Nadh脫氫酶黃素蛋白2在製備檢測藥物中的應用的製作方法

2023-05-31 02:53:01

專利名稱：Nadh脫氫酶黃素蛋白2在製備檢測藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及NADH脫氫酶黃素蛋白2在製備檢測藥物中的應用，具體涉及NADH脫氫酶黃素蛋白2在製備檢測免疫性肝纖維化藥物中的應用。
背景技術：
肝纖維化是指慢性肝細胞損傷引起的組織中細胞外基質的過渡沉積。它的進一步發展會導致肝硬化和原發性的肝細胞癌變等嚴重不良後果。通常，肝纖維化的開始臨床難以察覺，相關的病態和致死率主要發生在肝硬化以後。因此通過早期診斷進而達到阻止或逆轉肝纖維化發生、發展具有十分重要的意義。肝纖維化的臨床診斷方法一直是無可替代的肝穿刺技術，但是該方法本身存在如下的嚴重的缺點有一定的致死率和臨床併發症的可能；同時存在較大的取樣偏差， 總體說來，55%的變異係數是必須接受的(Gressner OA等人，臨床化學文獻，2007，381 107-113)。因此，發展新型的生物標誌物來診斷和評價肝纖維化具有很大的必要性和重要性。目前，有研究報導了可作為肝纖維化分子標誌物的發現。其中有直接和肝纖維化發生機制相關的標誌分子。它們其中有細胞外基質相關的酶類，包括單胺氧化酶、賴氨醯氧化酶和膠原肽酶等；有不同的類型的膠原，包括I型，III型和IV型前膠原；有基質代謝蛋白酶相關的糖蛋白或蛋白聚糖，包括粗纖維調節素，玻連蛋白，腱糖蛋白，共結合聚糖 KZvibel I等人，國際肝臟，2009，四208-212)等。還有一些標誌物(或者說標誌因子) 是基於算法形成的多因素標誌因子，通常它們與肝纖維化的發生發展機制沒有直接的關係，而是基於實踐的經驗觀察，包括iTesta指數(Testa R等人，國際藥學雜誌，2006，沈0 142-150)和 FIB-4(參見，Sterling RK 等人，肝病，2006，43 1317-1325)等，其中都包含了多個反映肝纖維化的標誌物，通過一定的數學計算方法組合在一起得到一個綜合的分數。 雖然人們根據實際地臨床經驗發現了上述多種多樣的標誌物，但是目前還沒有一種標誌物可以同時滿足操作簡單，重複性佳，準確率高，普遍認可和臨床可接受的多項要求。因此，尋找新的肝纖維化相關基因尤其是肝纖維化高表達的基因，對於探討肝纖維化的發病機制有極其重大的意義，同時通過對它的應用也能極大地減輕患者檢測的痛苦，提高診斷的準確性和時效性。NADH 脫氫酶黃素蛋白 2 (NADH dehydrogenase flavoprotein 2，Ndufv2) NCBI 的登錄號為NP_112326. 1，作為一個DADH脫氫酶的亞單位，位於線粒體內膜上參與NADH相關白勺 ％ # 。 (http://Vw￥· ncbi. nlm. nih. gov/gene/81728)有研究者通過mRNA差異顯示的方法比較了荷爾斯坦因種和日本種的公牛中瘤胃、網胃、瓣胃、皺胃中的基因轉錄的差異情況，結果顯示NADH脫氫酶黃素蛋白2在公牛的瘤胃中是高表達的(Roh SG等人，動物科學雜誌，2009 :395-403)。目前為止，尚未見有關NADH脫氫酶黃素蛋白2與肝纖維化直接或間接相關的報導。

發明內容
本發明的目的在於提供NADH脫氫酶黃素蛋白2的新用途，尤其涉及NADH脫氫酶黃素蛋白2在製備檢測免疫性肝纖維化藥物中的應用。本發明所述的NADH 脫氫酶黃素蛋白 2 (NADH dehydrogenase flavoprotein 2， Ndufv2)NCBI的登錄號為NP_112326. 1，作為一個DADH脫氫酶的亞單位，位於線粒體內膜上參與 NADH 相關的電子傳遞。(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gene/81728)本發明中，所述的藥物為檢測製劑或檢測試劑盒。本發明中，所述的應用是確定NADH脫氫酶黃素蛋白2在肝非實質細胞中的轉錄是否存在上調表達。本發明還提供NADH脫氫酶黃素蛋白2在製備m RNA的特異性的核苷酸探針中的應用。所述探針用作檢測免疫性肝纖維化。本發明還提供NADH脫氫酶黃素蛋白2在製備m RNA的特異性的寡核苷酸探針中的應用，所述用作特異性地識別NADH脫氫酶黃素蛋白2的m RNA。本發明通過篩選在免疫性肝纖維化和正常肝臟的肝非實質細胞中差異表達的蛋白質，得到一種在免疫性肝纖維化和正常肝臟非實質細胞中存在差異表達的蛋白質(免疫性肝纖維化細胞中上調表達)，經質譜鑑定為NADH脫氫酶黃素蛋白2。進一步的反轉錄聚合酶鏈式反應實驗證實，該蛋白在免疫性肝纖維化和正常肝臟的肝非實質細胞中存在轉錄水平的差異(免疫性肝纖維化細胞中轉錄上調)。基於NADH脫氫酶黃素蛋白2與免疫性肝纖維化的相關性，以該蛋白的轉錄本作為一個分子標誌對其轉錄水平進行定量檢測可用作檢測免疫性肝纖維化。同時，本發明還提供一種應用NADH脫氫酶黃素蛋白2轉錄是否異常檢測體外肝非實質細胞的方法，該方法包括以下步驟A、用特異性探針檢測待檢肝非實質細胞中NADH脫氫酶黃素蛋白2mRNA的數量；B、將步驟A所得到的數量與正常肝臟肝非實質細胞中NADH脫氫酶黃素蛋白2mRNA 的數量進行比較，如測得的mRNA高於正常值，則表示被檢樣本中NADH脫氫酶黃素蛋白2的轉錄異常。實驗結果表明，本發明的NADH脫氫酶黃素蛋白可用於製備檢測免疫性肝纖維化的藥物，具體涉及檢測免疫性肝纖維化的製劑或檢測免疫性肝纖維化的試劑盒；通過所述的檢測藥物，能確定NADH脫氫酶黃素蛋白2在肝非實質細胞中的轉錄是否存在上調表達； 本發明進一步可製備m RNA的特異性的核苷酸探針，或製備m RNA的特異性的寡核苷酸探針。本發明進一步可建立檢測體外肝非實質細胞中NADH脫氫酶黃素蛋白2轉錄的方法。本發明為製備檢測免疫性肝纖維化的藥物提供了一條全新的途徑，本發明的NADH 脫氫酶黃素蛋白2與免疫性肝纖維化的相關性為免疫性肝纖維化的診斷和/或治療提供一條全新的途徑。


圖1為正常肝臟和免疫性肝纖維化肝非實質細胞中NADH脫氫酶黃素蛋白2的表達量圖，其中，Nor代表正常肝臟，ILF代表免疫性肝纖維化肝臟，1、2、3代表三次重複實驗，圓圈代表NADH脫氫酶黃素蛋白2所在的位置；圖2為正常肝臟和免疫性肝纖維化mRNA定量結果圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件參考《分子克隆實驗指南》(第三版，冷泉港出版社)中所述的條件或者製造廠商的建議條件。本申請的發明人以改良的Percoll密度梯度離心的方法收集正常肝臟和免疫性肝纖維化的肝非實質細胞，裂解獲得細胞蛋白質後，以蛋白質二維凝膠電泳的方法分離蛋白質，通過ImageMaster軟體分析表達差異的蛋白質，並對所獲得的差異蛋白質進行質譜鑑定。結果發現NADH脫氫酶黃素蛋白2在免疫性肝纖維化的肝非實質細胞中高表達。反轉錄聚合酶鏈式反應實驗進一步證實NADH脫氫酶黃素蛋白2在肝纖維化的肝非實質細胞中的高水平轉錄。因此，證明可以以NADH脫氫酶黃素蛋白2作為一個指標對其轉錄本進行檢測可以用來製備檢測免疫性肝纖維化的藥物，即NADH脫氫酶黃素蛋白2可作為免疫性肝纖維化的分子標誌。實施例1正常肝臟和免疫性肝纖維化肝非實質細胞蛋白質樣品的製備本實施例中所使用的尿素、硫脲、苯甲基磺醯氟(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)、 3-[(3-膽醯胺丙基)-二乙銨]-1-丙磺酸(CHAPS)均購自Sigma公司，DNA酶購自Takara， Percoll 購自 Pharmacia。本實施例以改良的Percoll離心的方法首先分離肝非實質細胞，再以酶解的方式獲得肝非實質細胞的蛋白質。具體如下將正常肝臟或者免疫性肝纖維化肝臟組織在冰冷的生理鹽水中剪碎，用0. 05mg/ ml的IV型膠原酶消化組織碎片池，將消化好的懸液通過200目的尼龍膜過濾，取過濾好的細胞懸液，20°C，100g離心5min，取細胞沉澱，再重懸在PBS中，20°C，400g離心lOmin，以適當體積的PBS重懸細胞，以1 1 1的體積比將懸液鋪在25%和50%密度的Percoll層上，20°C，900g離心30min，取25% Percoll層和PBS懸液層中間的細胞層即為所需分離的肝非實質細胞。將獲得的肝非實質細胞加入裂解緩衝液(8mol/L尿素、4% CHAPS、65mmol/LDTT、 2mol/L硫尿、1 % NP-40,0. 5mmol/L PMSF、1 % DNA酶)，在冰上作用30min，再在室溫下孵育 30min。裂解得到的蛋白質用Bradford法測定蛋白質含量後_80°C保存備用。本實施例中所使用的正常肝臟及免疫性肝纖維化肝臟均取自大鼠，大鼠的免疫性肝纖維化是通過連續8周、每周兩次腹腔注射豬血清建立的模型。實施例2差異表達蛋白的篩選本實施例中所使用的丙烯醯胺、N, N'-亞甲基雙(丙烯醯胺)、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、尿素、甘油購自美國Amresco公司，過硫酸胺 (AP)、TEMED 購自 Bio-Rad。將裂解得到的蛋白質通過二維凝膠電泳的方法分離，通過ImageMaster 2DPlatinum 6. 0軟體分析，找出差異表達的蛋白質，並對所獲得的差異蛋白質用戴安納升級液相色譜Ultimate3000串聯高容量離子阱質譜(LC-MS/MS)進行分析鑑定。具體步驟如下雙向凝膠電泳的第一向等電聚焦電泳採用pH 3 10非線性膠條，電泳程序設置水化 30V，12h ；電泳:500V, Ih ；1000V, Ih ；8000V，30min，梯度；8000V，5h，線性；總功率達44千瓦。第二向十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，分離膠濃度為11.5%。電泳完後，剝膠，用考馬斯亮藍染膠，Image scanner掃描儀成像。所得圖像用 ImageMaster 2D Platinum 6. 0軟體將電泳圖譜分成2個類別進行找點、匹配等分析，找出差異蛋白質點。取差異蛋白質點脫色脫水凍幹後，每管中加入約5μ L胰酶(0.02yg/yL)。37°C 酶解過夜(16 18h)。酶解後的樣品先經過C18預柱(300 μ m idx5mm,5ym)脫鹽，流速為 20μ L/min，流動相為2% ACN，0. FA。然後以300nL/min的流速經C-18反向柱(75 μ m id χ 15cmlength, 3 μ m,PepMapTM)進行分離，色譜的梯度為4-48%，梯度時間為40min。通過C18色譜柱分離的肽段由納流噴針進入HCT質譜進行實時的離子化分析檢測。HCT質譜每秒鐘進行一次一級掃描和5次二級掃描分析。用DataAnalysis 3. 2軟體整合肽指紋圖譜和串聯質譜二級圖譜，通過Mascot 軟體查詢SwissPort資料庫。MS誤差士0. 6Da，MS/MS誤差1. 2Da.固定修飾是半胱氨酸被修飾為脲甲基半胱氨酸(Carbamidomethyl-Cys)，可變修飾為甲硫氨酸氧化 (Oxidation(M)),每個肽段允許有1個不完全裂解位點，離子選擇(+1，+2，+3)，模式為單同位素，置信區間為95%，P < 0. 05，蛋白質得分36分以上結果可靠。用以上方法用鑑定到18種非冗餘蛋白在正常肝臟和免疫性肝纖維化肝臟的非實質細胞的差異表達。用LC-MS/MS和資料庫搜索鑑定得到NADH脫氫酶黃素蛋白2表達量在肝纖維化的肝非實質細胞中表達升高，對照蛋白質雙向凝膠電泳考馬斯亮藍染色的結果可以看出NADH脫氫酶黃素蛋白2的表達情況，如圖1所示，其中1、2、3代表三次重複實驗， Nor代表組織來源於正常肝臟，ILF代表組織來源於肝纖維化肝臟，圓圈代表NADH脫氫酶黃素蛋白2所在的位置。質譜分析獲得的NADH脫氫酶黃素蛋白2的詳細鑑定情況見表1。表1 :NADH脫氫酶黃素蛋白2的詳細鑑定結果蛋白質蛋白質描述搜庫得分等電點分子量(kDa)序列覆蓋率NDUV NADH 脫氫酶黃素蛋白 2 95 6. 23 27. 7 18%實施例3NADH脫氫酶黃素蛋白2差異表達的驗證本實施例中所使用的寡核甘酸引物由hvitrogen公司合成，Trizol購自hvitrogen公司，氯仿、異丙醇、乙醇購自Sigma公司，Glycogen、試劑盒 ReveryTra-Plus-TM, SYBR Green 染料購自 jToYoBo 公司。提取肝纖維化非實質細胞的RNA，進行逆轉錄反應，然後通過聚合酶鏈式反應 (PCR)擴增NADH脫氫酶黃素蛋白2的逆轉錄產物，與內參GAPDH進行對比，得到NADH脫氫酶黃素蛋白2mRNA的含量，具體如下向細胞中加入ImL Trizol,充分吹打lOmin，加入200uL氯仿劇烈混勻，室溫放置樣品5min，4 °C，13000r/min離心15min，取最上層的上清，加入等體積的異丙醇，再向體系中加入IuL Glycogen混勻；4°C, 12000r/min離心IOmin,向沉澱中加入300uL預冷的75%乙醇洗滌沉澱；4°C，12000r/min離心IOmin輕棄上清，再簡短離心後吸盡少量的 75%乙醇；吹乾後用20uL DEPC水溶解；將提取的RNA立即加入體系進行逆轉錄反應，按照 ReveryTra-Plus-TM試劑盒使用說明進行逆轉錄反應，獲得cDNA片段；PCR反應的25uL體系中含有2uL cDNA模板和7. 5uL 10nmol/L的引物對，反應條件為95°C 3min, (95°C 5s、 60 °C 5s,72 °C 20s)運行40個循環。NADH脫氫酶黃素蛋白2mRNA的量通過除以內參 GAPDHmRNA的量得到的比值即為所測NADH脫氫酶黃素蛋白2mRNA的含量，將正常肝臟中測得的NADH脫氫酶黃素蛋白2mRNA的含量做歸一化處理，即為1，得到待測樣品中NADH脫氫酶黃素蛋白2mRNA的相對含量，結果如圖2所示。在圖2中，與正常肝臟中的NADH脫氫酶黃素蛋白2mRNA的相對含量相比，免疫性肝纖維化的肝非實質細胞中的含量明顯較高，可見，NADH脫氫酶黃素蛋白2在免疫性肝纖維化組織中有較高水平的轉錄，該結果與蛋白質二維凝膠電泳的結果一致。綜上所述，NADH脫氫酶黃素蛋白2在正常肝臟和免疫性肝臟的肝非實質細胞中存在差異表達，顯然與免疫性肝纖維化的發生、發展有著密切的相關性，因此，以NADH脫氫酶黃素蛋白2作為一個分子標誌對其表達水平進行檢測可以用於製備檢測免疫性肝纖維化的藥物。相應的，特異性檢測NADH脫氫酶黃素蛋白2的寡核苷酸探針，由於其能檢測NADH 脫氫酶黃素蛋白2的轉錄水平，因而可用於製備檢測免疫性肝纖維化的藥物，或者用於製備檢測免疫性肝纖維化的製劑或試劑盒等，這對於本領域的技術人員來說是顯而易見的。 雖然有關NADH脫氫酶黃素蛋白2與免疫性肝纖維化的相關機制還有待進一步研究，但是將其作為免疫性肝纖維化的檢測標誌物卻是肯定的。
權利要求
1.NADH脫氫酶黃素蛋白2在製備檢測免疫性肝纖維化藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其中所述的藥物為檢測製劑或檢測試劑盒。
3.根據權利要求1所述的應用，其中所述的應用是確定NADH脫氫酶黃素蛋白2在肝非實質細胞中的轉錄是否存在上調表達。
4.NADH脫氫酶黃素蛋白2在製備m RNA的特異性的核苷酸探針中的應用。
5.NADH脫氫酶黃素蛋白2在製備m RNA的特異性的寡核苷酸探針中的應用。
6.一種檢測體外肝非實質細胞中NADH脫氫酶黃素蛋白2轉錄的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟A、用特異性探針檢測待檢肝非實質細胞中NADH脫氫酶黃素蛋白2mRNA的數量；B、將步驟A所得的數量與正常肝臟肝非實質細胞中NADH脫氫酶黃素蛋白aiiRNA的數量進行比較，當測得的mRNA高於正常值，則表示被檢樣本中NADH脫氫酶黃素蛋白2的轉錄異常。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，涉及一種NADH脫氫酶黃素蛋白2的應用。本發明通過篩選在免疫性肝纖維化和正常肝臟的肝非實質細胞中存在差異表達的蛋白，找到了一種在免疫性肝纖維化的肝非實質細胞中高表達的蛋白，反轉錄聚合酶鏈式反應實驗進一步證實了NADH脫氫酶黃素蛋白2的確在免疫性肝纖維化的肝非實質細胞中有較高的轉錄水平。鑑於NADH脫氫酶黃素蛋白2與免疫性肝纖維化的這種相關性，該蛋白可以在製備檢測免疫性肝纖維化藥物中應用。NADH脫氫酶黃素蛋白2的應用為檢測免疫性肝纖維化提供了一條全新的途徑。
文檔編號C12N15/11GK102268472SQ20101019241
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月3日 優先權日2010年6月3日
發明者姚亞敏, 張麗軍, 袁正宏, 賈小芳, 馬芳 申請人:復旦大學