D－氨甲醯水解酶的突變體及其應用的製作方法
2023-05-30 22:48:51 1
專利名稱:D－氨甲醯水解酶的突變體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程領域，具體內容涉及D-氨甲醯水解酶的突變體及其在生產D-對羥基苯甘氨酸中的應用。
背景技術：
β-內醯胺類抗生素具有抗菌活力強，廣譜低毒等優點，是臨床控制細菌感染的首選藥物之一。D-對羥基苯甘氨酸(DHPG)是合成該類藥物的一種重要中間體，用於製備羥氨苄青黴素和羥氨苄頭孢菌素的側鏈。D-對羥基苯甘氨酸的製備在工業上有化學合成法和酶法兩種方法，其中化學合成法成本高，汙染大；而酶法具有成本較低、無汙染的特點，因此日益受到重視。酶法的技術原理是用D-乙內醯脲酶(也稱為D-海因酶)將DL-對羥基苯海因不對稱水解成N-氨甲醯基-D-對羥基苯甘氨酸，然後在N-氨甲醯-D-胺基酸水解酶(也稱為D-氨甲醯水解酶，簡稱DCase)的作用下，將N-氨甲醯基-D-對羥基苯甘氨酸不可逆水解轉變成DHPG。
工業生產中發現在兩步酶法生產D-對羥基苯甘氨酸的過程中，由於DCase催化效率低、穩定性差的缺點，導致中間物N-氨甲醯基-D-對羥基苯甘氨酸大量積累，終產物D-對羥基苯甘氨酸產率低。因此DCase成為兩步酶法反應系統中的一個關鍵酶、限速酶。
隨著基因工程技術的發展，大腸桿菌表達系統的日臻成熟，將DCase基因在大腸桿菌表達系統中進行過量表達，從而獲得高表達、高活力的基因工程菌株成為可能。例如，許禎等從一株能將DL-對羥基苯海因轉化為D-對羥基苯甘氨酸的菌株中，成功克隆出DCase基因，Genebank登陸號為AF320814(許禎等，生物工程學報，2002，18(2)149-54)。我們在將DCase基因構建入pET表達系統，轉化E.coli過量表達後，對目的蛋白的活性和SDS-PAGE進行分析，結果顯示E.coli可以大量表達出重組蛋白，但是70-80％左右的重組蛋白是以包涵體的形式存在，嚴重地影響了工程酶的功能發揮。如何使更多的目的蛋白表達後能夠正確摺疊成為有活力的蛋白成為研究和努力的方向。
雖然天然酶分子在自然條件下已進化了千百萬年，但是因為天然酶分子存在的環境與實際應用的環境不同，酶分子仍然蘊藏著巨大的進化潛力。運用分子定向進化技術比如易錯PCR技術(error-prone PCR)、DNA改組(DNA shuffling)技術和定點突變技術等對微生物來源的酶進行分子改性和人工進化在近些年中取得了令人矚目的進展(參見王正祥等，生物工程學報，16(3)，2000)，已經成為酶的人工定向進化常用手段。這種分子水平上的人工定向進化技術是通過體外重組來改造靶基因，並定向篩選具有預期性狀的突變體，從而創造具有新功能的改性的酶，大大加速了蛋白質的進化進程。
發明內容本發明的目的就在於通過定向進化技術對目的基因進行隨機突變，並用高通量的篩選方法，獲得可溶性表達提高的D-氨甲醯水解酶突變體。
本發明的另一個目的在於提供所述D-氨甲醯水解酶突變體在D-對羥基苯甘氨酸生產中的應用。
為達到上述目的，本發明使用易錯PCR技術和DNA改組技術相結合的方法對DCase基因進行隨機突變，再通過一種蛋白質可溶性監測系統將正突變檢出。
本發明採用一種蛋白質可溶性監測系統(W.Christian Wigley etc.2001 NatureBiotechnology 19，131-136)檢測重組蛋白的可溶性。該監測系統是建立在β-半乳糖苷酶的α互補的結構基礎上，通過載體上融合的β-半乳糖苷酶的α片段與大腸桿菌中ω片段實現互補來檢測目的蛋白的可溶性。
通過上述方法，本發明人篩選得到了3個重組蛋白可溶性表達增加的突變體，分別為A18T、Y30N和K34E。
D-氨甲醯水解酶的Genebank登陸號為AF320814，由304個胺基酸組成，其編碼DNA序列包括915bp，其編碼DNA序列及胺基酸序列如SEQ ID NO.1和2所示。本發明所獲得的3個突變體與DCase的區別分別為1、A18T的第18位的胺基酸由丙氨酸突變為蘇氨酸，相對應地，其編碼DNA序列中52-54bp的GCG變為ACG；2、Y30N的第30位的胺基酸由酪氨酸突變為天冬醯胺，相對應地，其編碼DNA序列中88-90bp的TAC變為AAC；3、K34E的第34位的胺基酸由賴氨酸突變為穀氨酸，相對應地，其編碼DNA序列中100-102bp的AAA變為GAA。
在獲得上述3種突變體之後，發明人進一步將上述3個突變體進行疊加突變，獲得一個新的突變體A18T/Y30N/K34E，該疊加突變酶的第18位的胺基酸由丙氨酸突變為蘇氨酸，第30位的胺基酸由酪氨酸突變為天冬醯胺，第34位的胺基酸由賴氨酸突變為穀氨酸。相對應地，其編碼DNA序列中52-54bp的GCG變為ACG，88-90bp的TAC變為AAC，100-102bp的AAA變為GAA。
相比於野生型Dcase，本發明的4個突變體A18T、Y30N、K34E和A18T/Y30N/K34E的每毫升發酵菌體的酶活分別提高1倍、1.5倍、4.7倍和8.4倍；可溶性表達分別是野生酶的1.3、1.4、1.9、3.2倍，其中尤以疊加突變體為最佳，顯示出在D-對羥基苯甘氨酸生產中的潛在應用價值。
具體實施方式以下結合實施例對本發明作進一步的說明，需要指出的是，本實施例僅用於解釋本發明，而非對本發明範圍的限制。
實施例1、DCase基因的克隆1.1、PCR擴增設計一對引物5』-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3』；和5』-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGAT-3』以質粒pXZ-total(許禎等，生物工程學報，2002，18(2)149-54)DNA為模板，進行PCR擴增。PCR條件為94℃變性10min後，94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共進行30循環，最後72℃充分延伸10min。
1.2、含DCase基因的質粒構建PCR擴增結束後，先使用1％的瓊脂糖凝膠進行電壓為100伏的核苷酸電泳，割膠後，用膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA片段，接著按照寶生物公司(網址www.takara.com.cn)2005-2006產品目錄說明書描述的方法，將所獲得的DNA片段和載體pET-28b(Novagen公司)用限制性內切酶NdeI和HindIII進行雙酶切。
酶切產物再次進行電壓為100伏的核苷酸電泳，回收相應大小分別為900bp、5300bp左右的片段和載體，最後將載體和片段按1∶4的比例混合後，加入1個單位的T4連接酶，16℃連接10小時以上。
連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含卡那黴素抗生素的LB平板上篩選，重組子經過Nde I和HindIII雙酶切和DNA測序驗證，得到基因序列正確的克隆，其序列如SEQ ID NO.1所示，與Genebank登陸號為AF320814的DCase基因相同，稱為野生型，將其命名為WT。
1.3、表達DCase的基因工程菌株構建用常規方法(郝福英等編著，分子生物學實驗技術，北京大學出版社，1998，第12-15頁)將WT轉化入E.coli BL21(Novagen公司)，即獲得DCase基因的大腸桿菌表達菌株。
實施例2、DCase基因的隨機突變2.1、易錯PCR100μl易錯PCR反應體系為20ng的DNA模板pXZ-total，各30pmol的一對引物5』-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3』和5』-CCCAAGCTTGAGTTCCGCGAT-3』，7mMMgCl2，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，0.01％gelatin，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，0.15mM MnCl2，和5個單位的Taq酶(上海sangon公司)。
PCR反應條件為94℃變性10min後，94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共進行30循環，最後72℃充分延伸10min。
2.2、DNA改組使用膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)純化PCR產物。按照文獻(StemmerWPC.Nature，1994，370(6488)389.)所述的方法，將獲得的DNA片段進行DNA改組，包括降解DNA、回收50-200bp的小片段、無引物PCR、有引物PCR。
經過DNA改組後獲得的DNA重組片段，按照寶生物公司2005-2006產品目錄說明書描述的方法，用Nde I和HindIII雙酶切消化後，與經過相同酶切的pMAL-c2x(NEB公司)載體進行連接反應，反應條件為載體和片段按1∶4的比例混合，加入1個單位的T4連接酶，16℃連接過夜。得到了超過104個克隆的突變體庫。
實施例3、突變體庫的篩選3.1、突變體轉化通過電擊的方法將步驟2.2中構建得到的突變體轉化到DH5α菌株中。轉化細胞塗布於含Ampr抗生素、IPTG誘導劑和顯色底物X-gal的LB平板上(蛋白腖1％、酵母提取物0.5％、氯化鈉1％、瓊脂2％)，37℃培養。
3.2、突變體篩選與鑑定菌株生長16h後，挑取每塊平板上藍色深的克隆，用小量質粒抽提試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)抽提質粒，使用Nde I和HindIII進行雙酶切鑑定和測序測定。
3.3、突變體基因擴增設計一對引物5』-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3』；和5』-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGAT-3』以步驟3.2中所獲的突變體質粒為模板，進行PCR擴增。
PCR條件為94℃變性10min後，94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共進行30循環，最後72℃充分延伸10min。
3.4、含Dcase突變基因的質粒構建PCR擴增結束後，先使用1％的瓊脂糖凝膠進行電壓為100伏的核苷酸電泳，割膠後，用膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA片段，接著按照寶生物公司(網址www.takara.com.cn)2005-2006產品目錄說明書描述的方法，將所獲得的DNA片段和載體pET-28b(Novagen公司)用限制性內切酶Nde I和HindIII進行雙酶切。
酶切產物再次進行電壓為100伏的核苷酸電泳，回收相應大小分別為900bp、5300bp左右的片段和載體，最後將載體和片段按1∶4的比例混合後，加入1個單位的T4連接酶，16℃連接10小時以上，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含卡那黴素抗生素的LB平板上篩選，重組子經過Nde I和HindIII雙酶切和DNA測序驗證，得到正確的含Dcase突變基因的質粒。
3.5、DCase突變體的菌株構建與表達用常規方法(郝福英等編著，分子生物學實驗技術，北京大學出版社，1998，第12-15頁)將含Dcase突變基因構建的質粒轉化E.coli BL21(Novagen公司)，獲得突變體的大腸桿菌表達菌株。
將構建獲得的大腸桿菌表達菌株先在LB試管中(蛋白腖1％、酵母提取物0.5％、氯化鈉1％)培養過夜，按1％體積比的接種量接於裝有30ml LB液體培養基的250ml搖瓶中，生長至OD600≈0.6，然後加入0.3mM的IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導表達，放於200轉/分鐘的搖床，培養過夜。
4000轉/分鐘，離心10分鐘，收集菌體並懸浮在PBS緩衝液中，經超聲波破碎處理，離心，取上清，沉澱物進行SDS-PAGE分析。
3.6、篩選結果通過上述篩選步驟，從突變體庫中，篩選獲得了3個重組蛋白可溶性表達增加的突變體。它們分別是A18T、Y30N和K34E，其可溶性表達量如表1所示，分別是野生酶的1.3、1.4和1.9倍。
表1、野生型DCase和4個突變體的重組蛋白可溶性表達比較
3.7、突變體測序經對三個突變體的胺基酸序列和基因序列進行測定，發現與野生型D-氨甲醯水解酶相比，分別是3個位置的胺基酸發生了變化，相應的編碼DNA也發生了改變，具體如表2所示表2、三個DCase突變體的胺基酸序列和基因序列變化結果
實施例4、三個突變位點的疊加4.1、PCR擴增以含有K34E突變的DCase基因為模板，分別使用引物對5』-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3』；和5』-GCGTGTCTCCGTGCGCGCGAT-3』；另一引物對5』-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGAT-3』；和5』-ATCGCGCGCACGGAGACACGC-3』；進行PCR擴增。
PCR條件為94℃變性10min後，94℃變性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸30sec，共進行30循環，最後72℃充分延伸10min。
42、回收PCR產物PCR擴增結束後，先使用1.5％的瓊脂糖凝膠進行電壓為100伏的核苷酸電泳，割膠後，用膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)回收50bp、850bp左右的DNA片段。
4.3、再次PCR擴增以步驟4.2中所回收的兩個片段為模板，使用引物對5，-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3』；和5』-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGAT-3』；進行PCR擴增。
PCR條件為94℃變性6min後，94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共進行30循環，最後72℃充分延伸10min。
4.4、PCR產物測序PCR擴增結束後，先使用1％的瓊脂糖凝膠進行電壓為100伏的核苷酸電泳，割膠後，用膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA片段，測序。
經測序顯示，所得D-氨甲醯水解酶的突變體是A18T和K34E的突變點融合突變體，即野生型DCase的DNA序列中52-54bp的GCG變為ACG，100-102bp的AAA變為GAA。
4.5、再次PCR擴增以步驟4.4中所得的A18T/K34E突變體的DNA為模板，分別使用引物對5』-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3』；和5』-CGTCAGCATGTTGAGAAGACGAA-3』；另一對引物5』-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGAT-3』；和5』-TTCGTCTTCTCAACATGCTGACG-3』進行PCR擴增。
PCR條件為94℃變性10min後，94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共進行30循環，最後72℃充分延伸10min。
4.6、回收PCR產物PCR擴增結束後，先使用1.5％的瓊脂糖凝膠進行電壓為100伏的核苷酸電泳，割膠後，用膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)回收90bp、800bp左右的DNA片段。
4.7、再次PCR擴增以步驟4.6所回收的上述兩個片段為模板，使用引物對5』-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3』；和5』-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGAT-3』進行PCR擴增，PCR條件為94℃變性6min後，94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共進行30循環，最後72℃充分延伸10min。
4.8、PCR產物測序PCR擴增結束後，先使用1％的瓊脂糖凝膠進行電壓為100伏的核苷酸電泳，割膠後，用膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA片段，測序。
經測序顯示，所得D-氨甲醯水解酶的突變體是A18T、Y30N和K34E的突變點融合突變體，即野生型DCase的DNA序列中52-54bp的GCG變為ACG，88-90bp的TAC變為AAC，100-102bp的AAA變為GAA。
4.9、A18T/Y30N/K34E突變體的構建按照寶生物公司2005-2006產品目錄說明書描述的方法，將步驟4.8中所獲得的DNA片段和載體pET-28b(Novagen公司)經限制性內切酶Nde I和HindIII雙酶切，再次進行電壓為100伏的核苷酸電泳，用膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)回收900bp、5300bp左右的片段和載體。
將載體和片段按1∶4的比例混合後，加入1個單位的T4連接酶，16℃連接10小時。
連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含卡那黴素抗生素的LB平板上篩選，重組子經過Nde I和HindIII雙酶切和DNA測序驗證，最終獲得3點突變的克隆，命名為A18T/Y30N/K34E。
實施例5、突變體可溶性表達對比按照步驟3.5中所述的方法，測定野生型和D-氨甲醯水解酶突變體(A18T、Y30N、K34E和A18T/Y30N/K34E)可溶性情況，結果見表1。試驗表明，多個突變疊加的D-氨甲醯水解酶突變體相比單個突變體，重組蛋白可溶性表達進一步增加，且都優於野生型。比如，A18T/Y30N/K34E的可溶性表達蛋白比例高達81.4％，是野生酶的3.2倍，即包涵體的比例僅為18.6％。因此在D-對羥基苯甘氨酸的生產中這4個突變體都具有潛在的應用優勢。
實施例6、野生型酶和突變型酶的單位菌體酶活比較6.1、菌體(粗酶)製備分別取實施例5中發酵培養的菌體(A18T、Y30N、K34E和A18T/Y30N/K34E)各1ml，加入1.5ml的離心管中，離心，棄上清。在-20℃冰箱凍存2小時以上，備用。
6.2、酶促水解反應各菌體分別懸浮於1ml的0.1M、pH7.5的磷酸緩衝液中，取400ul的懸浮液，加入400μl的100mM的N-氨甲醯-D-對羥基苯甘氨酸底物，進行水解反應。在40℃的水浴搖床，以150轉/分鐘的速度振蕩。
反應30分鐘後，加入800μl的10％鹽酸中止反應。
6.3、酶活測定取適量反應液進行稀釋後，13000轉/分鐘離心5分鐘，取上清進行HPLC測定。
HPLC測定D-氨甲醯水解酶的方法是以含磷酸2.25mM，磷酸二氫鉀20mM，pH5.0的甲醇與水為流動相，其比例是20∶80，流速為1.0ml/min，在210nm處檢測不同含量物質以及相同物質的不同峰高和保留值，繪製出標準曲線。
1U酶活定義為每分鐘產生1微摩爾D-對羥基苯甘氨酸所需的酶量。
6.4、菌體酶活比較酶活測定結果見表3表3、野生型DCase和4個突變體的單位菌體酶活比較
相比於野生型D-氨甲醯水解酶，突變酶A18T、Y30N、K34E和A18T/Y30N/K34E的單位菌體的酶活分別提高1倍、1.5倍、4.7倍和8.4倍，其中疊加突變酶的優勢尤其明顯。
上述實施例顯示，4個突變酶在可溶性表達和單位菌體酶活方面都優於野生型，同時也進一步表明，突變疊加具有很大潛力，採用定向進化技術改造工業用酶是一個十分有效的手段。
此外應理解的是，在閱讀了本發明的講述內容之後，在不偏離本發明之精神和範圍的前提下，本領域技術人員對本發明作任何修飾或修改都是應包括在本申請所附權利要求
書所限定的範圍之內。
序列表110中國科學院上海生命科學研究院120D-氨甲醯水解酶的突變體及其應用130051644N1602170PatentIn version 3.32101211915212DNA213Ralstonia pickettii220
221CDS222(1)..(915)4001atg aca cgt cag atg ata ctt gca gtg gga caa caa ggt ccg atc gcg 48Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala1 5 10 15cgc gcg gag aca cgc gaa cag gtc gtc gtt cgt ctt ctc tac atg ctg 96Arg Ala Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Val Arg Leu Leu Tyr Met Leu20 25 30acg aaa gcc gcg agc cgg ggc gcg aat ttc att gtc ttc ccc gaa ctc 144Thr Lys Ala Ala Ser Arg Gly Ala Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu35 40 45gcg ctt acg acc ttc ttc ccg cgc tgg cat ttc acc gac gag gcc gag 192Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu50 55 60
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權利要求
1.一種D-氨甲醯水解酶的突變體，其特徵在於，具有以下任一項所述的胺基酸序列A、SEQ ID NO2所示的D-氨甲醯水解酶的胺基酸序列中第18位的丙氨酸突變為蘇氨酸；B、SEQ ID NO2所示的D-氨甲醯水解酶的胺基酸序列中第30位的酪氨酸突變為天冬醯胺；C、SEQ ID NO2所示的D-氨甲醯水解酶的胺基酸序列中第34位的賴氨酸突變為谷醯胺；D、SEQ IDNO2所示的D-氨甲醯水解酶的胺基酸序列中第18位的丙氨酸突變為蘇氨酸，第30位的酪氨酸突變為天冬醯胺，且第34位的賴氨酸突變為谷醯胺。
2.如權利要求
1所述的D-氨甲醯水解酶的突變體，其特徵在於，該突變體的胺基酸序列為SEQ ID NO2所示的D-氨甲醯水解酶的胺基酸序列中第18位的丙氨酸突變為蘇氨酸，第30位的酪氨酸突變為天冬醯胺，且第34位的賴氨酸突變為谷醯胺。
3.編碼權利要求
1所述的D-氨甲醯水解酶突變體的DNA序列。
4.如權利要求
3所述的DNA序列，其特徵在於，具有以下任一項所述的DNA序列A、SEQ ID NO1所示的D-氨甲醯水解酶的基因序列中第52-54bp的GCG突變為ACG；B、SEQ ID NO1所示的D-氨甲醯水解酶的基因序列中第88-90bp的TAC突變為AAC；C、SEQ ID NO1所示的D-氨甲醯水解酶的基因序列中第100-102bp的AAA突變為GAA；D、SEQ ID NO1所示的D-氨甲醯水解酶的基因序列中第52-54bp的GCG突變為ACG，第88-90bp的TAC突變為AAC，且第100-102bp的AAA突變為GAA。
5.如權利要求
4所述的DNA序列，其特徵在於，該DNA序列為SEQ ID NO1所示的D-氨甲醯水解酶的基因序列中第52-54bp的GCG突變為ACG，第88-90bp的TAC突變為AAC，且第100-102bp的AAA突變為GAA。
6.如權利要求
1或2所述的D-氨甲醯水解酶突變體在D-對羥基苯甘氨酸生產中的應用。
7.如權利要求
3所述的D-氨甲醯水解酶突變體的編碼基因在D-對羥基苯甘氨酸生產中的應用。
8.如權利要求
7所述的應用，其特徵在於，將如權利要求
3所述的DNA序列克隆入宿主細胞，並將該宿主細胞的發酵菌體用於D-對羥基苯甘氨酸的生產。
9.如權利要求
8所述的應用，其特徵在於，所述宿主細胞是大腸桿菌。
10.如權利要求
9所述的應用，其特徵在於，所述宿主細胞是大腸桿菌E.coli BL21。
專利摘要
本發明公開了D－氨甲醯水解酶的四個突變體及其在生產D－對羥基苯甘氨酸中的應用，屬於生物工程領域。通過定向進化技術獲得的突變酶1的第18位的胺基酸由丙氨酸突變為蘇氨酸，突變酶2的第30位的胺基酸由酪氨酸突變為天冬醯胺，突變酶3的第34位的胺基酸由賴氨酸突變為穀氨酸，在此基礎上進行了三個位點疊加突變，獲得突變酶4。這四個突變酶具有更高的可溶性表達水平，並在D－對羥基苯甘氨酸的生產中表現出更高的酶活力。
文檔編號C12N15/55GK1995336SQ200610023147
公開日2007年7月11日 申請日期2006年1月6日
發明者姜衛紅, 姜世民, 楊蘊劉, 楊晟 申請人:中國科學院上海生命科學研究院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan