莫哈韋芽孢桿菌KJS‑3用於分解苯酚的用途的製作方法

2023-05-30 20:15:17

本發明涉及莫哈韋芽孢桿菌KJS-3用於分解苯酚的用途，屬於廢水處理領域。
背景技術：
：現在各種工業廢水中不僅有有機物質還包含有分解困難的難降解性化合物。這些難降解性化合物中，不僅對人體產生毒性而且因自然分解困難而成為造成環境汙染的主要物質之一，從而造成其環境殘留問題的出現。特別隨著化學工業的快速發展，各種工藝中使用的芳香族化合物具有苯環結構，其不僅會對大部分的人體產生毒性，因自然界中分解困難還會成為造成環境汙染的主要原因物質之一，而且其使用量還在不斷增加中。苯酚已被美國環保局認定為主要汙染物質的化學物，其濃度200mg/l以下也會妨礙微生物生長，是廢水中較難處理的主要環境汙染物質。國內外利用微生物處理廢水的研究層出不窮。苯酚系化合物是依靠微生物通過羥化形成鄰苯二酚中間代謝產物，再依靠酶的作用使芳香環分裂，一種是以鄰裂途徑分解成琥珀酸和乙醯輔酶A，另一種是以間位途徑分解成乙醛和丙酮酸(Aldrich，T.L.，Frantz，B.，Gill，J.F.，Kilbane，J.J.andChakrabarty，A.M.1987.CloningandcompletenucleotidesequencedeterminationofthecatBgeneencodingcis，cis-muconatelactonizingenzyme.Gene52，185-195.)。但是這種代謝過程中現有微生物的效率很低，廢水中含有的各種廢棄物很難迅速的分解代謝掉。而且這些中間物質溶解於廢水中的話，相關的微生物的活性會降低從而造成廢水處理效率進一步下降，並且因為那些化學物質的毒性成分排放到自然界中，還會造成二次環境汙染。苯酚化合物是在工業生產中大量使用的物質，相關化學廢水處理是個嚴峻的問題。所以苯酚化合物分解微生物的篩選，在各種廢水處理應用中十分重要，為了針對這類化合物的微生物的篩選和分離，分離源和代謝物質的選定變得十分重要。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是提供莫哈韋芽孢桿菌KJS-3用於分解苯酚的用途。本發明所述的莫哈韋芽孢桿菌KJS-3對苯酚的分解能力有改善，可用於含有苯酚的各種汙水廢水的處理。本發明針對化學工廠和造紙工廠等各種工業企業的廢水處理，篩選出具有優秀清除能力的微生物菌株莫哈韋芽孢桿菌KJS-3(BacillusmojavensisKJS-3)。莫哈韋芽孢桿菌(bacillusmojavensis)KJS-3於2008年8月22日保藏於韓國微生物保藏中心，保藏編號為KCCM10961P。該菌的生長條件為：20～50℃，pH＝6～7.5。本發明使用的微生物，其在好氣性條件下，繁殖生長情況良好且對苯酚化合物的分解能力得到改善。本菌株具有優秀的苯酚分解能力，在本發明中得到證實。本發明另一方面提供了一種含有苯酚化合物的廢水處理的方法。附圖說明圖1在600nm波長時測定的吸光度結果：樣品濃度分別是苯酚500ppm，250ppm，50ppm時成長的莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株的結果(備註-ppm：百萬分率，1ppm＝1mg/L)。圖2含有樣品苯酚500ppm，250ppm，50ppm的培養基在40℃培養而使莫哈韋芽孢桿菌KJS-3生長，這個培養液各個濃度稀釋後莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株在培養皿中生長情況。圖3含有樣品苯酚1000ppm，2000ppm，3000ppm的培養基在40℃培養而使莫哈韋芽孢桿菌KJS-3生長，這個培養液各個濃度稀釋後莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株在培養皿中生長情況。圖4含有樣品苯酚1000ppm，2000ppm，3000ppm的培養基在25℃培養而使莫哈韋芽孢桿菌KJS-3生長，這個培養液各個濃度稀釋後莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株在培養皿中生長情況，但樣品苯酚3,000ppm在稀釋100,000倍時菌株的成長狀態無法確認。具體實施方式下面對本發明進行具體闡述說明，本發明不只局限於所列舉的實例應用。實施例1菌株的分離食物垃圾中黴菌無法生長的粘性物質部分採集出來，移到實驗室中，在胰腖大豆瓊脂培養基(TSA)中於37℃、16小時的條件下搖床中培養.在這裡選擇出生長的菌落，各自接種於胰酪腖大豆肉湯培養基(TSB)中進行保管，將生長的菌株分別保管於45℃和20℃中進行培養，再將這其中培養生長出來的菌株進行選擇後再保管.將這些選擇保管的菌株在4℃中保管30天，再將這個再次在37℃條件下，胰腖大豆瓊脂液態培養基(TSA)中培養.在10種的培養液中37℃條件下培養7天且有內生孢子(Endospore)形成的其中2個菌株選擇出來，分別將菌株命名為3號和4號菌株。這些菌株分別委託韓國微生物保藏中心進行遺傳物質分析後得到莫哈韋芽孢桿菌KJS-3(BacillusmojavensisKJS-3)和莫哈韋芽孢桿菌KJS-4(BacillusmojavensisKJS-4)菌株，並進行了菌株菌種登記。莫哈韋芽孢桿菌KJS-3(BacillusmojavensisKJS-3)在韓國微生物保藏中心BacillusmojavensisKJS-3(保藏編號：KCCM10961P)進行保藏。實施例2具有苯酚分解能力的確認上述的2種微生物莫哈韋芽孢桿菌KJS-3(BacillusmojavensisKJS-3)和莫哈韋芽孢桿菌KJS-4(BacillusmojavensisKJS-4)在溫度40℃中，胰腖大豆瓊脂培養基(TSA)中接種培養.使用在40℃中培養的莫哈韋芽孢桿菌KJS-3(BacillusmojavensisKJS-3)進行本實驗。1，莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株在10mlTSB培養基中接種，40℃、培養16小時以上。培養16小時後的培養液中取5ml出來，在100mlTSB中接種，在40℃溫度條件下培養90分鐘，攪拌速度保持為100～200rpm即可。2，上述步驟中培養的培養物取500μl(微升)在10,000rpm、1分鐘的條件下離心分離且除去上層清液，再注入500μl的生理鹽水(0.9％NaCl)，完全地混合後接種於最少培養基中。3，根據不同的時間，在0min，30min，60min，2小時，3小時，4小時，5小時，6小時，7小時和8小時以後，紫外可見分光光度儀中測定吸光度(O.D)值，確定菌株的生長曲線。最少培養基的組成如下：(1升，pH7.0)NH4Cl1.0g，K2HPO44.35g，NaH2PO43.9g，MgSO4.7H2O0.48gCaCl20.03g，FeSO40.01g，MnCl20.01g，CoCl20.001g，Na2MnO40.001g。製作3個最少培養基，分別地以苯酚的濃度為50ppm，250ppm，500ppm進行製作和試驗，吸光度在600nm波長下測定如下：50ppmphenol250ppmphenol500ppmphenol0min0.0320.0320.03230min0.0570.070.0661hr0.0740.0760.0942hrs0.1140.1300.1613hrs0.1500.1810.1934hrs0.3120.3310.3175hrs0.5190.5240.5396hrs0.7210.6870.6887hrs0.7540.7040.7358hrs0.7310.7050.691從上述結果中可知，莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株以苯酚作為碳元素分解利用，7小時後呈最大生長狀態，參照圖1。實施例3針對苯酚分解菌株的苯酚含量測定，按照下面順序進行反應實驗，在波長650nm進行吸光度測定。1)菌株在培養8小時後，將培養液轉至冰箱保管備用。2)苯酚定量(1)標準品製備：250ppm-苯酚，25ppm-苯酚，12.5ppm-苯酚。(2)樣品：500ppm-苯酚，包含少量培養基(在40℃、培養8小時)；250ppm-苯酚包含少量培養基，50ppm-苯酚包含少量培養基(在40℃、培養8小時)。(3)實驗過程：標準品和各個樣品分別各取100ml，加6ml的8wt％K3Fe(CN)6、6ml的0.1MFeCl3(0.1MHCl作溶劑)之後，反應5分鐘後，在波長650nm處測定吸光度值(OD)。結果如下表所示：從上表可知，樣品500ppm中的OD值為1.304，約有17ppm的苯酚被檢測出，說明其500ppm中483ppm的苯酚被分解，而且樣品250ppm中的OD值為1.108，約有14ppm的苯酚被檢出，說明250ppm中236ppm的苯酚被分解，最後在樣品50ppm中的OD值為1.084，說明約有13ppm的苯酚被檢出，37ppm的苯酚被分解，所以，本發明中莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株針對苯酚化合物的分解能力優秀的特點被證實。實施例4實施例2中培養的莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株進行分階段的稀釋，確認其菌株狀況。以102，104，105，106濃度進行稀釋，各自取0.5ml後，在胰腖大豆瓊脂培養基(TSA)上均勻地鋪展開進行培養，直徑為90mm的培養皿中選擇菌落數從30個至不到300個，並與原來培養的培養基中的菌濃度作比較。圖2中可知，含有500ppm的苯酚培養基中有103個菌落，稀釋倍數為105，原來培養基中屬於2×107cfu/ml的菌株。含有250ppm的苯酚的培養基中有37個菌落，稀釋倍數為105，這是原來培養基為8×106cfu/ml濃度的菌株。含有25ppm的苯酚的培養基中有32個菌落，稀釋倍數為105，這是原來培養基為6×106cfu/ml濃度的菌株。從這個結果可以看出，莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株在苯酚含量為500ppm為止，生長狀態良好，而且對50ppm，250ppm，500ppm做個比較的話，500ppm中菌數增加最多，在最少培養基中，苯酚為唯一碳源，莫哈韋芽孢桿菌KJS-3也可分解利用並正常生長。實施例5莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株在TSB培養基中，過夜培養，含有苯酚的6個最少培養基準備接種，其中3個培養基在25℃條件下培養，另3個培養基在40℃條件下培養，這時，各個溫度的含有苯酚的濃度為1,000ppm，2,000ppm，3,000ppm，16小時培養後，稀釋105或106倍並取0.5ml在胰腖大豆瓊脂培養基(TSA)上均勻地平鋪開進行培養，直徑為90mm的培養基TSA中生長的菌數進行確認。圖3中可知，在40℃條件下含有1,000ppm苯酚的1,000,000倍稀釋培養基中，菌數分別為65個、49個，這與原來培養基1.2×108cfu/ml相關的菌數相比屬於相當高的水準，但是含有2,000ppm和3,000ppm苯酚的100,000倍稀釋培養基中，菌數為5個、13個，雖然可以分解利用苯酚，但可以看出出現生長抑制的狀況，所以，莫哈韋芽孢桿菌KJS-3在溫度為40℃時，1,000ppm的含有苯酚的培養基中可以生長。圖4中可以看出，在25℃條件下，含有1,000ppm的苯酚的100,000倍稀釋培養基中菌落為98個，原來培養基2×106cfu/ml濃度的菌數。但是含有2,000ppm苯酚的100,000倍稀釋培養基中，檢出菌數為11個、13個，雖然可以分解利用苯酚但可以看出出現生長抑制現象，而且含有3,000ppm苯酚的100,000倍稀釋培養基中，菌數基本沒有檢出，只有1～2個檢出，出現對其很強的生長抑制現象。所以，莫哈韋芽孢桿菌KJS-3在溫度25℃時含有1,000ppm苯酚的培養基中也可以生長，但是與在40℃相比，生長速度有所下降。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp