用於汞離子檢測的dna電化學生物傳感器及其構建方法

2023-05-30 20:37:21 1

專利名稱：用於汞離子檢測的dna電化學生物傳感器及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種電化學生物傳感器，尤其是涉及一種用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器及其構建方法。
背景技術：
生物傳感器是是發展生物技術必不可少的一種先進的檢測方法與監控方法，也是物質分子水平的快速、微量分析方法。電化學生物傳感器具有快速、簡便、靈敏和價廉等優點，在環境監測、臨床檢驗、食品和藥物分析、生化分析等研究中有著廣泛的應用前景。自從 Hg2+介導的胸腺嘧啶(T)錯配被發現後，不斷地湧現出各種基於DNA的檢測方法，並逐漸成為監測Hg2+的主要方法。對於DNA電化學生物傳感器的製備及在其汞離子檢測中的應用進行研究，目的是為了進一步提高對重要生命物質DNA的認識和利用能力。過氧化氫含有三價鐵離子，具有電化學活性，在電極表面會發生氧化還原反應，過氧化氫上的三價鐵離子在電極表面被還原成二價鐵離子，產生電化學信號。循環伏安法、差分脈衝伏安法是電化學分析中的常用方法。循環伏安法是改變電位以得到氧化還原電流方向的電化學分析方法，主要是以施加一循環電位的方式來進行，從一起始電位以固定速率施加到一終點電位，再以相同速率改變回起始電位，此為一個循環，並記錄電流-電勢曲線。當某物質具有電化學活性時，會出現氧化峰和還原峰，當從低電位往高電位掃描時，會使分析物產生一氧化電流的氧化峰，當從高電位往低電位掃描時，則產生一還原電流的還原峰。對於一個新的電化學體系，首選的研究方法往往就是循環伏安法，可稱之為「電化學的譜圖」，常用於電極反應的性質、機理和電極過程動力學參數的研究。差分脈衝伏安法是在一個線性變化的掃描電壓上， 施加一等振幅的脈衝，所測定的是施加脈衝振幅前後的電流差Ai，記錄的曲線只有氧化峰或還原峰，同樣，當從低電位往高電位掃描時，會使分析物產生一氧化電流的氧化峰，當從高電位往低電位掃描時，則產生一還原電流的還原峰。差分脈衝伏安法靈敏度好、解析度高，具有很好的檢測能力，常被用來定量分析。中國專利CN101846648A公開一種石墨烯量子點修飾的電化學生物傳感器及其製備方法。該電化學生物傳感器為三電極體系傳感器，所述的三電極中的對電極是鉬電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為表面包覆有I 4層石墨烯量子點的玻碳電極。該發明的石墨烯量子點修飾的電化學生物傳感器能成功識別最低濃度為50nM的目標單鏈DNA 的電化學生物傳感器，當有目標單鏈DNA時，取等量互補單鏈DNA與其形成雙鏈DNA，其電化學信號與僅有互補單鏈DNA有明顯差別，便能起到快速檢測目標單鏈DNA的作用。而且該段單鏈DNA不需巰基或螢光基團修飾，應用方便。該發明所檢測的單鏈DNA是一段任意序列的核酸，理論上，該發明適用於不能形成內部雙鏈的任意單鏈核酸序列，因此，將其置換成跟疾病相關的特異序列基因，即可用於疾病相關的基因檢測，應用前景廣泛。

發明內容
本發明的目的在於提供一種簡便的、廉價的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器及其構建方法，可通過汞離子特異性地與探針DNA結合引起的電化學信號變化達到能夠特異性地檢測水溶液中的汞離子檢測水溶液中汞離子的目的。所述用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器是利用DNA分子中的巰基和金盤電極的表面形成穩定的Au-S鍵，將DNA分子自組裝到金盤電極的表面，然後利用汞離子與DNA 分子中的胸腺嘧啶(T)特異性結合，特異性檢測水溶液中的汞離子。所述用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器設有金盤電極和信號劑，在金盤電極表面自組裝單鏈DNA分子層，所述單鏈DNA分子層作為探針，每條探針序列均為5』 -(T) η-3』，η > 5,5』端修飾有巰基；所述信號劑為過氧化氫溶液。所述金盤電極的直徑可為2mm。所述用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器的構建方法包括以下步驟I)將金盤電極進行清洗，吹乾；2)在離心管中加入巰基化DNA，將步驟I)吹乾後的金盤電極插入離心管中孵育， 巰基修飾的DNA便可通過Au-S鍵固定在金電極表面；3)將固定DNA探針的金盤電極浸入巰基己醇中，室溫下孵育後，得到排列整齊的 DNA探針，即用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器。在步驟I)中，所述金盤電極的直徑可為2_，所述清洗可將金盤電極依次進行拋光、超聲和電化學清洗，然後用純水清洗；所述吹乾可採用氮氣吹乾。在步驟2)中，所述巰基化DNA可採用200 μ L濃度為I 10 μ M的巰基化DNA ;所述孵育可放置4 °C冰箱孵育。在步驟3)中，所述巰基己醇可採用ImM巰基己醇；所述室溫下孵育的時間可為 Ih0本發明構建的DNA電化學傳感器有以下優勢I)所構建的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器在不需進行電化學標記且檢測時間和成本較少的條件下，獲得了較高的靈敏性，檢測下限達50nM。2)所構建的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器在多種其他金屬離子與汞離子同時存在的條件下仍能特異性地檢測汞離子，具有良好的選擇性。3)所構建的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器在對海水等實際樣品的檢測中不受其中幹擾物質的影響，對汞離子具有良好的回收率(104. 55% 105. 72% )。4)所構建的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器在不同時期(O天、2天和7 天)對汞離子均能保持較好的靈敏性，具有良好的重現性和較高的穩定性。


圖I為本發明所述用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器檢測汞離子的示意圖。由圖I可見，單鏈DNA通過巰基連接在電極上時呈無規捲曲狀排列，經巰基己醇(MCH) 處理後得到排列整齊的單鏈DNA。若不存在汞離子或銀離子，排列整齊的單鏈DNA能夠有效地阻止水溶液中過氧化氫在電極表面發生電子轉移；然而當水溶液中存在汞離子或銀離子時，對應的傳感器電極表面單鏈DNA轉變成雙鏈DNA，自組裝形成的單分子層出現空隙，導致過氧化氫能夠接觸到電極表面而產生電化學信號。圖2為T5/MCH修飾電極與5μΜ汞離子反應Ih前後的循環伏安圖。結果顯示當溶液中不存在汞離子時，循環伏安電流較弱，在-O. 4V電位上的電流僅為-O. 303μΑ； 而當溶液中存在5μ M的汞離子時，循環伏安電流增大了 13倍，在-O. 4V電位上的電流達到-3. 98 μ Α。表明汞離子的存在導致電極表面DNA結構改變，使過氧化氫能夠接觸到金電極表面產生電子轉移。圖2中橫坐標為循環電位E vs(Ag/AgCl) (V)，縱坐標為循環電流 I ( μ A)，點線為T5/MCH修飾電極與5 μ M汞離子反應前，實線為T5/MCH修飾電極與5 μ M汞離子反應Ih後。圖3為T5/MCH修飾電極在不同掃描電位範圍內與2 μ M汞離子反應前後的循環伏安圖。結果顯示T5/MCH修飾電極在不同掃描電位範圍內與2μΜ汞離子反應前電流信號很弱，與2 μ M萊離子反應後電流信號明顯增強；圖3中橫坐標為循環電位E vs (Ag/AgCl) (V)，縱坐標為循環電流I ( μ A)。點線表示T5/MCH修飾電極在不同掃描電位範圍內與2 μ M 汞離子反應前的循環伏安圖；實線表示T5/MCH修飾電極在不同掃描電位範圍內與2 μ M汞尚子反應Ih後的循環伏安圖。圖4為在不同電位上傳感器與汞離子反應前後的電流變化值(I-IciVIci :1。為反應前的電流值，I為反應後的電流值。結果顯示= (I-Itl)Acl值隨著掃描電位的增加出現先增大後減小，掃描範圍在O. I -O. 4V時達到最高值，為7. 39±0. 13。圖4中橫坐標為循環電位E vs (Ag/AgCl) (V)，縱坐標為與汞離子反應前後的電流變化值(I-IJ/I。。圖5為T5修飾電極和T5/MCH修飾電極與2 μ M汞離子反應不同時間後的電流變化值(I-IciVIci, I0和I分別為反應前和反應後-O. 4V電位上的電流值。結果顯示τ5修飾電極隨著反應時間的增加，電流變化不明顯，即使反應SOmin後電流變化值(I-Itl)Atl也僅為 1.51±0. 15。修飾電極出現大幅增加，在反應80min後電流變化值為
6.71±0. 19。表明無MCH修飾的電極，排列紊亂的單鏈DNA探針不能有效地阻止過氧化氫的電子轉移。因此構建以過氧化氫為氧化還原指示劑的DNA生物傳感器必需用MCH處理。 圖5中橫坐標為電極與2μ M汞離子反應的時間t(min)，縱坐標為反應前後的電流變化值 (I-I0)/I0^曲線a*T5修飾電極與2μΜ汞離子反應不同時間後的電流變化值(I-IW曲線b為T5/MCH修飾電極與2 μ M汞離子反應不同時間後的電流變化值(I-g/%。圖6ST5/MCH修飾電極與不同濃度汞離子反應Ih後的循環伏安圖。結果顯示隨著汞離子濃度的增加，循環伏安電流逐漸增大。這是由於汞離子的濃度越大，金電極表面形成的雙鏈DNA越多，在DNA單分子層間出現更多的空隙，導致更多的過氧化氫能夠接觸金電極表面發生電子轉移而產生電化學信號。圖6中橫坐標為循環電位E vs (Ag/AgCl) (V),縱坐標為循環電流I ( μ A)，圖中曲線由上至下依次表示T5/MCH修飾電極與汞離子濃度為0， O. 05,0. 2,0. 5，1，2 和 3μΜ。圖7為汞離子的標準曲線圖，顯示汞離子濃度在O I μΜ的範圍內具有很好的線性關係y = -I. 2814x-0. 3197 (R2 = O. 9984)，且檢測極限達到20nM。圖7中橫坐標為汞離子濃度C ( μ M)，縱坐標為循環電流I ( μ Α)。圖8為T5/MCH修飾電極與不同離子反應後於-O. 4V電位上電流值的對比圖。結果顯示，其它各種金屬離子如 Na+，K+，Li+，Ca2+，Mg2+，Co2+，Cd2+，Ni2+，Ba2+，Cu2+ 和 Mn2+ 等所產生的循環伏安電流值都很微弱，而汞離子即使在含有其它金屬離子的條件下均能產生強的電流。表明汞離子能夠與兩個T鹼基特異地結合形成T-Hg2+-T複合物，而其它金屬離子均無此特性，因此此種DNA電化學生物傳感器具有較好的選擇性。圖8中左起第一個柱子代表5 μ M Hg2+，第二個柱子代表5 μ M Hg2+與其它所有離子(各ImM)的混合液。圖9為T5/MCH修飾電極在O天、2天和7天與O. I μ M汞離子反應前後的還原峰電流變化值(I-Ic1)Ac1=Ic1為反應前的電流值，I為反應後的電流值。結果顯示，相對標準偏差 (RSDs) < 6%，表明此種傳感器具有較好的重現性。通過SPSS軟體分別對O天與2天、O天與7天兩組進行T檢驗分析，顯示P值均大於O. 5，表明本研究設計的DNA電化學生物傳感器具有聞的穩定性。圖10為所構建的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器結構組成，分別由直徑為2_的金盤電極和自組裝在金盤電極表面作為探針的單鏈DNA分子層，每條探針序列均為5』 _(Τ)η_3』，η彡5，5』端修飾有巰基。表I為自來水、湖水和海水三個實際樣品中Hg2+的檢測結果。在實際樣品中檢測 Hg2+具有較好的回收率(104. 55% 105. 72%)。表明實際樣品中的幹擾因素幾乎可以忽略，證實了此種傳感器能夠用於實際樣品中汞離子的檢測。表I實際樣品中汞離子的檢測
樣品a標準加入量測定值bRSD (%)c回收率(％)自來水0.10.10574.28105.72海水0.20.21145.91105.68湖水0.30.31363.11104.55a所有的水樣品來自中國廈門，b平均值(n = 3)，c相對標準偏差(η = 3)。
具體實施例方式I)將直徑為2_的金盤電極依次進行拋光、超聲和電化學清洗，然後用純水清洗， 氮氣吹乾。2)取2mL的離心管，加入200 μ L濃度為I 10 μ M的巰基化DNA，將處理好的金電極插入離心管中，放置4°C冰箱孵育，巰基修飾的DNA便可通過Au-S鍵固定在金電極表面。3)將固定DNA探針的金電極浸入ImM巰基己醇中，常溫(25°C )下孵育lh，得到排列整齊的DNA探針如圖I所示。4)將電極浸入 Tris-HCl 緩衝液，分別在 O. 2 -O. IV,O. I _0.2V、0. I -0.3V、
O.I -O. 4V、0. I -O. 5V和O. I -O. 6V的電位區間以O. lV/s的掃描速度進行掃描，獲得電極與汞離子反應前的循環伏安曲線。之後將電極浸在含I 5 μ M的汞離子的TriS-HCl緩衝液中反應lh，之後取出，重新於Tris-HCl緩衝液中，在O. 2 -O. IV、
O.I -O. 2V、0. I -O. 3V、0. I -O. 4V、0. I -O. 5V 和 O. I -O. 6V 的電位區間以O. 1V/S的掃描速度進行掃描，獲得電極與汞離子反應後的循環伏安曲線。分別取-O. IV、-O. 2V、-O. 3V、-O. 4V、-O. 5V 和-O. 6V 電位上的電流值作圖(圖 4)。5)將T5修飾電極和T5/MCH修飾電極浸在含I 5 μ M的汞離子的Tris-HCl緩衝液中反應不同時間(O 48min)，之後取出，於Tris-HCl緩衝液中，在-O. 4 O. IV的電位區間進行掃描，獲得電極與汞離子反應不同時間後的電流變化值(Ι-Ιο)/Ι。=I0為反應前的電流值，I為反應後的電流值(如圖5所示)。6)將電極分別浸在含不同濃度汞離子的Tris-HCl緩衝液中反應lh，之後取出，於 Tris-HCl緩衝液中，在-O. 4 O. IV的電位區間進行掃描，獲得圖6所示的電極與不同濃度汞離子反應Ih後的循環伏安曲線。圖7為取-O. 4V電位對應的電流對汞離子濃度做標準曲線。7)將電極分別浸在含 1-5 μ M 萊離子和 I 5μΜ Na+, K., Li+, Ca2+, Mg2+, Co2+, Cd2+, Ni2+，Ba2+，Cu2+和Mn2+的Tris-HCl緩衝液以及同時含有這些金屬離子與汞離子的Tris-HCl 緩衝液中反應lh，之後取出，於含I 5mM過氧化氫的Tris-HCl緩衝液中，在-O. 4 O. IV 的電位區間進行掃描，-O. 4V電位上的電流值作得圖8所示的柱狀圖。11)各取5mL自來水、湖水與海水樣品，向其中分別加入O. I μ M、0. 2 μ M和O. 3 μ M 汞離子，之後將修飾後的電極分別浸入三種樣品反應lh，取出於含I 5mM過氧化氫的 Tris-HCl緩衝液中，在-O. 5 OV的電位區間進行掃描，根據還原峰電流計算樣品中汞離子含量，與實際加入量對比，計算RSD和回收率，所得結果列於表I中。12)將修飾好的電極分別在4°C下放置O天、2天和7天後浸入含I 5 μ M汞離子的Tris-HCl緩衝液，在-O. 4 O. IV的電位區間進行掃描，測其還原峰電流並計算電流變化值(I-Itl)/%，對O天、2天與7天作得圖9所示的柱狀圖。通過SPSS軟體分別對O天與 2天、O天與7天兩組進行T檢驗分析。
權利要求
1.用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器，其特徵在於設有金盤電極和信號劑，在金盤電極表面自組裝單鏈DNA分子層，所述單鏈DNA分子層作為探針，每條探針序列均為 5』 _(Τ)η_3』，η > 5，5』端修飾有巰基；所述信號劑為過氧化氫溶液。
2.如權利要求I所述的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器，其特徵在於所述金盤電極的直徑為2mm。
3.如權利要求I所述的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器的構建方法，其特徵在於包括以下步驟1)將金盤電極進行清洗，吹乾；2)在離心管中加入巰基化DNA，將步驟I)吹乾後的金盤電極插入離心管中孵育，巰基修飾的DNA便可通過Au-S鍵固定在金電極表面；3)將固定DNA探針的金盤電極浸入巰基己醇中，室溫下孵育後，得到排列整齊的DNA探針，即用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器。
4.如權利要求3所述的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器的構建方法，其特徵在於在步驟I)中，所述清洗是將金盤電極依次進行拋光、超聲和電化學清洗，然後用純水清洗。
5.如權利要求3所述的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器的構建方法，其特徵在於在步驟I)中，所述吹乾是採用氮氣吹乾。
6.如權利要求3所述的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器的構建方法，其特徵在於在步驟2)中，所述巰基化DNA是採用200 μ L濃度為I 10 μ M的巰基化DNA。
7.如權利要求3所述的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器的構建方法，其特徵在於在步驟2)中，所述孵育是放置4°C冰箱孵育。
8.如權利要求3所述的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器的構建方法，其特徵在於在步驟3)中，所述巰基己醇採用ImM巰基己醇。
9.如權利要求3所述的用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器的構建方法，其特徵在於在步驟3)中，所述室溫下孵育的時間為lh。
全文摘要
用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器及其構建方法，涉及一種電化學生物傳感器。傳感器設有金盤電極和信號劑，在金盤電極表面自組裝單鏈DNA分子層，所述單鏈DNA分子層作為探針，每條探針序列均為5』-(T)n-3』，n≥5，5』端修飾有巰基；所述信號劑為過氧化氫溶液。將金盤電極進行清洗，吹乾；在離心管中加入巰基化DNA，將吹乾後的金盤電極插入離心管中孵育，巰基修飾的DNA便可通過Au-S鍵固定在金電極表面；將固定DNA探針的金盤電極浸入巰基己醇中，室溫下孵育後，得到排列整齊的DNA探針，即用於汞離子檢測的DNA電化學生物傳感器。
文檔編號G01N27/327GK102608179SQ20121006621
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月14日 優先權日2012年3月14日
發明者孫莉萍, 胡楠, 賈靜, 賴友群 申請人:廈門大學