人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法
2023-05-31 06:55:36
專利名稱：人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法
技術領域：
本發明涉及了一種神經幹細胞分離純化的方法，特別是涉及了一種從人羊膜組織中分離和純化神經幹細胞的方法。
背景技術：
目前，利用神經幹細胞培養液和細胞克隆技術，從胚胎或胎腦中分離純化神經幹細胞的方法已基本成熟，由於腦組織中只有幹細胞具有增殖分裂活性，故此方法可有效應用於腦源性神經幹細胞的分離純化，而目前還沒有文獻資料報導過從人羊膜組織中分離純化神經幹細胞的方法。此外，人羊膜組織內除具有增殖分裂活性的神經幹細胞外，還存在有上皮幹細胞和間充質幹細胞，而且神經幹細胞數量遠少於胎腦，利用上述已知的方法分離純化人羊膜組織中的神經幹細胞，將大大提高成本，降低神經幹細胞的成活率。
發明內容
本發明目的是提供一種從人羊膜組織中分離純化神經幹細胞的方法。
為了實現這一發明目的，本發明提供了一種人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，它包括以下步驟(a)清洗人羊膜組織；(b)從上述人羊膜組織中分離出上皮細胞；(c)從人羊膜組織中分離出人羊膜組織間充質細胞；(d)從人羊膜組織間充質細胞中分離出神經幹細胞；本發明提供了一種人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，其中所述步驟(a)包括以下步驟(1)將人羊膜組織漂洗、浸泡和消毒；(2)將人羊膜組織剪成約為1-2mm3的碎片；(3)將人羊膜組織碎片送入離心管中，加入含有0.125％胰蛋白酶的D-hank’s緩衝液；(4)混合上述溶液，混合均勻後將上述溶液放置在生物振蕩器內，在溫度為37℃左右、生物振蕩器的轉速為80-120rpm的條件下，震搖10-20分鐘；(5)去除得到的上清液，完成了人羊膜組織的清洗；本發明提供了一種人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，其中所述步驟(b)包括以下步驟(1)將清洗後的人羊膜組織加入到含有0.125％胰蛋白酶的D-hank’s緩衝液中；(2)混合上述溶液，混合均勻後將上述溶液放置在生物振蕩器內，在溫度為37℃左右、生物振蕩器的轉速為400-600rpm的條件下，震搖20-40分鐘；(3)用細胞篩過濾混懸液，收集從人羊膜組織中分離出來的上皮細胞；(4)重複上述(1)至(3)步驟2-3次，收集每次從人羊膜組織中分離出來的所有上皮細胞並計數；(5)將上述上皮細胞接種在培養瓶中；本發明提供了一種人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，其中所述步驟(c)包括以下步驟(1)將分離出了上皮細胞的人羊膜組織碎片用D-hank’s緩衝液漂洗；(2)將上述組織碎片加入到含有0.1％的V型膠原酶溶液中混合；(3)混合均勻後，將上述溶液放置在生物振蕩器內，在溫度為37℃左右、生物振蕩器的轉速為400-600rpm的條件下，震搖20-40分鐘；(4)用細胞篩過濾混懸液，離心收集人羊膜組織間充質細胞並計數；本發明提供了一種人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，其中所述步驟(d)包括以下步驟(1)將上述收集的人羊膜組織間充質細胞接種於神經幹細胞培養液中，培養至1×106-1×107細胞個數；(2)採用免疫磁珠細胞分離的方法，從人羊膜組織間充質細胞中分離出神經幹細胞；本發明提供了一種人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，其中所述神經幹細胞培養液包括含有20ng/ml的鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、含有20ng/ml的表皮細胞生長因子(EGF)和B27的DMEM/F12無血清培養液；本發明提供了一種人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，其中根據神經幹細胞表達CD133抗體的特點，將CD133抗體包被在免疫磁珠上，利用免疫磁珠細胞分離的方法，從人羊膜組織間充質細胞中分離出CD133陽性神經幹細胞。
本發明與從胚胎或胎腦中分離純化神經幹細胞的方法相比，本發明通過從人羊膜組織中分離上皮細胞、收集間充質細胞並根據神經幹細胞表達CD133抗體的特點，採用免疫磁珠細胞分離法，從人羊膜組織間充質細胞中分離出CD133陽性神經幹細胞，再採用神經幹細胞培養液繼續培養神經幹細胞，該方法大大降低了從人羊膜組織中分離純化神經幹細胞的成本，提高了神經幹細胞的成活率。
具體實施例方式
本發明公開了一種人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，它包括四大步驟，每一大步驟還包括若干個小步驟，其中以下為四大步驟(a)清洗人羊膜組織；(b)從上述人羊膜組織中分離出上皮細胞；(c)從人羊膜組織中分離出人羊膜組織間充質細胞；(d)從人羊膜組織間充質細胞中分離出神經幹細胞。
其中步驟(a)包括以下步驟(1)將人羊膜組織漂洗、浸泡和消毒；(2)將人羊膜組織剪成約為1-2mm3的碎片；(3)將人羊膜組織碎片送入50ml離心管中，加入含有0.125％胰蛋白酶的D-hank’s緩衝液；(4)混合上述溶液，混合均勻後將上述溶液放置在生物振蕩器內，在溫度為37℃左右、生物振蕩器的轉速為100rpm的條件下，震搖15分鐘；(5)去除得到的上清液，完成了人羊膜組織的清洗。
其中步驟(b)包括以下步驟(1)將清洗後的人羊膜組織加入到含有0.125％胰蛋白酶的D-hank’s緩衝液中；(2)混合上述溶液，混合均勻後將上述溶液放置在生物振蕩器內，在溫度為37℃左右、生物振蕩器的轉速為500rpm的條件下，震搖30分鐘；(3)用細胞篩過濾混懸液，收集從人羊膜組織中分離出來的上皮細胞；(4)重複上述(1)至(3)步驟3次，收集每次從人羊膜組織中分離出來的所有上皮細胞並計數；(5)將上述上皮細胞接種在培養瓶中，以作為別的用途。
其中所述步驟(c)包括以下步驟(1)將分離出了上皮細胞的人羊膜組織碎片用D-hank’s緩衝液漂洗；(2)將上述組織碎片加入到含有0.1％的V型膠原酶溶液中混合；
(3)混合均勻後，將上述溶液放置在生物振蕩器內，在溫度為37℃左右、生物振蕩器的轉速為500rpm的條件下，震搖30分鐘；(4)用細胞篩過濾混懸液，離心收集人羊膜組織間充質細胞並計數，以備後續使用。
其中步驟(d)包括以下步驟(1)將上述收集的人羊膜組織間充質細胞接種於神經幹細胞培養液中，培養至1×106-1×107細胞個數，神經幹細胞培養液包括含有20ng/ml的鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、含有20ng/ml的表皮細胞生長因子(EGF)和B27(商品名稱)的DMEM/F12無血清培養液；B27(商品名稱)的用量可以根據產品說明書的介紹進行添加。
(2)根據神經幹細胞表達CD133抗體的特點，將CD133抗體包被在免疫磁珠上，利用免疫磁珠細胞分離的方法，從人羊膜組織間充質細胞中分離出CD133陽性神經幹細胞。分離出來的神經幹細胞經培養液繼續培養。
以上描述是對本發明的解釋，不是對發明的限定，本發明所限定的範圍參見權利要求，在不違背本發明的精神的情況下，本發明可以作任何形式的修改。
權利要求
1.一種人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，其特徵在於它包括以下步驟(a)清洗人羊膜組織；(b)從上述人羊膜組織中分離出上皮細胞；(c)從人羊膜組織中分離出人羊膜組織間充質細胞；(d)從人羊膜組織間充質細胞中分離出神經幹細胞。
2.如權利要求1所述的人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，其特徵在於所述步驟(a)包括以下步驟(1)將人羊膜組織漂洗、浸泡和消毒；(2)將人羊膜組織剪成約為1-2mm3的碎片；(3)人羊膜組織碎片送入離心管中，加入含有0.125％胰蛋白酶的D-hank’s緩衝液；(4)混合上述溶液，混合均勻後將上述溶液放置在生物振蕩器內，在溫度為37℃左右、生物振蕩器的轉速為80-120rpm的條件下，震搖10-20分鐘；(5) 去除得到的上清液，完成了人羊膜組織的清洗。
3.權利要求2所述的人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，其特徵在於所述步驟(b)包括以下步驟(1)將清洗後的人羊膜組織加入到含有0.125％胰蛋白酶的D-hank’s緩衝液中；(2)混合上述溶液，混合均勻後將上述溶液放置在生物振蕩器內，在溫度為37℃左右、生物振蕩器的轉速為400-600rpm的條件下，震搖20-40分鐘；(3)用細胞篩過濾混懸液，收集從人羊膜組織中分離出來的上皮細胞；(4)重複上述(1)至(3)步驟2-3次，收集每次從人羊膜組織中分離出來的所有上皮細胞並計數；(5)將上述上皮細胞接種在培養瓶中。
4.如權利要求3所述的人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，其特徵在於所述步驟(c)包括以下步驟(1)將分離出了上皮細胞的人羊膜組織碎片用D-hank’s緩衝液漂洗；(2)將上述組織碎片加入到含有0.1％的V型膠原酶溶液中混合；(3)混合均勻後，將上述溶液放置在生物振蕩器內，在溫度為37℃左右、生物振蕩器的轉速為400-600rpm的條件下，震搖20-40分鐘；(4)用細胞篩過濾混懸液，離心收集人羊膜組織間充質細胞並計數。
5.如權利要求4所述的人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，其特徵在於所述步驟(d)包括以下步驟(1)將上述收集的人羊膜組織間充質細胞接種於神經幹細胞培養液中，培養至1×106-1×107細胞個數；(2)採用免疫磁珠細胞分離的方法，從人羊膜組織間充質細胞中分離出神經幹細胞。
6.如權利要求5所述的人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，其特徵在於所述神經幹細胞培養液包括含有20ng/ml的鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、含有20ng/ml的表皮細胞生長因子(EGF)和B27的DMEM/F12無血清培養液。
7.如權利要求6所述的人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，其特徵在於根據神經幹細胞表達CDl33抗體的特點，將CDl33抗體包被在免疫磁珠上，利用免疫磁珠細胞分離的方法，從人羊膜組織間充質細胞中分離出CD133陽性神經幹細胞。
全文摘要
本發明涉及了人羊膜組織神經幹細胞分離純化的方法，它包括以下步驟(a)清洗人羊膜組織；(b)從上述人羊膜組織中分離出上皮細胞；(c)從人羊膜組織中分離出人羊膜組織間充質細胞；(d)從人羊膜組織間充質細胞中分離出神經幹細胞，本發明的方法通過分離上皮細胞、收集間充質細胞並根據神經幹細胞表達CD133抗體的特點，採用免疫磁珠細胞分離法，從人羊膜組織間充質細胞中分離出CD133陽性神經幹細胞，再採用神經幹細胞培養液繼續培養神經幹細胞，該方法大大降低了人羊膜組織來源神經幹細胞分離純化的成本，提高了神經幹細胞的成活率。
文檔編號C12N5/08GK101092608SQ20061009002
公開日2007年12月26日 申請日期2006年6月23日 優先權日2006年6月23日
發明者蔡哲, 張嵐, 潘琳, 舒峻 申請人:中日友好醫院