activin A ； 所述培養基B由動物細胞基礎培養基和溶質組成；所述溶質及其在所述培養基B中的濃度如下:0.95 X 10 5mol/L_l.05 X 10 5mol/L 維甲酸、19ng/ml_21ng/ml EGF、19ng/ml-21ng/ml bFGF、l.9mmol/L-2.lmmol/L 穀氨酸胺、體積濃度為 0.95 % -1.05% 的非必需胺基酸和體積濃度為1.9% -2.1%的B27 ； 所述培養基C由動物細胞基礎培養基和溶質組成；所述溶質及其在所述培養基C中的濃度如下:4.5ml/L-5.5ml/L胎牛血清、19ng/ml_21ng/ml exendin_4、9.5ng/ml_10.5ng/mlactivin A、9.5mmol/L-10.5mmol/L尼克酸胺、體積濃度為1.9% -2.1%的B27和體積濃度為 0.95% -1.05%的 N2。
2.如權利要求1所述的培養基組合物，其特徵在於: 所述培養基A由高糖DMEM培養基和溶質組成；所述溶質及其在培養基A中的濃度如下:5ml/L 胎牛血清和 5ng/mL activin A ； 所述培養基B由DMEM/F12培養基和溶質組成；所述溶質及其在培養基B中的濃度如下:lCT5mol/L維甲酸、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、2mmol/L穀氨醯胺、體積濃度為I %的非必需胺基酸和體積濃度為2%的B27 ； 所述培養基C由高糖DMEM培養基和溶質組成；所述溶質及其在培養基C中的濃度如下:5ml/L 胎牛血清、20ng/ml exendin-4、10ng/ml activin A、lOmmol/L 尼克酸胺、體積濃度為2 %的B27和體積濃度為I %的N2。
3.將間充質幹細胞誘導為胰島素分泌細胞方法，是將間充質幹細胞依次用權利要求1或2所述的培養基組合物中的所述培養基A、所述培養基B和所述培養基C進行培養，得到胰島素分泌細胞。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於:所述方法包括如下步驟: (1)將間充質幹細胞接種於所述培養基A中，培養4-6天； (2)將完成步驟(I)的細胞轉接於所述培養基B中，培養6-8天； (3)將完成步驟(2)的細胞轉接於所述培養基C中，培養7-10天，得到胰島素分泌細胞。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於:所述步驟(I)中，所述間充質幹細胞在所述培養基A中的初始濃度為2 X IO5個/ml-1 X IO6個/ml。
6.權利要求1或2所述的培養基組合物在將間充質幹細胞誘導為胰島素分泌細胞中的應用。
7.將限定性內胚層細胞誘導為胰腺幹細胞和/或胰腺祖細胞的培養基，為培養基B;所述培養基B由動物細胞基礎培養基和溶質組成；所述溶質及其在所述培養基B中的濃度如下:0.95X lCT5mol/L-l.05X lCT5mol/L 維甲酸、19ng/ml_21ng/ml EGF> 19ng/ml_21ng/mlbFGF、l.9mmol/L-2.lmmol/L穀氨醯胺、 體積濃度為0.95% -1.05%的非必需胺基酸和體積濃度為 1.9% -2.1% 的 B27。
8.將間充質幹細胞誘導為胰腺幹細胞和/或胰腺祖細胞的培養基組合物，由培養基A和培養基B組成； 所述培養基A由動物細胞基礎培養基和溶質組成；所述溶質及其在所述培養基A中的濃度如下-A- 75ml/L-5.25ml/L 胎牛血清和 4.75ng/mL_5.25ng/mL activin A ； 所述培養基B由動物細胞基礎培養基和溶質組成；所述溶質及其在所述培養基B中的濃度如下:0.95 X 10 5mol/L_l.05 X 10 5mol/L 維甲酸、19ng/ml_21ng/ml EGF、19ng/ml-21ng/ml bFGF、l.9mmol/L-2.lmmol/L 穀氨酸胺、體積濃度為 0.95 % -1.05% 的非必需胺基酸和體積濃度為1.9% -2.1%的B27。
9.將限定性內胚層細胞誘導為胰島素分泌細胞的培養基組合物，由培養基B和培養基C組成； 所述培養基B由動物細胞基礎培養基和溶質組成；所述溶質及其在所述培養基B中的濃度如下:0.95 X 10 5mol/L_l.05 X 10 5mol/L 維甲酸、19ng/ml_21ng/ml EGF、19ng/ml-21ng/ml bFGF、l.9mmol/L-2.lmmol/L 穀氨酸胺、體積濃度為 0.95 % -1.05% 的非必需胺基酸和體積濃度為1.9% -2.1%的B27 ； 所述培養基C由動物細胞基礎培養基和溶質組成；所述溶質及其在所述培養基C中的濃度如下:4.5ml/L-5.5ml/L胎牛血清、19ng/ml_21ng/ml exendin_4、9.5ng/ml_10.5ng/mlactivin A、9.5mmol/L-10.5mmol/L尼克酸胺、體積濃度為1.9% -2.1%的B27和體積濃度為 0.95% -1.05%的 N2。
10.權利要求7所述培養基在將限定性內胚層細胞誘導為胰腺幹細胞和/或胰腺祖細胞中的應用，或，權利要求8所述培養基組合物在將間充質幹細胞誘導為胰腺幹細胞和/或胰腺祖細胞中的應用，或 ，權利要求9所述培養基組合物在將限定性內胚層細胞誘導為胰島素分泌細胞中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種將間充質幹細胞誘導為胰島素分泌細胞的培養基組合物，由培養基A、B和C組成；培養基A的溶質及其濃度如下4.75-5.25ml/L胎牛血清和4.75-5.25ng/mL activin A；培養基B的溶質及其濃度如下0.95×10-5-1.05×10-5mol/L維甲酸、19-21ng/ml EGF、19-21ng/ml bFGF、1.9-2.1mmol/L穀氨醯胺、0.95-1.05％非必需胺基酸和1.9-2.1％B27；培養基C的溶質及其濃度如下4.5-5.5ml/L胎牛血清、19-21ng/ml exendin-4、9.5-10.5ng/ml activin A、9.5-10.5mmol/L尼克醯胺、1.9-2.1％B27和0.95-1.05％N2。本發明的誘導培養方法，適合於各種組織來源的間充質幹細胞，該誘導培養方法無病毒導入、易操作、效率高。
文檔編號C12N5/074GK103184186SQ20111044674
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者趙春華, 李晶 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所