細胞凋亡抑制劑的製作方法

2023-05-31 02:48:31 3

專利名稱：細胞凋亡抑制劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及細胞凋亡抑制劑。更詳細地說，本發明涉及含有已知的作為中樞神經型前列腺環素受體的特異配基的異卡巴環素(isocarbacyclin)衍生物為有效成分，對神經細胞等的細胞凋亡有優良抑制作用的新型細胞凋亡抑制劑。
細胞凋亡為遺傳性的細胞程序性死亡的一種，在形態學上發生以下的過程，即核固縮、細胞縮小、空泡化、細胞表面的平滑化、細胞間隔的擴大、與周圍的細胞分離、細胞的片斷化(細胞凋亡小體)、巨噬細胞引起的吞噬作用等。此外在生物化學方面，可發生因核酸內切酶活性所致的DNA核粒單位變成180～200鹼基長的斷片化(今日免疫學(Immunology Today)7:115-119,1986；科學(Science)245:301-305,1989)。
目前已知，細胞凋亡過程不僅是發育、分化、正常組織和細胞轉化的生理機制，而且還和腦梗塞後等的缺血性神經元壞死、腫瘤的退縮、放射線和抗癌藥的作用、AIDS等病毒感染引起的淋巴細胞減少、炎症等疾病有關。期待著對調節此過程藥物(即細胞凋亡抑制劑、細胞凋亡誘導劑)的開發將產生對腦神經系統、癌症和老化等多種疾病有新作用機制的藥物。
作為誘導細胞凋亡的物質、因素，已報導有糖皮質激素、穀氨酸等神經遞質的毒性、放射線照射、NK細胞、殺傷細胞、腫瘤壞死因子(TNF)、及淋巴細胞毒素(LT)等細胞因子。此外，也有報導表明蛋白質合成抑制劑放線菌酮和RNA合成抑制劑放線菌素D對人白血病細胞HL-60有誘導細胞凋亡的作用。更進一步，最近研製出了對應涉及免疫細胞凋亡的細胞膜分子Fas抗原的抗Fas單克隆抗體，對抗Fas抗體在醫藥方面的應用作了種種研究。
另一方面，作為抑制細胞凋亡的因子，已報導有白細胞介素1轉化酶抑制劑、成纖維細胞生長因子(bFGF)等。此外，還知道bcl-2相關基因的產物可抑制細胞凋亡，具有延長細胞生命的機能。但是，這些細胞凋亡抑制因子都是來源於生物體，還沒有以化學合成等的工業手段得到的細胞凋亡抑制物質。
本發明者們在對腦機能的生理作用進行詳細的研究過程中，發明了作為中樞神經型前列腺環素受體特異配基的各種異卡巴環素衍生物，申請了專利[特願平7-51589號(JP-A-245498/96)、特願平8-243122號(JP-A 87608/98)、特願平8-260957號(JP-A101610/98)、特願平9-160320號]。對這些物質生理活性進行進一步研究的結果發現其中有幾個化合物顯示出顯著的細胞凋亡抑制作用。
所以，本申請的發明進一步發展發明者們上述的見解，其目的在於提供能夠以化學合成方法大量廉價地製備的新型細胞凋亡抑制劑。
本申請中，作為解決上述課題的第1發明，提供了以下述式(1)所示的15R-異卡巴環素衍生物為有效成分的細胞凋亡抑制劑。
(式中R1表示碳數1～6的烴鏈，R2表示氫原子或保護基團)在第1發明的細胞凋亡抑制劑中，上述15R-異卡巴環素衍生物優選下述式(2)
所示的15R-16-m-甲苯基-17,18,19,20-四去甲異卡巴環素或其甲酯。
更進一步，本申請中，作為第2發明，提供了以下述式(3)所示的15-去氧-異卡巴環素衍生物為有效成分的細胞凋亡抑制劑。
(式中R1表示碳數1～6的烴鏈，R2表示氫原子或保護基團)在此第2發明中，上述15-去氧-異卡巴環素衍生物優選下述式(4)
所示的15-去氧-16-m-甲苯基-17,18,19,20-四去甲異卡巴環素或其甲酯。
還有，在上述式(1)和(3)中，R2表示的保護基團意思是製劑上允許的鹽、酯等，例如表示構成甲酯、乙酯等的烷基。
下面就其實施形式對本發明進行更詳細的說明。


圖1和圖2為表示對海馬神經元的細胞凋亡抑制作用的圖。
圖3是表示合成去氧-TIC的化學流程圖。
圖4(A)(B)為各標記異卡巴環素衍生物的全腦和丘腦攝取量經時作圖而成的圖。
作為本申請第1發明的細胞凋亡抑制劑有效成分的15R-異卡巴環素衍生物，例如15R-16-m-甲苯基-17,18,19,20-四去甲異卡巴環素(下面記為15R-TIC)或其甲酯，可按本申請的發明者們先前發明(特開平8-245498號公報)記載的方法製得。
此外，作為本申請第2發明有效成分的15-去氧-異卡巴環素衍生物，例如15-去氧-16-m-甲苯基-17,18,19,20-四去甲異卡巴環素(下面記為去氧-TIC)或其甲酯，一樣可按本申請的發明者們先前發明(特願平9-160320號)記載的方法製得。
本發明的細胞凋亡抑制劑，可以是以此卡巴環素衍生物的任一個作為實質性的有效成分製劑化而成的，但優選象下述參考例2所示的，在作用於中樞神經時，考慮向腦內的擴散效率，以其甲酯作為有效成分製劑化而成的。這些甲酯等在腦內轉化成15R-TIC或去氧-TIC等的異卡巴環素衍生物，發揮對神經細胞凋亡的抑制作用。此外，以抑制體細胞的細胞凋亡為目的時，可將15R-TIC或去氧-TIC等的異卡巴環素衍生物作為有效成分進行製劑化。此外，本發明的細胞凋亡抑制劑除了含有這些有效成分外，還可含有其它眾所周知的細胞凋亡抑制性物質。
本發明的細胞凋亡抑制劑可以以一般的藥物製劑形式給予人或動物，例如可以靜脈注射、皮下注射或經口給予人或動物。
本發明的細胞凋亡抑制劑含有5μmol/kg以上濃度的異卡巴環素衍生物作為有效成分，可以和其它成分一起進行製劑化。作為其它成分，例如有藥物製備通常所使用的填充劑、增量劑、粘合劑、溼潤劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、稀釋劑、賦形劑等。此外，作為藥物的劑型，根據治療目的可能選擇各種形式，作為其代表例如有片劑、丸劑、散劑、液體劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、栓劑、注射劑(液體劑、混懸劑等)等。
例如在調製注射劑時，優選將液體劑、乳劑和混懸劑滅菌且使之和血液等張；作為稀釋劑，例如可以用水、乙醇、丙二醇、乙氧化異硬脂醇、聚氧化異硬脂醇、聚氧乙烯縮水山梨糖醇脂肪酸酯類等。還有此時為了調製等張性的溶液，可能含有足夠量的食鹽、葡萄糖、甘油等，此外也可配合助溶劑、緩衝劑、無痛化劑等。
上述各種形式的藥物製劑，還可根據需要加入常用的著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑等，此外還可含有其它的藥物有效成分。
下面就實施例對本發明進行更詳細和具體的說明，但本發明並不僅限於此。實施例實施例115R-TIC對高氧培養所誘導的海馬神經元細胞凋亡的抑制效果。(1)實驗藥品異卡巴環素使用帝人株式會社提供的純品。15S-TIC用根據特開平8-245498號公報的實施例2製成的15S-16-m-甲苯基-17,18,19,20-四去甲卡巴環素甲酯，按同一公報實施例3的方法製得。15R-TIC按特開平8-245498號公報的實施例3相同方法製得。(2)方法從妊娠20天的雲斯特系(Wistar)大鼠無菌地摘出胎兒，從其腦切取海馬部分，將此海馬部分用含DL-半胱氨酸(0.2mg/ml)、牛血清白蛋白(0.2mg/ml)、葡萄糖(5mg/ml)、DNAseI(0.01％)和木瓜蛋白酶(9單位/ml)的PBS(無鈣、鎂)振蕩孵育30分鐘，分散海馬神經元。接著，將神經元細胞按5×105細胞/平方釐米的比率接種入裝有DME/F-12培養基(含5％馬血清和5％牛胎兒血清)的24孔平板(被覆有聚乙烯亞胺)，於5％二氧化碳的培養箱(9％氧氣)中培養兩天。在這之後，將培養液換成除去血清的DME/F-12培養基(含5μg/ml轉鐵蛋白、5μg/ml胰島素和5nM黃體酮)，以5μM的濃度往培養基中加入各待測藥品，30分鐘後移入50％氧氣中。在50％氧氣中培養48小時後，測定細胞的存活率。在9％氧氣中的神經元也被加入各待測藥品，並測定細胞的存活率。
此外，細胞存活率是在用4％多聚甲醛固定細胞後，用抗MAP2抗體染色，以DAB發色，從其200倍照片通過計測MAP2陽性細胞而算出。(3)結果圖1給出了在9％或50％氧氣中培養的海馬神經元的存活率(加入了50nm的待測藥品和5μm的其他樣品)。在9％氧氣中的存活神經元數目被作為對照值。添加了異卡巴環素和15S-TIC時，和對照組一樣，海馬神經元因高濃度氧所誘導的細胞凋亡而導致存活率大幅度降低。與此相反，添加了本發明的15R-TIC和脫氧-TIC時，可觀察到和眾所周知的細胞凋亡抑制物質bFGF一樣或更高比率的細胞存活率增加。
圖2給出了待測藥品對海馬神經細胞凋亡的劑量依賴性的效果。在圖2中使用9％氧氣中的神經元存活率作為對照值，加入了各待測藥品的神經元存活率用平均值±S.D.(n=4)表示。從圖2可以看出，異卡巴環素和15S-TIC沒有任何神經保護效果(在試驗濃度範圍內)，而15R-TIC和脫氧-TIC顯示出劑量依賴性的神經細胞凋亡抑制效果，濃度為3000nM時的存活率與對照組相當。脫氧-TIC和15R-TIC的IC50值分別為Ca.30nM和300nM。
從以上結果可以看出，作為本發明的細胞凋亡抑制劑有效成分的15R-TIC和脫氧-TIC對機體細胞尤其是神經細胞的細胞凋亡有優良的抑制作用。實施例2體內實驗15R-TIC對蒙古沙土鼠缺血損傷誘導的海馬CA1錐體神經元細胞凋亡的作用。
為了檢驗15R-TIC是否能在體內防止神經元死亡，應用滲透微泵，將15R-TIC連續7天(開始於短暫性缺血前2天，結束於其後5天)灌注入已經過短暫前腦缺血3分鐘的沙土鼠的左側室。通過計數尼氏染色部分細胞體大於10μm的神經元來評價CA1錐體神經元的存活數。
通過給藥15R-TIC阻斷了前腦缺血誘導的CAI錐體神經元死亡。15R-TIC灌注的沙土鼠的神經元數目(20μm厚的部分為984±299,n=4)和非缺血組沙土鼠相當(1061±220,n=4)。而且，溶劑灌注的沙土鼠的CA1錐體神經元數目(142±28,n=4)顯著小於對照組(沒有缺血處理)的或15R-TIC灌注的沙土鼠。溶劑灌注沙土鼠的錐體神經元發生進行性的變性，伴隨著核退縮和細胞排列的破壞。
這些結果表明15R-TIC在體內起著一個有效的神經元存活促進因子的作用，正如實施例1和2中在體外起的作用。參考例1根據特願平9-160320號的實施例1的記載，按下述的化學反應式，製備脫氧-TIC。製備過程如附圖3所示。(1)醛化合物(6)的合成往10ml的skulenk管中裝入(三苯基正膦亞基)乙醛(21.8mg,71.6μmol)的苯(1.5ml)溶液，接著加入上述醛化合物(5)(23.0mg,65.3μmol)的苯(1.5ml)溶液，回流20小時。反應混合物冷卻後除去溶劑，其殘渣用己烷和乙酸乙酯的2∶1及1∶1的混合物進行矽膠層析精製，得到醛化合物(6)(14.8mg,61％)。TLC上的Rf為0.55(己烷/乙酸乙酯=1∶1)。(2)碳酸酯化合物(7)的合成往10ml的圓底燒瓶中裝入上述醛化合物(6)(7.6mg,20.2μmol)的甲醇(1.0ml)溶液，接著加入CeCl7H2O(10mg,27μmol)和NaBH4(2mg,53μmol)，攪拌5分鐘。
在此之後往反應混合物中加入乙酸乙酯和水。用乙酸乙酯作為溶劑進行3次抽提。將有機相合併用MgSO4乾燥，過濾，然後在減壓下濃縮。
所得的粗生成物裝入10ml的圓底燒瓶中，用CH2Cl2(2.0ml)溶解。往此溶液中加入DMAP(37.0mg,0.303mmol)和氯甲酸甲酯(0.015ml,0.194mmol)，攪拌4小時。然後加入NaHCO3的水溶液，用乙酸乙酯進行抽提。合併有機相用Na2SO4乾燥，過濾，減壓濃縮。用己烷和乙酸乙酯4∶1的混合物進行矽膠層析精製，得到上述的碳酸酯化合物(7)(8.0mg,91％)。TLC上的Rf為0.42(己烷/乙酸乙酯=2∶1)(3)加成體化合物(9)的合成往20ml的skulenk管中加入三(二苯亞甲基丙酮)-二鈀(O)-氯仿加成物(2.1mg,2.0μmol)和1,2-二(二苯基膦基)乙烷(1.6mg,4.0μmol)的THF(1.0ml)溶液。往此溶液中加入上述碳酸酯化合物(7)(8.0mg,18.3μmol)和二碸(7.6mg,19.7μmol)的THF(1.0ml)溶液，攪拌15小時。
將反應混合物注入NH4Cl水溶液中，用乙酸乙酯進行抽提。合併有機相用MgSO4乾燥，過濾，減壓濃縮。用己烷和乙酸乙酯的2∶1、1∶1的混合物進行矽膠層析精製，得到目的加成體化合物(9)(9.6mg,70％)。TLC上的Rf為0.27(己烷/乙酸乙酯=1∶1的混合物)。(4)化合物(10):15-去氧-16-m-甲苯基-17,18,19,20-四去甲異卡巴環素甲酯的合成往10ml的圓底燒瓶中加入鎂(10mg,0.4mmol)，接著加入上述加成體化合物(9)(7.5mg,10.0μmol)的甲醇(1.5ml)溶液，攪拌3小時。
往反應混合物中加入HCl(1N)水溶液，用乙酸乙酯進行抽提。有機相合併用MgSO4乾燥，過濾，減壓濃縮。
將所得的粗生成物裝入10ml的圓底燒瓶中，用醋酸和水的9∶1混合物(2.0ml)溶解。攪拌40小時後，加入乙酸乙酯，用NaHCO3水溶液洗淨。有機相用Na2SO4乾燥，過濾，減壓濃縮。接著用3∶1的己烷和乙酸乙酯混合物進行矽膠層析精製，得到目的化合物(10)15-去氧-16-m-甲苯基-17,1 8,19,20-四去甲異卡巴環素甲酯(2.2mg,58％)。TLC上的Rf為0.6(己烷/乙酸乙酯=1∶1的混合物)。(5)化合物(4)15-去氧-16-m-甲苯基-17,18,19,20-四去甲異卡巴環素的合成往10ml的試管中裝入上述化合物(10)(1.0mg,2.6μmol)的甲醇(0.5ml)溶液，加入NaOH水溶液(3N,0.2ml)，在室溫下攪拌12小時。添加NaHCO3後加入乙酸乙酯和水。使之pH成3。
分離有機相，水相用乙酸乙酯抽提。合併有機相用MgSO4乾燥，過濾，在減壓下濃縮。用CH2Cl2和甲醇的10∶1混合物進行SiO2(0.5g)層析精製，得到目的化合物(4)15-去氧-16-m-甲苯基-17,18,19,20-四去甲異卡巴環素(0.9mg,94％)。TLC上的Rf為0.39(CH2Cl2/甲醇=9∶1的混合物)。參考例2用正電子放射圖譜法(PET)測定異卡巴環素衍生物向腦內的攝取量。(1)實驗藥品11C標記的15R-TIC-甲酯(RTA)按下述參考例方法製得的15R-TIC-甲酯的16-m-甲苯基的甲基碳用11C標記的標記化合物。11C標記的15R-TIC-甲酯(RTC)按下述參考例方法製得的15R-TIC-甲酯的16-m-甲苯基的甲酯部分的甲基碳用11C標記的標記化合物。(2)方法對成年彌猴(體重約8kg)將示蹤量(不超過0.2μg/kg)的上述實驗藥品進行靜脈注射，對從靜注後到60分鐘後腦內被測藥品的分布情況用PET裝置圖像化。從此圖像計測ROI(region of interest有關區域)值，根據下式算出攝取量。
(3)結果圖4(A)表示各標記化合物在全腦的攝取量，圖4(B)表示丘腦的攝取量。RTA和RTC顯示出相同的血腦屏障通過率(圖4A和B)，但是RTA在腦內的保留時間比RTC長，表明去酯化的11C標記15R-TIC在腦內的保留。換言之，RTA可以作為15R-TIC的前藥。從此結果可以確定，全身給予的15R-TIC-甲酯高效地轉移到腦內。而且，此標記化合物在給藥60分鐘後還滯留於腦內，說明15R-TIC-甲酯(15R-TIC的前體)在腦內轉化成15R-TIC和前列腺環素受體結合，在腦內發揮其細胞凋亡抑制作用。
從以上詳細說明可看出，本發明提供了以可以用化學合成方法簡便且便宜地製備的化合物為有效成分的新型細胞凋亡抑制劑。PET等研究表明，作為此藥劑有效成分的異卡巴環素衍生物能通過血腦屏障作用於中樞神經系統，因此對於神經細胞細胞凋亡引起的各種疾病的治療有效。
權利要求
1．以下述式(1)所示的15R-異卡巴環素衍生物為有效成分的細胞凋亡抑制劑，
式中R1表示碳數1～6的烴鏈，R2表示氫原子或保護基團。
2．根據權利要求1的細胞凋亡抑制劑，其中15R-異卡巴環素衍生物為下述式(2)
所示的15R-16-m-甲苯基-17,18,19,20-四去甲異卡巴環素或其甲酯。
3．以下述式(3)所示的15-去氧-異卡巴環素衍生物為有效成分的細胞凋亡抑制劑，
式中R1表示碳數1～6的烴鏈，R2表示氫原子或保護基團。
4．根據權利要求3的細胞凋亡抑制劑，其中15-去氧-異卡巴環素衍生物為下述式(4)
所示的15-去氧-16-m-甲苯基-17,18,19,20-四去甲異卡巴環素或其甲酯。
全文摘要
提供以可以用化學合成方法簡便且便宜地製備的15R－異卡巴環素衍生物或15－去氧－異卡巴環素衍生物為有效成分的細胞凋亡抑制劑。
文檔編號C07C69/732GK1219389SQ9812098
公開日1999年6月16日 申請日期1998年10月20日 優先權日1997年10月21日
發明者渡邊恭良, 鈴木正昭, 渡邊由美子, 羽裡篤夫, 佐藤拓巳 申請人:科學技術振興事業團, 羽裡篤夫