氣體微球脂質體複合體的製作方法

2023-05-30 20:16:31 2

專利名稱：氣體微球脂質體複合體的製作方法
技術領域：
本發明提供包括懸浮在介質中的氣體微球脂質體複合體(MSLC)的製劑。所述氣體微球脂質體複合體包括充氣微球；至少一種吸附在充氣微球表面上的脂質和表面活性劑；以及附著在脂質或表面活性劑上的充液脂質體。在所述充液脂質體的外表面可以結合靶向配體(即診斷用藥靶向部分)，用於受體、酶、mRNA和其它相關生物標靶選擇性成象的各種MSLC的定向釋放。另外，在所述充液脂質體的內部體積中可以包括一種或多種藥物(例如治療藥物和/或診斷用藥)。如此，所述治療藥物或診斷用藥可以被選擇性地釋放到病變器官或部位以便定位釋放。通過在結合靶向各種MSLC的病變部位使用聲能可以刺激加速藥物的釋放，由此以選擇的方式提供局部高濃度的治療藥物或診斷用藥。
背景技術：
超聲波成象用於對患者(例如哺乳動物)的體內結構成象，以有助於診斷和治療。在超聲波成象過程中，可以使用超聲掃描儀來產生和接收聲波。將超聲掃描儀放置在身體表面的待成象部位，使掃描儀產生的聲波直接對準待成象部位。然後所述掃描儀測定從下面的部位反射的聲波，並將數據轉變為圖象。體內各結構的聲特徵(例如密度)一般取決於傳送的速度和所述結構的密度。聲特徵的改變在不同物質之間的界面(即在固體、液體和氣體之間的界面)最為明顯。因此，當超聲能量對準包括不同物質間界面的部位時，所述物質的不同的超聲特徵將產生不同的反射特徵。因為不同結構間的界面提高了所得到的超聲成象的質量，因此這將有助於提高在不同結構間的聲特徵的差異，並提高在超聲成象過程中產生的圖象質量。
一種可以影響超聲成象質量的方法是將對照劑導入身體的脈管系統中，作為超聲對照劑。當將所述對照劑注射進和灌注到微脈管系統中時，可以產生更清淅的圖象。所述對照劑作為聲波反射劑，有效地增強脈管系統和其它結構間的界面。
本領域熟知含有截留氣體的液體和固體對照劑。參見美國專利第4,235,871號、美國專利第4,265,251號、美國專利第4,442,843號、美國專利第4,533,254號、美國專利第4,572,203號、美國專利第4,657,756號、美國專利第4,681,199號、美國專利第5,088,499號、美國專利第5,147,631號、美國專利第5,228,446號、美國專利第5,271,928號、美國專利第5,380,519號、美國專利第5,413,774號、美國專利第5,527,521號、美國專利第5,531,980號、美國專利第5,547,656號、美國專利第5,558,094號、美國專利第5,573,751號、美國專利第5,585,112號、美國專利第5,620,689號、美國專利第5,715,824號、美國專利第5,769,080號、歐洲專利0 122 624、歐洲專利727 225號、WO 96/40285；以及WO 99/65467。由於在氣體微泡和所包圍的液體之間的聲音傳遞不同，由這些對照劑提供的微泡起到了聲波反射器的作用。
在美國專利第4,572,203號中，Feinstein公開了由聲處理某些粘性液體產生的、用作超聲對照劑的直徑大約為6-20微米的「微泡」。Feinstein也公開了含有金屬的固體或半固體的微粒，例如玻璃或石墨，這類微粒不含截留空氣，小到足以通過毛細血管，可作為超聲對照劑。該專利也公開了由胺基酸聚合物基質(例如清蛋白)形成的微球，該微球含有磁性顆粒，例如其中嵌有磁鐵礦(Fe3O4)。
在美國專利第4,265,251號中，Tickner公開了一些具有中空充氣的內部間隙的糖類組合物「微泡」顆粒作為超聲增強劑的用途。
在美國專利第4,442,843號、美國專利第4,657,756號和美國專利第4,681,119號中，Rasor等舉例說明了固體物質微粒(直徑1-50微米)的聚集體在超聲成象中的用途，其中這種聚集體可溶於血液中，在顆粒間的空隙中含有氣體，或在顆粒的表面吸附有氣體，或含有氣體成為所述顆粒內部結構的組成部分。使用以下固體物質多種糖類、NaCl、檸檬酸鈉、乙酸鈉、酒石酸鈉、CaCl2和AlCl3。
在EP 0122624中，Hilmann等提出採用包封有空氣的、包括固體表面活性物質(包括多種有機脂質化合物)的微顆粒作為超聲對照劑。也公開了表面活性物質顆粒和非表面活性物質顆粒的組合，其中非表面活性物質顆粒如氯化鈉、檸檬酸鈉、草酸鈉、酒石酸鈉和多種糖類。
在美國專利第5,147,631號中，Glajch等公開了包括截留氣體或液體的無機物的多孔顆粒。所公開的物質包括了單體或聚合硼酸鹽類、單體或聚合礬土類、單體或聚合碳酸鹽類、單體或聚合矽石類、單體或聚合磷酸鹽類；以及它們藥學上可接受的有機或無機陽離子鹽類。
Unger公開了全氟化碳充氣微球(美國專利第5,547,656號和美國專利第5,527,521)用於診斷成象目的，以及充氣的和充氣態前體的脂質體組合物，或用於製備或使用這些對照劑的方法(美國專利第5,228,446號、美國專利第5,585,112號、美國專利第5,769,080號和美國專利第5,715,824號)，用於通用和診斷超聲成象目的。
Unger在美國專利第5,088,499號中公開了充氣脂質體的製備和它們作為超聲對照劑的用途。這些充氣脂質體包括含有氣體的物質、氣體前體化合物，該化合物可以由pH、溫度或壓力激活，以及其它固體和液體對照劑。
在以上由Unger所公開的物質中，所述包封氣泡的脂質體膜被描述為眾所周知的兩親性脂質膜(例如磷脂類)的單層或多層頭對尾結構(參見表1)。如此，Unger的組合物為傳統的脂質體，其中液體充填的內部由氣體取代。
Quay已公開了使用低Q-因子(低擴散性)游離氣體微泡作為超聲對照劑的方法(美國專利第5,573,751號和美國專利第5,558,094)。在這些文獻中，Quay公開了不同低擴散性氣體的游離氣體微泡，但沒有公開任何這些微泡的結構或組成。
在美國專利第5,271,928號、美國專利第5,380,519號和美國專利第5,531,980號中，Schneider公開了各種微泡懸浮液，它們是細微氣體的中空球體或小珠，並且通過表面活性劑而穩定。
在Schneider的微泡專利(『928、『519和『980)中，公開的超聲對照劑由在所述氣體微泡周圍的沒有物質邊界層的微泡所組成。根據Schneider所述，這些微泡「僅以揮發性的包膜為界」(美國專利第5,531,980號，第1欄)。
以上所述Schneider的有關微泡的公開內容(『928、『519和『980)涉及製備基於微泡的超聲對照劑的方法，但沒有涉及這些微泡本身的優選的組成/結構。
Schneider的美國專利第5,413,774號公開了作為微球基超聲對照劑的具有脂質體物質邊界層的微泡，在所述微泡中還含有低溶解性氣體。然而，該專利沒有提供所述微泡的組成或結構的描述。此外，該專利所描述的製備基於這些微泡或微球的超聲對照劑的方法採用所選擇的低溶解性氣體。
以上所述對照劑被建議用於血管系統的通用超聲對照成象，並特別用於心臟成象。
身體的具體器官、系統或其它部位的成象有助於對許多特殊疾病狀態的診斷。這樣的實例包括直接方式的腫瘤成象、血塊成象以及感染部位的成象。在歐洲專利申請EP 727225中，Quay等說明了包括細胞粘著分子(CAM)配體的組合物的用途，所述配體摻入到所需分子中形成偶聯物。將所述CAM摻入到表面活性劑或清蛋白載體中並且還包括具有足夠高的氣壓在體溫下成為氣體的化學品。
Unger(WO 96/40285)公開了含有氣體的靶向脂質體，所述脂質體可以靶向體內特殊的組織，用於診斷成象或用於傳遞生物活性製劑。這些靶向物質由氣體、脂質和打靶配體組成。
所有這些物質包括氣體微球(或者稱為微泡)的懸浮體或乳劑，它們可以是以下物質中的一種1)游離微泡(即在所述微泡表面不具有固定的物質包膜)，它們通過在溶液中降低氣-液界面表面張力的表面活性劑穩定，或2)具有可以使氣體微球作為液體介質中的懸浮體穩定的邊界層的純囊泡。所有這些物質在實施上遇到的困難之一是所述相關的、聲活性(acoustically-active)、直徑大小範圍為大約0.5μm-10μm的氣體微泡具有不同於將它們懸浮的含水介質的密度。因此，這些微球將自然地快速離析出(即所述微泡懸浮液變為多相體系)。這就需要在混合後、微球出現離析之前快速使用所述對照物質。
在氣體微球作為藥物釋放的載體使用時(參見Unger的WO96/40285和Quay的EP 0727225)，所述物質通過化學或物理吸附在脂質或聚合物的邊界層上，將治療部分結合在氣體微球表面。這些物質在實施上的困難是有限數量的治療藥物可以吸附或結合到所述氣體微球周圍的表面物質上。
Allen等(美國專利第5,620,689號)公開了利用脂質體包封的化療劑治療B-細胞或T-細胞腫瘤的方法，所述化療劑具有通過包封在所述脂質體上的聚乙二醇附著在脂質體表面的生物靶向基團。See等，WO 99/65467公開了製備充滿直徑小於200nm的脂質體的藥物的方法。這些公開的內容代表了本領域一大類相似的脂質體藥物傳遞的公開內容，所有這些藥物含有單獨的充液脂質體，而沒有本文所提供的MSLC組合物形式的氣體微球成分。
雖然以上所公開的這些對照劑已在使用，然而所產生的例如心肌組織的超聲成象可能質量相對較差、變化大並且不能定量。至今所有診斷結果都多少有些令人失望。因此，仍然存在改進用於超聲成象試劑的需要，所述試劑可通過增強體內血管間隙和組織間的對比度來提高超聲成象的質量。當在稀含水懸浮液中，所述對照劑具有優異和穩定的聲反應特性。另外，所述對照劑應該顯示儘可能小的微球漂浮性和離析性。
已經並且繼續需要通過改善人體內血管間隙和組織的輪廓來提高超聲成象質量和清淅度的超聲成象試劑。另外，對於許多顯示對正常組織高毒性和得到差的治療指數的藥物而言，在控制其釋放到病變部位方面需要改進。
發明概述本發明提供用於增強超聲成象對比度和用於超聲促進藥物釋放的製劑。所述製劑提供穩定的氣體微球(即細碎分散的氣泡)的懸浮液，其在稀含水懸浮液中具有優異和穩定的聲反應特性。與已知製劑比較，所述製劑可以以更高的水平將每一充氣的微球的活性藥物傳遞到指定的組織，從而獲得在病變部位藥物或基因具有高局部濃度的所需治療效果。所述製劑具有好的超聲散射特性，該特性使得在血管間隙中的超聲反向散射信號選擇性地增強。在血管間隙中的超聲反向散射信號的增強提高了血管間隙與周圍固體組織間的對比度。另外，所述製劑顯示儘可能小的微球漂浮性和離析性。
本發明提供一種製劑，該製劑包括懸浮在介質中的氣體微球脂質體複合體(MSLC)。所述氣體微球脂質體複合體包括充氣微球；吸附在充氣微球表面上的脂質和表面活性劑中的至少一種；以及附著在脂質或表面活性劑上的充液脂質體。
本發明也提供對需要這種超聲成象的患者(例如哺乳動物)進行超聲成象的方法。所述方法包括給予該患者(例如哺乳動物)有效量的本發明製劑；允許足夠的時間使充氣微球複合體循環到達靶向區域；以及在患者(例如哺乳動物)身上完成超聲成象。
本發明也提供治療需要治療的患者(例如哺乳動物)的心臟病、炎症、感染、癌症或血栓栓塞性疾病的方法。該方法包括給予該患者(例如哺乳動物)有效量的本發明製劑，其中一種或更多種充液脂質體獨立包括治療藥物；允許足夠的時間用於使所述氣體微球複合體循環到達靶向區域；以及施加足夠超聲能量到患者(例如哺乳動物)體內的靶向區域，使治療藥物從所述微球脂質體複合體中釋放到病變部位。
本發明也提供一種製備本發明製劑的方法。該方法包括使包含表面活性劑和脂質的至少一種的水溶液中的脂質體懸浮液與在25℃和1大氣壓下水溶解度小於大約1.0％體積的氣體接觸，並且充分混合以形成所述製劑。
本發明也提供一種製備本發明製劑的方法。該方法包括使包含至少一種治療藥物和至少一種表面活性劑或脂質的水溶液中的脂質體懸浮液與在25℃和1大氣壓下水溶解度小於大約1.0％體積的氣體接觸，並且充分混合所得懸浮液以形成所述製劑。
本發明也提供一種用於製備本發明製劑的試劑盒。所述試劑盒包括一種含有水溶液的容器，其中所述水溶液包括表面活性劑和脂質的至少一種，以及充液脂質體；以及將在25℃和1大氣壓下水溶解度小於大約1.0％體積的氣體導入所述水溶液中的裝置。
本發明也提供本發明的製劑在製備用於治療需要治療的患者(例如哺乳動物)的心臟病、炎症、感染、癌症或血栓栓塞性疾病的藥物中的用途。所述製劑包括懸浮在介質中的氣體微球脂質體複合體，其中所述氣體微球脂質體複合體包括充氣微球；吸附在所述充氣微球表面上的脂質和表面活性劑中的至少一種；以及附著在脂質或表面活性劑上的充液脂質體。
本發明也提供本發明的製劑在製備用於對需要超聲成象的患者(例如哺乳動物)進行超聲成象的藥物中的用途。所述製劑包括懸浮在介質中的氣體微球脂質體複合體，其中所述氣體微球脂質體複合體包括充氣微球；吸附在所述充氣微球表面上的脂質和表面活性劑中的至少一種；以及附著在脂質或表面活性劑上的充液脂質體。
本發明也提供本發明的製劑在製備用於對需要診斷成象的患者(例如哺乳動物)進行診斷成象的藥物中的用途。所述製劑包括懸浮在介質中的氣體微球脂質體複合體，其中所述氣體微球脂質體複合體包括充氣微球；吸附在所述充氣微球表面上的脂質和表面活性劑中的至少一種；以及附著在脂質或表面活性劑上的充液脂質體。
附圖概述

圖1示意充氣脂質體。
圖2示意本發明的單層氣體微球脂質體複合體(MSLC)。
圖3示意本發明的多層氣體微球脂質體複合體(MSLC)。
本發明詳述參見圖2和3，本發明提供分散在含水介質(2)中的氣體微球脂質體複合體(MSLC)(1)。所述氣體微球脂質體複合體(MSLC)(1)包括合適的惰性氣體(4)的充氣微球(3)。脂質(5)和/或表面活性劑(6)吸附在所述充氣微球(3)的表面(12)上。各種充液脂質體(LFL)(7)附著到脂質(5)和/或表面活性劑(6)上。所述各種LFL(7)可以包括在各種LFL(7)的液體內部(10)的治療藥物(8)或診斷用藥(9)。另外，打靶部分(11)可以附著到各種LFL(7)的表面(13)上。
本文所使用的「氣體微球脂質體複合體(MSLC)」(1)指具有吸附到所述充氣微球(3)外表面(12)上的脂質(5)和表面活性劑(6)的至少一種、並且也具有附著到所述脂質(5)或表面活性劑(6)上的充液脂質體(7)的充氣微球(3)。
本文所使用的「表面活性劑」(6)指任何物質，包括離子或非離子物質，其使溶液內的界面張力降低。術語表面活性劑(6)包括分子量小於大約1,000的兩親分子和聚合物，它們可降低充氣微球(3)與周圍含水介質(2)間的界面張力。
本文所使用的「充液脂質體(LFL)」(7)指含有液體內部(10)(即內部體積的液體)的脂質體。各種充液脂質體(7)可以是單層(14)、雙層(15)或多層(16)。各種充液脂質體(7)通常可以以連續的方式附著到所吸附液體或表面活性劑(6)上。每一種充液脂質體(7)可獨立在其液體內部(10)中含有治療藥物(8)或診斷用藥(9)。另外，每一種充液脂質體(7)可獨立含有附著到所述充液脂質體(7)的表面(13)上的高親合力的打靶部分(11)。
在本文中，對附著到脂質(5)或表面活性劑(6)包封的充氣微球(3)表面上的充液脂質體(7)所用的「連續的」或「連接的」，是指覆蓋著充液脂質體(7)的充氣微球(3)外表面(12)的主要部分(例如至少大約50％)。
本文所使用的「打靶部分」指生物適合性有機分子、生物適合性無機分子、蛋白質、肽、肽模擬物(peptidomimetic)、多糖或其它對於受體、酶、mRNA或DNA具有高親合性的分子。所述生物適合性有機分子、生物適合性無機分子、蛋白質、肽、肽模擬物、多糖或其它分子在體內相對於周圍正常組織的病變部位中表達時被改變。另外，所述打靶部分主要連接或附著在所述充液脂質體(7)的表面上。
本文所使用的「高親合性」指當以單一打靶部分和生物標靶(例如受體、酶、mRNA和DNA)的相互作用的解離常數Kd表示時，結合親合性小於大約1μm。
本文所使用的「患者」指患有特定疾病或病症並需要對所述特定疾病或病症進行治療的患者。合適的患者包括例如動物。合適的動物包括例如哺乳動物。合適的哺乳動物包括例如人。
本文所使用的「治療」指對患者的疾病或病症的治療並包括(i)預防患者患上所述疾病或病症，特別是當所述患者具有所述疾病或病症的傾向，但還沒有確診為該病時；(ii)抑制所述疾病或病症，即抑制它的發展；和/或(iii)減輕所述疾病或病症，即使所述疾病或病症消退。
充氣微球本文所使用的「充氣微球」是懸浮在介質中的微泡，其中所述微泡在大約介質的冰點以上和大約介質的沸點以下的溫度、並且在大約0個大氣壓以上和大約5個大氣壓以下壓力(例如標準溫度和壓力)下具有正常球體形狀。
如圖2和圖3中所舉例說明，所述氣體微球脂質體複合體(1)(MSLC)包括充氣微球(3)。所述充氣微球(3)通常具有聲活性。所述充氣微球(3)在25℃和1個大氣壓下在水中的溶解度通常小於大約1.0％體積。另外，所述充氣微球(3)的平均直徑通常為大約0.1μm-10μm。所述充氣微球(3)的平均直徑優選為大約0.5μm-10μm。
所述充氣微球(3)通常包括一種或者多種合適的惰性氣體(4)。本發明合適的惰性氣體(4)為超聲對照劑領域所熟知。本發明所使用的合適的惰性氣體(4)公開在例如以下專利文獻中Unger等(美國專利第5,547,656號、美國專利第5,527,521號、美國專利第5,228,446號、美國專利第5,585,112號、美國專利第5,769,080號、和美國專利第5,715,824號)；Qqay等(美國專利第5,573,751號和美國專利第5,558,094號)以及Schneider(美國專利第5,271,928號、美國專利第5,380,519號和美國專利第5,531,980號)。這些惰性氣體可以包括氣體和氣體前體(即在降低壓力或升高溫度下轉變為氣相的液體)。優選的惰性氣體(4)在患者(例如哺乳動物)體內血液中溶解度低，為非反應性、非代謝性和/或非毒性。用於本發明的合適的惰性氣體(4)包括例如全氟化碳氣體(例如(C2-C6)全氟化碳)、全氟醚、氮氣和稀有氣體(例如氦、氬和氖)。氣體微球脂質體複合體(MSLC)所述氣體微球脂質體複合體(1)包括充氣微球(3)；吸附在所述充氣微球(3)的外表面(12)上的脂質(5)和表面活性劑(6)中的至少一種；以及附著在所述脂質(5)或表面活性劑(6)上的充液脂質體(7)。所述氣體微球脂質體複合體(1)(MSLC)的平均直徑通常為大約0.1μm-10μm。優選所述氣體微球脂質體複合體(1)的平均直徑為大約0.2μm-4μm。所述氣體微球脂質體複合體(1)的密度通常為所述介質(2)的大約0.90-1.10。所述氣體微球脂質體複合體(1)(MSLC)可以作為兩種或更多種氣體微球脂質體複合體(1)的聚集體形式存在。所述聚集體的直徑通常為大約1μm-100μm。
脂質和表面活性劑如圖2和圖3所舉例說明，所述氣體微球脂質複合體(MSLC)(1)包括吸附在所述充氣微球(3)外表面(12)上的脂質(5)和表面活性劑(6)中的至少一種。所述脂質(5)或表面活性劑(6)可以作為單分子層、雙分子層或多分子層在所述充氣微球(3)外表面(12)上存在。所述表面活性劑(6)快速吸附到所述充氣微球(3)外表面(12)上，並由此降低低溶解度惰性氣體(4)或各種氣體的表面張力。另外，表面活性劑(6)所產生的界面可以粘附各種LFL(7)。
表面活性劑(6)可以是任何合適的非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑或陰離子表面活性劑。合適的非離子表面活性劑包括例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、纖維素、明膠、黃原膠、果膠和葡聚糖。合適的陽離子表面活性劑包括例如四烷基銨、四烷基鏻或其合適的鹽。合適的陽離子表面活性劑包括例如四己基銨、四癸基銨、四丁基銨、四己基鏻、四癸基鏻、四丁基鏻、四苯基鏻和其合適的鹽。合適的陰離子表面活性劑包括例如烷基磺酸根、烷基羧酸根和其合適的鹽。合適的陰離子表面活性劑包括例如十二烷基硫酸根、十六烷基硫酸根、十二烷基羧酸根、十六烷基羧酸根和其合適的鹽。
合適的脂質(5)包括例如磷脂、糖脂、甘油三酯和脂肪酸。合適的磷脂包括例如二棕櫚醯磷脂醯膽鹼氯化物、二肉豆寇醯磷脂醯膽鹼、二月桂醯磷脂醯膽鹼和二油醯磷脂醯膽鹼。
各種充液脂質體(LFL)如圖2和圖3所舉例說明，所述氣體微球脂質體複合體(1)(MSLC)包括附著在脂質(5)或表面活性劑(6)上的各種充液脂質體(7)(LFL)。各種充液脂質體(7)的存在穩定了表面活性劑或包封的脂質包封的充氣微球(3)。一種或更多種充液脂質體(7)通常包括來自懸浮液的介質(2)(即介質(2))的液體。優選每一種充液脂質體(7)通常包括來自所述懸浮液的介質(2)的液體。來自所述充液脂質體(7)的液體內部(10)(即內部體積)的懸浮液介質(2)的液體的存在提供了具有接近(例如在大約20％以內)懸浮液的介質(2)的密度的微球組成，從而使微球漂浮性和/或離析降到最小。
各種LFL(7)在充液內部體積中可以含有一種或多種藥物(例如治療藥物(8)和/或診斷用藥(9))。因為所述各種LFL(7)附著在表面活性劑包封的或脂質包封的充氣微球(3)上，所述各種LFL(7)在內部氣體的超聲刺激下將破裂，從而在患病的器官或組織內釋放出一種或多種藥物(例如治療藥物(8)和/或診斷用藥(9))。但是，所述各種充液脂質體(7)本身具有有限的聲活性。
各種LFL(7)附著在所述表面活性劑包封的或脂質包封的充氣微球(3)上，並使它們穩定。因此，這使具有與懸浮液介質(2)的密度相接近(例如在大約20％內)的密度的各種MSLC(1)的氣體微球漂浮和/或離析降到最小。這也使氣體微球懸浮液在製備後適當的時期內(例如最長可達大約30分鐘)具有相對均勻的粒徑分布(例如大約1μm-5μm)。
各種充液脂質體(7)通常佔據了大約50％以上的微球表面積。所述各種充液脂質體(7)也通常以基本連續的方式附著到吸附的脂質(5)或表面活性劑(6)上。這種定向為各種MSLC(1)提供了突出的浮力特性，當在稀釋的水懸浮液中時，其提供具有優異和可再現的聲反應特性的相對穩定的懸浮液。
各種LFL(7)的大小較為重要。所述充液脂質體(7)的直徑應優選小於所述充氣微球(3)的直徑大約10％。對於大多數體內超聲成象或藥物釋放劑而言，各種MSLC(1)的直徑的最有利變化範圍是總體直徑為大約1μm-5μm，並且由直徑小於100nm的充液脂質體(7)製備。較大的充液脂質體(7)(例如直徑大於0.2μm)形成的各種MSLC(1)的總體直徑超出體內毛細血管的直徑。這將產生與毛細血管栓塞有關的危險以及隨之而來的與阻塞血液到組織的微循環有關的生物毒性。因此，更優選利用直徑小於大約100nm的各種LFL(7)以產生各種適當大小的MSLC(1)，以便安全用於活體患者(例如哺乳動物)。每一種充液脂質體(7)的直徑通常為大約10nm-200nm。優選每一種充液脂質體(7)的直徑為大約20nm-100nm。另外，每一種充液脂質體(7)的直徑通常比充氣微球(3)的直徑小大約10％。
如圖2和圖3所舉例說明，一種或多種LFL(7)可以在所述充液內部體積內包括一種或多種合適的藥物(例如治療藥物(9)和/或診斷用藥(9))。每一種充液脂質體(7)可以在其液體內部(10)獨立包括一種或多種藥物(例如治療藥物(8)和/或診斷用藥(9))。當各種LFL(7)附著在表面活性劑包封的或脂質包封的充氣微球(3)表面時，可經超聲刺激破裂，並在患病器管或組織內以局部和濃縮方式釋放出一種或多種治療藥物(例如治療藥物(8))。高能量超聲通常可以引起充氣微球(3)膨脹並快速收縮，其最後引致氣泡破裂。超聲能量被充氣微球(3)截獲將引起MSLC(1)散開並破裂，隨後，釋放出一種或多種附著在MSLC(1)表面、包含在各種LFL(7)內部的藥物(例如治療藥物(8))。
合適的治療藥物(8)的種類包括例如抗凝藥、溶栓藥、抗腫瘤藥和抗炎藥。合適的特殊治療藥物(8)公開在例如PCT/US99/13682中，包括例如多柔比星、環磷醯胺、阿酶素、甲氨蝶呤、吉西他濱、諾維本、順鉑、組織型纖溶酶原激活劑、引替瑞林、羅昔非班、密都錠和依那西普。在本發明的優選的用於超聲刺激藥物釋放的實施方案中，在所述各種LFL(7)溶液中各種MSLC(1)包括高親合性打靶部分(11)和治療藥物(例如治療藥物(8))，以便使每一氣態微泡釋放的藥物的治療指數和數量達到最大限度。
合適的診斷用藥(9)類型包括例如X-射線對照劑和MRI對照劑。合適的特殊的診斷用藥(9)包括例如非離子碘化X-射線對照劑、離子碘化X-射線對照劑、含釓MRI對照劑、含鐵MRI對照劑和含錳MRI對照劑。
在各種LFL中所使用的診斷用藥(9)應該使一種MSLC組合物可以達到超聲成象增強作用(例如反向散射)和X-射線或MRI成象增強作用。
為了一種或多種藥物(例如治療藥物(8)和/或診斷用藥(9))靶向輸送到所選擇的病變部位，本發明的各種LFL(7)可以轉化為具有高親合性的打靶部分(11)，其共價地連接或吸附在所述各種LFL(7)的表面(13)上。這樣，所述充液脂質體(7)通常可具有一種或更多種附著在所述充液脂質體(7)的表面(13)上的高親合性的打靶部分(11)。這樣使得各種LFL(7)能夠對體內病變部位提供超聲對照增強作用。這些通過在各種LFL(7)上提供配體完成，其中所述配體對於在疾病部位功能異常細胞中過量表達或變更的受體、酶、mRNA或DNA具有高親合性。或者，這些附著在各種LFL(7)上的打靶部分(11)可以結合到正常組織受體上，以便正常組織的選擇性成象，與缺乏中各種LFL(7)的靶的受體的鄰近疾病組織的缺乏聲增強形成對比。一種或多種LFL(7)可以在內部液體介質(10)中包括一種或多種來自懸浮液介質(2)的合適的診斷用藥(9)。
可以結合到各種LFL(7)的表面(13)、用於引導MSLC(1)到病變特殊部位的合適的高親合性打靶部分(11)已有公開。參見例如Unger(PCT/US96/09938)、Allen(美國專利第5,620,689號)和Quay(EP0727225)，這些專利提供了許多生物打靶部分的實例，所述打靶部分可以結合到引導超聲成象劑或藥物釋放組合物的表面活性劑(6)或脂質(5)成分中。它們其中有腫瘤特殊抗體、受體特殊肽類和肽模擬物如細胞粘著分子等。
合適的特殊打靶部分(11)包括例如1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)-十二烷酸酯；DPPE-PEG3400-環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)-十二烷酸酯；1-(1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)-α，ω-二羰基PEG3400-2-{[7-(N-羥基氨基甲醯基)(3S，6R，7S)4-氮雜-6-(2-甲基丙基)-11-氧雜-5-氧代雙環[10.2.2]十六-1(15)，12(16)，13-三烯-3-基]羰基氨基}-N-(3-氨基丙基)乙醯胺；和1-(1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)-α，ω-二羰基PEG3400-[7-(N-羥基氨基甲醯基)(3S，6R，7S)-4-氮雜-6-(2-甲基丙基)-11-氧雜-5-氧代雙環[10.2.2]十六-1(15)，12(16)，13-三烯-3-基]-N-{[4-(氨基甲基)苯基]甲基}甲醯胺。
本發明所使用的充液脂質體(7)是本領域已知的。在本發明所使用的用於製備脂質體的優選原料是磷脂類，它們可以是陽離子、陰離子或兩性離子，並可以以混合物使用。一些來源存在於脂質體的組合物和製劑中。例如，參見New(R.R.C.New，編輯，Liposomes，apractical approach，Oxford University Press，Oxford，UK，1990)、Tyrrell(「New Aspects of Liposomes」，D.A.Tyrrell，T.D.Heath，C.M.Colley B.E.Ryman，Biochimica Biophysica Acta，457(1976)，259-302)、Schneider(美國專利第4,224,179號)、Woodie(MC Woodie andD.Papahadjopoulos，Methods in Enzymology171，193，1989)。特別是，Papahadjopoulos(美國專利第4,235,871號)已經公開了製備含有治療藥物的各種LFL的方法。
MSLC平均大小分布和穩定性的控制可以通過不同的參數，例如溶液中脂質的濃度、各種LFL的直徑、包含在組合物中聚合物表面活性劑例如聚二乙醇(PEG)的分子量，以及所使用的聚合物的濃度來控制各種MSLC的大小和穩定性。
1.溶液中磷脂的濃度改變脂質濃度可以控制充液脂質體的大小分布和穩定性，並且，反過來，可以調節在懸浮液中所形成並穩定的MSLC的大小。在懸浮液中穩定的各種MSLC的平均大小與初始的各種LFL的濃度和大小成正比。由於各種LFL的數量和大小取決於有效的脂質(例如磷脂)的數量，因此所述初始脂質濃度將直接影響在懸浮液中穩定的MSLC分布的數量的大小。
2.LFL的直徑懸浮液中的各種MSLC的大小與脂質(例如磷脂)的濃度無關，但可以通過物理方式改變LFL的大小而變化。LFL的大小可以通過例如擠壓或超聲方法改變，這些方法在脂質體科學中是熟知的(參見例如R.R.C.New，編輯，Liposomes，a practical approach，OxfordUniversity Press，Oxford，UK，1990)。如前所述，LFL大小的改變將引起各種MSLC大小分布的改變(即小於大約100nm大小範圍的較小的各種LFL將產生小於大約10μm的較小的各種MSLC)。
3.組合物中所使用的表面活性劑的分子量在製劑中的聚合物表面活性劑(離子或非離子型)的分子量強可以用於影響所形成的各種MSLC的平均直徑。例如，聚二乙醇(PEG，共價結合在組合物中的其它成分/脂質或在溶液中作為游離PEG加入)的高分子量，可以在氣體導入系統時穩定較大的含有各種MSLC的氣態微泡。例如，通過將PEG的分子量從500變化到10,000，可以調節MSLC的直徑。
4.聚合物的濃度可以通過改變在脂質體懸浮液中聚合物表面活性劑的濃度控制MSLC的大小。增加在組合物中聚合物的濃度通常導致懸浮液中各種MSLC的平均大小和/或濃度的增加。
氣體微球脂質體複合體的製備可以通過混合低水溶解度的氣體與在懸浮液中含有表面活性劑和充液脂質體的水溶液來製備本文所述的氣體微球脂質體複合體(MSLC)。所述過程可以通過機械混合、超聲波或將氣體高速注射到含有表面活性劑和各種LFL的液體中完成。
為了形成初始的各種LFL，可以將磷脂懸浮在大容量水溶液中，所述水溶液還可含有表面活性物質，以及非水成分，如甘油或丙二醇，或懸浮助劑如多糖、蛋白質或合成聚合物，條件是這些成分為胃腸外可接受(即非毒性)。用於製備在本發明中使用的各種LFL的方法已經由Woodle(M.C.Woodle和D.Papahadjopoulos，Methods inEnzymology171，193，1989)公開。
如果需要MSLC具有生物打靶性，則各種LFL可具有共價結合或吸附到充液脂質體表面的高親合性打靶部分。所述打靶部分可以吸附到MSLC表面，或更優選作為磷脂酯共價附著到LFL上或附著到MSLC的PEG成分上(參見Allen美國專利第5,620,689號)。在將各種MSLC用於超聲刺激藥物釋放的情況下，通過在含有表面活性劑、包括藥物的含水介質中製備各種脂質體，隨後經混合或用合適的惰性氣體聲處理所述介質，可以製備各種在脂質體內部液體體積中包括治療藥物的LFL。
對於超聲成象和超聲剌激的藥物釋放，控制LFL直徑在小於大約100nm大小範圍內對於形成和穩定各種MSLC在所需大小範圍(例如直徑大於大約0.5μm並小於大約10μm)是重要的。用於控制各種LFL大小的方法已經在文獻中分開(參見例如R.R.C.New編輯，Liposomes，a practical approach，Oxford University Press，Oxford，UK，1990，第36-85頁)。如Cook等(美國專利第4,533,254號)所公開的用於製備所需大小的各種LFL的微流化態化技術特別有效。
結構的檢測為了證實存在所述新結構(命名為氣體微球脂質體複合體(MSLC))，製備在實施例1中所述的脂質體系統，並使用四種技術光學顯微鏡、透射電鏡術、螢光探針和軟X-射線顯微鏡進行分析。這些技術提供了宏觀結構(大小大於大約1μm)、微觀結構(10nm到大約1000nm)和化學系統的微環境(分子水平)的信息。
光學顯微鏡光學顯微鏡可以在微米範圍內確定物體的大小和形狀。因此，使用1000X顯微鏡可以觀察直徑在大約1-10μm範圍內的MSLC組合物，並可以放大到大約1-10mm直徑的大小。使用光學顯微鏡顯示出各種MSLC為球形，並且直徑為大約1-10μm的範圍。
製備出MSLC懸浮液後(例如如在實施例1中所述)，使用注射器(B-D5cc注射器和精密導管221/2 G針頭；0.70mm×40mm)從小瓶中緩慢抽取出大約0.5mL樣品。將該樣品放置在Hanging Drop載玻片(直徑18mm；深度0.5mm)上並覆蓋蓋玻片。然後在蓋玻片上滴加一滴顯微鏡油。用裝備有10X目鏡和油浸無色100X物鏡的OlympusBHA-P顯微鏡(提供1000X的總體放大倍數)檢驗所述樣品。所得到的圖象顯示小於1μm-大於10μm大小範圍的球形物體。各種直徑大於大約2μm的充氣MSLC顯然是較小大小的初始MSLC單元的聚集體。
電子顯微鏡使用透射電鏡術(TEM)證實在各種MSLC表面存在各種LFL。透射電鏡術使用電子光束照射樣品。所述電子光束在高真空下操作並可以增強到1,000,000X。高真空和電子束都可以破壞所研究的系統。因此，為了使許多樣品可以得到檢測，必須將它們制薄、乾燥並通常含有對比染色劑。
用於檢測脂質體結構的一種技術是負染色法。負染色法增強了被包圍或包埋在電子緻密物質中樣品結構的成象。在將氣體和包括表面活性劑-脂質體混合物的含水系統混合前及混合後，分別在TEM下使用磷鎢酸(PTA)作為染色劑檢測樣品，以證明形成了MSLC。
在將表面活性劑-LFL系統與氣體混合(「非激活」樣品)混合前，將六滴預激活系統加入到1ml0.3％PTA染色劑中並輕輕振動。將該混合物靜置5分鐘，然後將一滴所述混合物塗到載網平板上。將所述載網在一片濾紙上風乾30分鐘，然後將它轉移載網負載箱中，用於TEM研究。
將一滴MSLC樣品(與氣體混合以後)加入到1mL 0.3％PTA染色劑中並輕輕混合。然後將一滴上述液體塗到載網上。經「燈芯」效應和風乾將多餘的液體除去。
TEM圖象顯示所述組合物(與全氟化碳氣體混合前)含有大約50nm-100nm的脂質體。混合後的MSLC懸浮液(與全氟化碳氣體混合後)的TEM圖象顯示各種MSLC為大約300nm-1000nm，包括具有脂質或表面活性劑外層的充氣微球空隙，沿著表面上具有大約50nm-100nm的脂質體單元。
螢光分析螢光探針實驗用於研究脂質體系統的一般化學特性。螢光探針是一種螢光團，典型的如芘，它定位在脂質體的特殊範圍內並通過產生螢光發射響應能量光子。所述發射可以用於確定微環境極性(micropolarity)和系統中螢光團的局部濃度。
為了進行這個實驗，將芘注射進對照介質(不含表面活性劑或充液脂質體的溶液)的小瓶中、表面活性劑和充液脂質體(與全氟化碳氣體混合前)的小瓶中，以及含有各種MSLC的懸浮液(在所述組合物與全氟丙烷高速混合後)的小瓶中，以對比芘螢光光譜。所使用的對照介質由80％氯化鈉溶液(9％NaCl)、10％丙二醇和10％甘油混合物組成。如實施例1所述製備MSLC懸浮液。
研究結果顯示在對照介質中芘的微環境極性與溶於純水環境中的芘一致。在表面活性劑/充液脂質體系統(與氣體混合前)中芘的微環境極性與溶於各種LFL脂質膜中的芘一致。將全氟化碳氣體與表面活性劑/充液脂質體系統高速機械混合後，所述芘的局部濃度隨著在TEM實驗中所觀察到的脂質體聚集體系統例如MSLC結構的出現而增加。
軟X-射線顯微鏡軟X-射線是具有大約100-1000eV能量的X-射線。這些能量將與低Z原子如碳和氧的K殼吸附邊緣相匹配，或與如鈣原子的L殼邊緣相匹配。這些X-射線的波長在1-10nm範圍內，而那些可見光的波長為350-700nm。這使得可以得到非常高解析度的圖象。軟X-射線顯微鏡提供高解析度而避免樣品遭到破壞；所述X-射線對樣品幾乎沒有影響。
使用軟X-射線顯微鏡技術研究MSLC懸浮液。在兩個氮化矽膜之間製備樣品。該膜在200微米厚9mm×9mm的矽構架中具有100nm的厚度和3mm×3mm的大小。在溼測試池的每一側固定一個膜後，使用注射器將非常小的一滴(小於大約5μL，但是不是確定的容量)MSLC物質放置在所述任一片膜上。對於這些實驗沒有稀釋或預處理樣品。下一步，將溼測試池的兩部分放在一起並用螺絲釘固定在一起。用可見光顯微鏡核查所述樣品兩層膜之間的層厚度。如果所述層厚度不合適則可調整螺絲釘以便得到合適的厚度。將一小滴水放到溼測試池的儲藏槽中以防止樣品的蒸發。用小片膠布將儲藏槽密封，然後將溼測試池安裝在顯微鏡中。
軟X-射線顯微鏡的測試結果表明，與全氟丙烷氣體高速混合後的系統含有大約300nm-500nm的各種MSLC，基本上沿著整個界面的表面含有具有大約50nm-100nm充液脂質體單元。
各種MSLC可被作為用於診斷超聲所使用的通用目的的超聲對照劑。它們也可經修飾以含有連接或吸附在所述MSLC表面的充液脂質體的生物打靶部分，以便提供在體內各種MSLC的選擇性定位。各種生物靶向的MSLC可用於特殊疾病過程的靶向對比超聲成象。另外，這些生物靶向的MSLC可用於藥物的局部傳遞，所述藥物包封在充液脂質體中，當各種MSLC在體內受超聲能量激發可釋放出來。
所述製劑可以通過灌注或注射，經靜脈內或腹膜內給藥。所述製劑的溶液可以在水中、任選與無毒的表面活性劑混合製備。分散劑可以在含有甘油、液體聚乙二醇或其它合適的腸胃外稀釋劑的水溶液中製備。
合適的用於注射或灌注的藥用劑型可包括無菌水溶液、分散劑或無菌散劑，所述散劑包括適合當場配製成無菌可注射或可灌注溶液或分散液的製劑，任選被包封在脂質體中。在所有情況下，最終的劑型應該是無菌、液體的並且在製備和貯藏條件下穩定。液體載體或溶媒是藥學上可接受的稀釋劑，例如水、乙醇、多羥基化合物(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)等。可以例如通過形成脂質體、通過維持所需的粒徑下(在分散體的情況下)或通過使用表面活性劑保持合適的流動性。在許多情況下，優選包括等滲劑例如糖類、緩衝劑或氯化鈉。通過使用如明膠、纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或類似的懸浮助劑等試劑可以製備可注射組合物的長期懸浮液。
通過摻入以上所述所需的成分、隨後經過濾消毒製備無菌可注射溶液。當使用無菌粉末用於製備無菌注射液時，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥技術，可得到活性成分及任何已經存在於無菌過濾溶液中的其它所需成分的散劑。
將所述微球脂質體複合體(MSLC)以在基本為含水介質中含有大約103-109微球脂質體複合體的懸浮液形式注射到患者或人體內。當達到使各種MSLC循環到全身的充足時間後，使用超聲成象儀(例如常規臨床使用的超聲成象儀)成象或(具有較高能量或重複聲波作用的脈衝)幹擾MSLC，以在疾病部位或在重要器官例如心臟或腫瘤或炎症部位釋放出治療藥物。
作為對比成象劑的本發明製劑的性能可以使用本領域熟知的藥理學模型確定。例如參考Villanueva等(Villanueva，F.S.，Glasheen，W.P.，Sklenar，J.，Kaul，S.Cirulation，88，596-604(1993))。
作為治療藥物的本發明製劑的性能可以使用本領域熟知的藥理學模型確定。例如參考Unger(PCT/US961/09938)(WO96/40285)。
現在通過以下非限定性實施例對本發明作出舉例說明。
通用目的的診斷性MSLC對比劑的製備實施例1製備包括溶於水(最終容量為100ml)中的甘油(10ml)和NaCl(680±2mg)的鹽水甘油溶液(100ml)。在100ml容量瓶中，將DPPC(二棕櫚醯磷脂醯膽鹼)(40.0mg)、MPEG500 DPPE(二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺)(30.0mg)和DPPA(4.5mg)與丙二醇(10ml)混合，將所述容量瓶放置在熱水浴(70℃)中並超聲處理15分鐘，直至所述溶液澄清。然後加入鹽水/甘油溶液使所述混合物終體積為100ml，將該懸浮液充分混合。將懸浮液(1.6ml)轉移到2ml硼矽酸鹽玻璃管瓶中。將上部空間用全氟丙烷氣體吹掃，將管瓶加塞並密封。所述瓶塞是West Gray V 50 lyo 13mm，4416/50彈性配方。所述密封圈是可輕輕撕掉的鋁密封條。使用IONOS Ionomix將含有脂質懸浮液的管瓶振動45秒鐘。振動後，所述懸浮液變為乳白色。
生物靶向診斷MSLC物質的製備實施例2和3描述了包括對腫瘤新生血管打靶部分(其是αvβ3拮抗劑)的本發明超聲對照劑的合成。
實施例2部分A.1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)-十二烷酸酯偶聯物的合成 在攪拌下(5分鐘)，將十二烷酸二琥珀醯亞氨基酯(0.424g，1mmol)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)(1.489g，1mmol)和環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)TFA鹽(0.831g，1mmol)(有關該環肽打靶部分的合成參考美國專利系列第09/281,474號，該方法結合在本文中作為參考)溶於氯仿(25ml)中。加入碳酸鈉(1mmol)和硫酸鈉(1mmol)，並將該溶液在室溫、氮氣氛下攪拌(18小時)。真空除去氯仿並經製備性HPLC或重結晶從粗製產物混合物中純化出標題化合物。
部分B.對照劑組合物的製備將1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)-十二烷酸酯偶聯物與三種其它脂質，即1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂酸、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼和N-(甲氧基聚乙二醇5000氨基甲醯基)-1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺以2∶4∶54∶40的相對重量比混合。然後在2cc玻璃管瓶中製備pH為6-7的含有所述脂質混合物(1mg/mL)、氯化鈉(7mg/mL)、甘油(0.1mL/mL)和丙二醇(0.1mL/mL)的含水懸浮液。將管瓶中的空氣排空並置換為全氟丙烷，並將管瓶密封。將懸浮液在密封管瓶中、在牙科混合器(dental amalgamator)中攪拌30-45秒以形成乳白色溶液，所得溶液適用於生成血管成象的超聲對照劑。
實施例3部分A.ω-氨基-PEG3400-環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)的製備 將三乙胺(3mmol)加入到N-Boc-PEG3400-琥珀醯亞氨基酯(1mmol)和環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)(1mmol)的二甲基甲醯胺(DMF)溶液(25mL)中。將反應混合物在氮氣氛、室溫下攪拌過夜並在真空下除去溶劑。將粗製產物溶於三氟乙酸/二氯甲烷(1∶1體積/體積)中並攪拌4小時。除去揮發性物質並經在二乙醚中研磨分離出標題化合物的TFA鹽。
部分BDPPE-PEG3400-環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)-十二烷酸酯偶聯物的製備 在攪拌下，用5分鐘將十二烷酸二琥珀醯亞氨基酯(1mmol)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)(1mmol)和ω-氨基-PEG3400-環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)TFA鹽(1mmol)溶於氯仿(25ml)中。加入碳酸鈉(1mmol)和硫酸鈉(1mmol)，將溶液在室溫、氮氣氛下攪拌18小時。真空除去DMF並經製備性HPLC或重結晶從粗製產物混合物中純化出標題化合物。
部分C對照劑組合物的製備將DPPE-PEG3400-環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)-十二烷酸酯偶聯物與三種其它的脂質，即1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂酸、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼和N-(甲氧基聚乙二醇5000氨基甲醯基)-1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺以1∶6∶54∶41的相對重量比混合。然後在2cc玻璃管瓶中製備pH為6-7的含有所述脂質混合物(1mg/mL)、氯化鈉(7mg/mL)、甘油(0.1mL/mL)和丙二醇(0.1mL/mL)的含水懸浮液。排空管瓶中的空氣，置換為全氟丙烷，並將管瓶密封。將懸浮液在密封管瓶中、在牙科混合器中攪拌30-45秒以形成乳白色懸浮液，所述懸浮液適合作為超聲對照劑。
以下實施例4和5描述了包括對基質金屬蛋白酶抑制劑的打靶部分的本發明超聲對照劑的合成。這些物質用於將MSLC對細胞外基質降解的部位進行打靶，所述細胞外基質降解在腫瘤、動脈粥樣硬化斑和CHF(充血性心力衰竭)中的心肌組織退化部位中發生。這些組合物用於將所述各種聲活性的MSLC限定在疾病部位，以對這些病變部位選擇性超聲成象。或者，如在實施例8和9中所述，可以採用在連接到各種MSLC上的各種LFL內部的治療藥物製備組合物，這可通過超聲激發藥物在疾病特殊部位釋放。
實施例41-(1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)-α，ω-二羰基PEG3400-2-{[7-(N-羥基氨基甲醯基)(3S，6R，7S)-4-氮雜-6-(2-甲基丙基)-11-氧雜-5-氧代雙環[10.2.2]十六-1(15)，12(16)，13-三烯-3-基]羰基氨基}-N-(3-氨基丙基)乙醯胺偶聯物的合成 向琥珀醯亞氨基酯DSPE-PEG-NHS酯(Shearwater Polymers，Huntsville，Alabama)(1mmol)的氯仿(25ml)溶液中加入2-{[7-(N-羥基氨基甲醯基)(3S，6R，7S)-4-氮雜-6-(2-甲基丙基)-11-氧雜-5-氧代雙環[10.2.2]十六-1(15)，12(16)，13-三烯-3-基]羰基氨基}-N-(3-氨基丙基)乙醯胺TFA鹽(1mmol)(關於所述打靶部分的合成參見美國專利系列第60/182,627號)。加入碳酸鈉(1mmol)和硫酸鈉(1mmol)並將該溶液在室溫、氮氣氛下攪拌18小時。在真空中除去溶劑並經製備性HPLC將標題化合物從粗製產物混合物中純化。
對照劑組合物的製備將1-(1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)-α，ω-二羰基PEG3400-2-{[7-(N-羥基氨基甲醯基)(3S，6R，7S)4-氮雜-6-(2-甲基丙基)-11-氧雜-5-氧代雙環[10.2.2]十六-1(15)，12(16)，13-三烯-3-基]羰基氨基}-N-(3-氨基丙基)乙醯胺偶聯物與三種其它磷質，即1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂酸、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼和N-(甲氧基聚乙二醇5000氨基甲醯基)-1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺以1∶6∶54∶41的重量比混合。然後在2ml玻璃管瓶中製備pH為6-7的含有所述脂質混合物(1mg/mL)、氯化鈉(7mg/mL)、甘油(0.1mL/mL)和丙二醇(0.1mL/mL)的含水懸浮液。抽空管瓶中的空氣，用全氟丁烷置換，將管瓶密封。將懸浮液在密封管瓶中、在牙科混合器中攪拌30-45秒以形成各種靶向基質金屬蛋白酶的MSLC的乳白色懸浮液。所述懸浮液適合用作超聲對照劑。
實施例51-(1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)-α，ω-二羰基PEG3400-[7-(N-羥基氨基甲醯基)(3S，6R，7S)-4-氮雜-6-(2-甲基丙基)-11-氧雜-5-氧代雙環[10.2.2]十六-1(15)，12(16)，13-三烯-3-基]-N-{[4-(氨基甲基)苯基]甲基}甲醯胺偶聯物的合成 向琥珀醯亞氨基酯DSPE-PEG-NHS酯(Shearwater Polymers，Huntsville，Alabama)(1mmol)的氯仿(25ml)溶液中加入[7-(N-羥基氨基甲醯基)(3S，6R，7S)-4-氮雜-6-(2-甲基丙基)-11-氧雜-5-氧代雙環[10.2.2]十六-1(15)，12(16)，13-三烯-3-基]-N-{[4-(氨基甲基)苯基]甲基}甲醯胺TFA鹽(1mmol)(關於MMP打靶部分的合成參見美國專利系列第60/182,627號)。加入碳酸鈉(1mmol)和硫酸鈉(1mmol)並將該溶液在室溫、氮氣氛下攪拌18小時。真空除去溶劑，並經製備性HPLC從粗製產物混合物中純化出標題化合物。
對照劑組合物的製備將1-(1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)-α，ω-二羰基PEG3400-[7-(N-羥基氨基甲醯基)(3S，6R，7S)-4-氮雜-6-(2-甲基丙基)-11-氧雜-5-氧代雙環[10.2.2]十六-1(15)，12(16)，13-三烯-3-基]-N-{{4-(氨基甲基)苯基]甲基}甲醯胺偶聯物與三種其它磷脂，即1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂酸；1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼和N-(甲氧基聚乙二醇5000氨基甲醯基)-1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺以1∶6∶54∶41的相對重量比混合。然後在2cc玻璃管瓶中製備pH為6-7的含有所述脂質混合物(1mg/mL)、氯化鈉(7mg/mL)、甘油(0.1mL/mL)和丙二醇(0.1mL/mL)的含水懸浮液(1.6ml)。抽空管瓶中的空氣並用全氟丁烷置換，將管瓶密封。將懸浮液在管瓶中、在牙科混合器中攪拌30-45秒以形成各種靶向基質金屬蛋白酶的MSLC的乳白色懸浮液。所述懸浮液適合用作超聲對照劑。
生物靶向治療性MSLC物質的製備實施例6向實施例3中的磷脂對照劑組合物中加入多柔比星(100-200mg/ml)。將1-2毫升液體移至管瓶中。抽空管瓶中的空氣並用全氟丁烷置換，將管瓶密封。將管瓶在牙科混合器中攪拌30-45秒以形成乳白色MSLC懸浮液用於治療。
實施例7向實施例4中的磷脂對照劑組合物中加入環磷醯胺(100-200mg/ml)。將1-2毫升液體移至管瓶中。抽空管瓶中的空氣並用全氟丁烷置換，將管瓶密封。將管瓶在牙科混合器中攪拌30-45秒以形成乳白色MSLC懸浮液用於治療。
實施例8向實施例5中的磷脂對照劑組合物中加入環磷醯胺(100-200mg/ml)。將1-2毫升液體移至管瓶中。抽空管瓶中的空氣，並用全氟丁烷置換，將管瓶密封。將管瓶在牙科混合器中攪拌30-45秒以形成乳白色MSLC懸浮液用於超聲活性治療。
實施例9向實施例5中的磷脂對照劑組合物中加入組織纖溶酶原激活物(10-100mg/ml)。將1-2毫升液體移至管瓶中。抽空管瓶中的空氣，並用全氟丁烷置換，將管瓶密封。將管瓶在牙科混合器中攪拌30-45秒以形成乳白色MSLC懸浮液用於治療。
實施例10在注射進活體患者(例如哺乳動物)並等待充足時間以使各種靶向MSLC位於或接近疾病部位，可以得到診斷超聲掃描，或在傳送治療藥物情況下，經重複脈衝或經使用非常高功率的超聲能量的單一脈衝，使足夠的超聲能量用於分裂各種MSLC並在靶向位置釋放藥物。
所有出版物、專利以及專利文獻結合在本文中作為參考。已參考各種特殊的和優選的實施方案和技術對本發明作出描述。然而，應理解可以做許多改變和改良，並且這些改變和改良包括在本發明的精神和範圍內。
權利要求
1.一種製劑，所述製劑包含懸浮在介質中的氣體微球脂質體複合體，其中所述氣體微球脂質體複合體包含充氣微球；至少一種吸附在所述充氣微球上的脂質和表面活性劑；以及附著在所述脂質或表面活性劑上的充液脂質體。
2.權利要求1的製劑，其中所述充氣微球在25℃和1大氣壓下的水溶解度小於大約1.0％體積。
3.權利要求1的製劑，其中所述充氣微球的平均直徑為大約0.1μm-10μm。
4.權利要求1的製劑，其中所述充氣微球的平均直徑為大約0.5μm-10μm。
5.權利要求1的製劑，其中所述充氣微球包含至少一種惰性氣體。
6.權利要求5的製劑，其中所述惰性氣體是稀有氣體。
7.權利要求5的製劑，其中所述惰性氣體是全氟代乙醚氣體。
8.權利要求5的製劑，其中所述惰性氣體是全氟化碳氣體。
9.權利要求1的製劑，其中所述充氣微球含有吸附在其表面上的脂質。
10.權利要求1的製劑，其中所述充氣微球含有吸附在其表面上的表面活性劑。
11.權利要求1的製劑，其中所述脂質或表面活性劑在所述充氣微球表面形成單分子層。
12.權利要求1的製劑，其中所述脂質或表面活性劑在所述充氣微球表面形成雙分子脂質體層或多分子脂質體層。
13.權利要求1的製劑，其中所述表面活性劑是非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑或陰離子表面活性劑。
14.權利要求13的製劑，其中所述非離子表面活性劑包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、纖維素、明膠、黃原膠、果膠或葡聚糖。
15.權利要求13的製劑，其中所述陽離子表面活性劑包括四烷基銨離子、四烷基鏻離子或其合適的鹽。
16.權利要求15的製劑，其中所述陽離子表面活性劑包括四己基銨、四辛基銨、四癸基銨、四丁基銨、四己基鏻、四辛基鏻、四丁基鏻、四苯基鏻或其合適的鹽。
17.權利要求13的製劑，其中所述陰離子表面活性劑包括烷基磺酸根、烷基羧酸根或其合適的鹽。
18.權利要求17的製劑，其中所述陰離子表面活性劑包括十二烷基硫酸根、十六烷基硫酸根、十二烷基羧酸根、十六烷基羧酸根或其合適的鹽。
19.權利要求1的製劑，其中所述脂質包括磷脂、糖脂、甘油三酯或脂肪酸。
20.權利要求19的製劑，其中所述磷脂包括二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二肉豆寇醯磷脂醯膽鹼、二月桂醯磷脂醯膽鹼或二油醯磷脂醯膽鹼。
21.權利要求1的製劑，其中所述充液脂質體以連續方式附著在所吸附的脂質或表面活性劑上。
22.權利要求1的製劑，其中所述充液脂質體佔據所述充氣微球區的外部表面的約50％以上。
23.權利要求1的製劑，其中每一種所述充液脂質體各自的直徑為大約10nm-200nm。
24.權利要求1的製劑，其中每一種所述充液脂質體各自的直徑為大約20nm-100nm。
25.權利要求1的製劑，其中每一種所述充液脂質體各自的直徑比所述充氣微球的直徑小大約10％。
26.權利要求1的製劑，其中每一種所述充液脂質體獨立包括在所述充液脂質體內部的治療藥物或診斷用藥。
27.權利要求26的製劑，其中所述治療藥物是抗凝藥、溶栓藥、抗腫瘤藥或抗炎藥。
28.權利要求26的製劑，其中所述治療藥物包括多柔比星、環磷醯胺、阿酶素、甲氨蝶呤、吉西他濱、諾維本、順鉑、組織型纖溶酶原激活劑、引替瑞林、羅昔非班、密都錠或依那西普。
29.權利要求26的製劑，其中所述診斷用藥包括X-射線對照劑或MRI對照劑。
30.權利要求1的製劑，其中每一種所述充液脂質體獨立具有附著在所述充液脂質體表面的高親合力的打靶部分。
31.權利要求30的製劑，其中附著在所述氣體微球脂質體複合體表面的高親合力打靶部分包括結合到受體上的配體，所述受體正調節血管生成；結合到受體上的配體，所述受體正調節炎症；或結合到受體上的配體，所述受體正調節動脈粥樣硬化。
32.權利要求30的製劑，其中所述附著在氣體微球脂質體複合體表面的高親合力打靶部分包括結合到整合子αvβ3、αvβ5或GPIIb/IIIa上的配體；結合到基質金屬蛋白酶上的配體；或結合到LTB4受體上的配體。
33.權利要求30的製劑，其中所述附著在氣體微球脂質體複合體表面的高親合力打靶部分包括1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)-十二烷酸酯；DPPE-PEG3400-環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)-十二烷酸酯；1-(1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇氨基)-α，ω-二羰基PEG3400-2-{[7-(N-羥基氨基甲醯基)(3S，6R，7S)-4-氮雜-6-(2-甲基丙基)-11-氧雜-5-氧代雙環[10.2.2]十六-1(15)，12(16)，13-三烯-3-基]羰基氨基}-N-(3-氨基丙基)乙醯胺；或1-(1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇氨基)-α，ω-二羰基PEG3400-[7-(N-羥基氨基甲醯基)(3S，6R，7S)-4-氮雜-6-(2-甲基丙基)-11-氧雜-5-氧代雙環[10.2.2]十六-1(15)，12(16)，13-三烯-3-基]-N-{[4-(氨基甲基)苯基]甲基}甲醯胺。
34.權利要求1的製劑，其中每一種所述充液脂質體獨立包括來自懸浮液介質的液體。
35.權利要求1的製劑，其中所述氣體微球脂質體複合體的平均直徑為大約0.1μm-10μm。
36.權利要求1的製劑，其中所述氣體微球脂質體複合體的平均直徑為大約0.2μm-4μm。
37.權利要求1的製劑，其中所述氣體微球脂質體複合體以兩個或更多個氣體微球脂質體複合體的聚集體形式存在。
38.權利要求37的製劑，其中所述聚集體的直徑為大約1μm-100μm。
39.權利要求1的製劑，其中所述氣體微球脂質體複合體的密度為所述介質密度的大約0.90-1.10。
40.權利要求1的製劑，其中所述脂質或表面活性劑包括高親合力的打靶部分。
41.權利要求1的製劑，其中所述脂質或表面活性劑包括治療藥物。
42.權利要求41的製劑，其中所述治療藥物包括多柔比星、環磷醯胺、阿酶素、甲氨蝶呤、吉西他濱、諾維本、順鉑、組織型纖溶酶原激活劑、引替瑞林、羅昔非班、密都錠或依那西普。
43.權利要求1的製劑，其中所述介質包括診斷用藥。
44.權利要求43的製劑，其中所述診斷用藥是X-射線或MRI對照劑。
45.權利要求40的製劑，其中所述高親合力的打靶部分包括1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)-十二烷酸酯；DPPE-PEG3400-環(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-賴氨酸)-十二烷酸酯；1-(1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇氨基)-α，ω-二羰基PEG3400-2-{[7-(N-羥基氨基甲醯基)(3S，6R，7S)-4-氮雜-6-(2-甲基丙基)-11-氧雜-5-氧代雙環[10.2.2]十六-1(15)，12(16)，13-三烯-3-基]羰基氨基}-N-(3-氨基丙基)乙醯胺；或1-(1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇氨基)-α，ω-二羰基PEG3400-[7-(N-羥基氨基甲醯基)(3S，6R，7S)-4-氮雜-6-(2-甲基丙基)-11-氧雜-5-氧代雙環[10.2.2]十六-1(15)，12(16)，13-三烯-3-基]-N-{[4-(氨基甲基)苯基]甲基}甲醯胺。
46.一種對需要超聲成象的患者進行超聲成象的方法，所述方法包括給予所述患者有效量的權利要求1-45中任一項的製劑；允許足夠的時間使所述充氣微球複合體循環到達靶向區域；以及在所述患者身上完成超聲成象。
47.權利要求46的方法，其中所述患者是人。
48.權利要求46的方法，其中所述有效量的製劑包括大約103-1010的氣體微球脂質體複合體。
49.權利要求46的方法，其中所述足夠的時間是大約5分鐘到大約2小時。
50.權利要求46的方法，其中所述足夠的時間是大約5-30分鐘。
51.一種治療需要治療的患者的心臟病、炎症、感染、癌症或血栓栓塞性疾病的方法，該方法包括給予該患者有效量的權利要求1-45中任一項的製劑，其中一種或多種充液脂質體獨立包括治療藥物；允許足夠的時間用於使所述氣體微球複合體循環到達靶向區域；以及施加足夠超聲能量到患者體內的病變區域，使治療藥物從所述微球脂質體複合體中釋放到病變部位。
52.權利要求51的方法，其中所述患者是人。
53.權利要求51的方法，其中每一種所述充液脂質體獨立包括治療藥物。
54.權利要求51的方法，其中所述有效量的製劑包括大約103-1010的氣體微球脂質體複合體。
55.一種製備權利要求1-45中任一項的製劑的方法，所述方法包括使包含至少一種脂質或至少一種表面活性劑的脂質體水溶液懸浮液與在25℃和1大氣壓下水溶解度小於大約1.0％體積的氣體接觸，並且充分混合所得的懸浮液以形成所述製劑。
56.權利要求55的方法，其中所述混合通過機械攪拌完成。
57.權利要求55的方法，其中所述混合通過超聲作用完成。
58.權利要求55的方法，其中所述混合通過將氣體高速注射進入所述含水脂質體懸浮液中完成。
59.一種製備權利要求1-45中任一項的製劑的方法，所述方法包括使包含至少一種治療藥物和至少一種表面活性劑的脂質體水溶液懸浮液與在25℃和1大氣壓下水溶解度小於大約1.0％體積的氣體接觸，並且充分混合所得懸浮液以形成所述製劑。
60.權利要求59的方法，其中所述混合通過機械攪拌完成。
61.權利要求59的方法，其中所述混合通過超聲作用完成。
62.權利要求59的方法，其中所述混合通過將氣體高速注射進入所述含水脂質體懸浮液中完成。
63.一種用於製備權利要求1-45中任一項的製劑的試劑盒，所述試劑盒包括一種含有水溶液的容器，其中所述水溶液包括至少一種表面活性劑和充液脂質體；以及將在25℃和1大氣壓下水溶解度小於大約1.0％體積的氣體導入所述水溶液中的裝置。
64.權利要求63的試劑盒，其中所述容器包括上部空間。
65.權利要求63的試劑盒，其中所述上部空間包括至少一種在25℃和1個大氣壓下的水溶解度小於大約1.0％體積的惰性氣體。
66.權利要求63的試劑盒，其中所述惰性氣體是全氟化碳氣體。
67.權利要求63的試劑盒，其中所述惰性氣體是全氟代乙醚氣體。
68.權利要求63的試劑盒，其中所述惰性氣體是稀有氣體。
69.一種用於醫學治療或診斷的製劑，所述製劑包含懸浮在介質中的氣體微球脂質體複合體，其中所述氣體微球脂質體複合體包括充氣微球；吸附在所述充氣微球表面上的脂質和表面活性劑的至少一種；以及附著在所述脂質或表面活性劑上的充液脂質體。
70.含有懸浮在介質中的氣體微球脂質體複合體的製劑在製備用於治療需要此治療的患者的心臟病、炎症、感染、癌症或血栓栓塞性疾病的藥物中的用途，其中所述氣體微球脂質體複合體包括充氣微球；吸附在所述充氣微球表面上的脂質和表面活性劑的至少一種；以及附著在所述脂質或表面活性劑上的充液脂質體。
71.含有懸浮在介質中的氣體微球脂質體複合體的製劑在製備用於需要診斷成象的患者進行診斷成象的藥物中的用途，其中所述氣體微球脂質體複合體包含充氣微球；吸附在所述充氣微球表面上的脂質和表面活性劑的至少一種；以及附著在所述脂質或表面活性劑上的充液脂質體。
72.含有懸浮在介質中的氣體微球脂質體複合體的製劑在製備用於對需要此超聲成象的患者進行超聲成象的藥物中的用途，其中所述氣體微球脂質體複合體包含充氣微球；吸附在所述充氣微球表面上的脂質和表面活性劑的至少一種；以及附著在所述脂質或表面活性劑上的充液脂質體。
全文摘要
本發明描述了一種包含懸浮在介質中的氣體微球脂質體複合體的製劑，其中所述氣體微球脂質體複合體包含充氣微球；吸附在所述充氣微球表面上的脂質和表面活性劑的至少一種；以及附著在所述脂質或表面活性劑上的充液脂質體。本發明還描述了製備所述製劑的方法以及它們在超聲成象中的用途。本發明也包括所述製劑在治療患者心臟病、炎症、感染、癌症或血栓栓塞性疾病中的用途。
文檔編號A61K49/22GK1620314SQ01823708
公開日2005年5月25日 申請日期2001年8月16日 優先權日2001年8月16日
發明者A·P·小卡爾彭特, G·C·斯拉克 申請人:布里斯托-邁爾斯斯奎布藥品公司