大腸桿菌及其可溶性表達轉穀氨醯胺酶酶原的方法
2023-05-30 20:15:41
專利名稱：：大腸桿菌及其可溶性表達轉穀氨醯胺酶酶原的方法
技術領域：
：本發明涉及轉穀氨醯胺酶基因工程，特別是涉及大腸桿菌可溶性表達轉穀氨醯胺酶酶原的方法，實現轉穀氨醯胺酶酶原的可溶性表達，用於大規模工業化生產轉穀氨醯胺酶。
背景技術：
：轉穀氨醯胺酶是一種催化醯基轉移反應的轉移酶，主要催化蛋白質和多肽進行穀氨醯胺殘基的Y-醯胺基和賴氨酸的"氨基之間進行醯胺基轉移反應，將蛋白質進行分子間的共價交聯聚合，從而改變蛋白質本身和所附著的細胞、組織的結構與功能。該酶已在醫藥工業、食品工業和紡織工業等廣泛利用，有"21世紀超級粘合劑"的美稱，被認為是用於生產新型蛋白食品的最重要酶種，顯示出顯著的應用前景及優勢，因而引起了人們的高度重視。在日本與MTG有關的食品銷售額達2000億日元，是日本單種酶銷售額最大的一種。國外在轉穀氨醯胺酶特性及應用性的研究已經有很多報導，主要利用從動物器官組織中提取的酶樣品進行試驗。但由於動物組織來源少、提取工藝複雜、回收率低、產品成本過於昂貴的緣故，酶的生產應用一直受到很大限制。日本Ando等首先報導以輪枝鏈黴菌屬發酵法直接生產微生物轉穀氨醯胺酶(MTG)，將產品大批量投放市場，並獲得了巨大的經濟效益，吸引了國內外各方的廣泛關注和極大興趣。國內大量文獻報導的是轉穀氨醯胺酶應用的研究。中國食品釀造所、南京農業大學報導轉穀氨醯胺酶生產菌的選育，其中中國食品釀造所進行微生物轉穀氨醯胺酶生產菌的"神舟四號"飛船搭載育種。目前，主要通過兩種途徑來提高轉穀氨醯胺酶的產量。一是通過誘變育種和培養基優化來提高生產菌的產量，如日本味之素公司就是採用茂原鏈黴菌發酵生產MTG，但是這種方法獲得的高產菌很容易退化，生產不穩定；二是通過構建基因工程菌表達轉穀氨醯胺酶，如在2005年9月第21巻第五期的《生物工程學報》發表的《茂原鏈黴菌轉穀氨醯胺酶基因在大腸桿菌中高效表達》(作者徐斌，韓之波，楊萍，劉擁軍，李妍涵，韓忠朝)一文中就構建了基因工程菌成功地表達了轉穀氨醯胺酶，文中報導利用PCR方法從茂原鏈黴菌基因組DNA擴增出微生物轉穀氨醯胺酶的基因片段，而不是轉穀氨醯胺酶酶原基因，並構建表達質粒pET-MTG。後者在大腸桿菌(RosettaDE3)中得到高效表達，但表達的MTG存在於包涵體中，需要經洗滌、變性和復性等過程，並以強陽離子交換層析純化，才獲得了SDS-PAGE純的MTG，所以其過程是很繁瑣，很難實現工業化生產。
發明內容本發明克服了現有技術中的不足，本發明構建一株工程菌，通過低溫發酵的方法實現了可溶性表達轉穀氨醯胺酶酶原，然後用胰蛋白酶激活後獲得成熟的轉穀氨醯胺酶，簡化發酵生產工藝。本發明的技術方案概述如下，包括如下步驟大腸桿菌可溶性表達轉穀氨醯胺酶酶原的方法，包括如下步驟(1)轉穀氨醯胺酶酶原基因的擴增及表達載體的構建由原鏈黴菌轉穀氨醯胺酶酶原的核苷酸序列設計PCR弓I物進行PCR擴增，所述PCR引物的正向引物為SEQIDNo3所示，所述PCR引物的反向引物為SEQIDNo4所示，獲得表達轉穀氨醯胺酶酶原的基因片段，通過NcoI和XhoI雙酶切，克隆到原核表達載體pET-22b(+)中，構建表達載體pET22-proMTG，並轉化E.coliBL21(DE3)成為大腸桿菌(EscherichiacoliBL21/proMTG)，該菌株於2008年11月25日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCM208240，該菌株能夠高水平可溶性表達轉穀氨醯胺酶酶原。(2)可溶性表達轉穀氨醯胺酶酶原先在3638°CLB培養基中活化、培養1214h，然後以l^2^(v/v)的接種量接種到新鮮的LB培養基中，3638t:發酵生長23h後降低培養溫度到2028°C，然後加入誘導劑異丙基硫代-13-D-半乳糖苷誘導表達轉穀氨醯胺酶酶原，誘導劑異丙基硫代-P-D-半乳糖苷的濃度為0.4mMl.OmM，誘導表達培養68h後結束培養收菌，超聲波破碎細胞，離心後的上清液即為可溶性蛋白，含有轉穀氨醯胺酶酶原；(3)轉穀氨醯胺酶酶原的激活採用胰蛋白酶作為激活劑，對表達的轉穀氨醯胺酶酶原激活成為成熟的轉穀氨醯胺酶，胰蛋白酶的濃度為0.1%0.2%(mg/ml)，加入體積為酶原體積的1/101/20，作用時間為1030min;(4)高密度發酵對大腸桿菌E.coliBL21/proMTG進行高密度發酵；前期菌體生長階段的參數為溫度3638t:，溶氧控制在1822%的飽和溶氧濃度，pH為6.57.5，；待OD6。。至5060時，降低溫度至2028t:，加IPTG誘導表達，溶氧控制在2832%左右的飽和溶氧濃度，pH6.57.5，繼續培養68h收菌；(5)蛋白純化工藝對發酵的大腸桿菌用超聲波裂解細胞後離心，上清液直接上親和層析柱純化蛋白，用高濃度咪唑洗脫目的蛋白，獲得轉穀氨醯胺酶酶原蛋白。所述的誘導劑異丙基硫代-13-D-半乳糖苷誘導表達轉穀氨醯胺酶酶原的溫度優選為2224°C。相對於現有技術本發明具有如下優點本發明將茂原鏈黴菌轉穀氨醯胺酶酶原的基因克隆至原核表達載體pET-22b(+)，利用pET系統的高效表達，通過低溫(2028t:)誘變實現了可溶性表達，省去了繁瑣的包涵體變性及復性過程，簡化了發酵生產工藝。大腸桿菌E.coliBL21/proMTG進行高密度發酵後，粗提酶的活性達到9.6U/mL，分離純化後，比活力大於16U/mg，轉穀氨醯胺酶產量及比活力達到直接在大腸桿菌中表達形成包涵體並經變性及復性生產該酶的水平，但工藝簡單。圖1為PCR方法擴增pro-MTG片段圖；圖2為各個誘導溫度細胞破壁離心上清的SDS-PAGE電泳圖，箭頭所示為目的蛋白；圖3為pro-MTG純化SDS-PAGE圖4為發酵罐發酵誘導08h的細胞破壁離心上清的SDS-PAGE圖。具體實施條件下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於下述實施例實施例1工程菌E.coliBL21/proMTG的構建過程及在搖瓶規模下可溶性表達轉穀氨醯胺酶酶原的方法，包括以下步驟(l)PCR擴增轉穀氨醯胺酶酶原基因茂原鏈黴菌(Streptomycesmobaraensis)轉穀氨醯胺酶酶原的核苷酸序列是從文獻《MolecularCloningoftheGeneforMicrobialTransglutaminasefromStreptomycesmobaraensisandItsExpressioninStreptomyceslividans》(Biosci.Biotech.Biochem.58(1)，82-87，1994)中獲得，轉穀氨醯胺酶酶原基因的序列見序列表SEQIDNol，以liig茂原鏈黴菌基因組DNA為PCR反應模板，正向引物和反向引物分別為SEQIDNo3和SEQIDNo4所示，PCR反應條件為95。C預變性10min，94°C變性lmin，65t:退火30s，72"C延伸2.5min，共30個循環，最後在72"C延伸10min，擴增出一條與轉穀氨醯胺酶酶原基因大小相符的DNA片段。如圖1所示，圖中1為DNAmarker;2，3，4均為PCRproduct。通過對比marker可知擴增出來的DNA片段大小與理論大小一致。表達質粒的構建獲得表達轉穀氨醯胺酶酶原的基因片段，通過NcoI和XhoI雙酶切，克隆到原核表達載體pET-22b(+)中，構建表達載體pET22-proMTG，並轉化大腸桿菌BL21(DE3)成為工程菌E.coliBL21/proMTG。p)大腸桿菌發酵工藝接種上述大腸杆新鮮的單菌落於50mLLB培養基中(含有Amp100iig/ml)，37°C，200rpm活化12h，將活化的種子接種於lOOmLLB培養基中(含有Amp100g/ml)發酵生長2h，然後加誘導物IPTG在低溫條件下誘導表達轉穀氨醯胺酶酶原，誘導4h後離心收集細胞，超聲波破碎細胞後離心，上清液用於後續蛋白純化。轉穀氨醯胺酶酶原的胺基酸序列如SEQIDNo2所示，信號肽pelB如序列表中加粗所示，酶原前導肽如序列表中斜體所示，在前導肽後是成熟的轉穀氨醯胺酶的胺基酸序列。實施例2大腸桿菌E.coliBL21/proMTG誘導表達溫度的優化大腸桿菌E.coliBL21/proMTG的構建見實施例1。上述工程菌的單菌落接種於50mLLB培養基中，37°C，200rpm活化12h後2%接種量接種於lOOmL發酵培養基中發酵生長2h後，加入IPTG至終濃度lmM，然後在2037t:的條件下進行誘導表達，68h後離心收集細胞，超聲破碎離心取上清，上清用胰蛋白酶激活後用比色法測定轉穀氨醯胺酶的活力，發現在202『C條件下均不同程度的形成可溶性表達，且在24tH秀導條件下表達量最高。各個溫度誘導破壁離心上清的SDS-PAGE電泳圖如圖2所示，在2『C以下，均可見一條比較粗的電泳條帶。實施例3大腸桿菌E.coliBL21/proMTG接種量的優化大腸桿菌E.coliBL21/proMTG的構建見實施例1。大腸桿菌E.coliBL21/proMTG的單菌落接種於50mLLB培養基中，37°C，200rpm活化12h後，分別取1、2、3、4mL活化的種子接種於lOOmL發酵培養基中發酵生長至0D6。。=0.5左右後，加入IPTG至終濃度lmM，然後置於24tH秀導表達。4h後離心收集細胞，超聲破碎離心取上清，上清用胰蛋白酶激活後用比色法測定轉穀氨醯胺酶的活力，發現l^2^(v/v)接種量時酶活較高。實施例4大腸桿菌E.coliBL21/proMTG加入誘導物IPTG濃度的優化大腸桿菌E.coliBL21/proMTG的構建見實施例1。上述工程菌的單菌落接種於50mLLB培養基中，37°C，200rpm活化12h後2%接種量接種於100mL發酵培養基中發酵生長2h後，分別加入IPTG至終濃度0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、l.OmM，然後分別置於24tH秀導表達。4h後離心收集細胞，超聲波破碎離心取上清，上清用胰蛋白酶激活後用比色法測定轉穀氨醯胺酶的活力，發現誘導物IPTG的濃度對轉穀氨醯胺酶酶原的表達影響不大，發酵液中誘導物IPTG的終濃度在0.4mMl.OmM的條件下，均可高水平地表達轉穀氨醯胺酶酶原。實施例5胰蛋白酶激活轉穀氨醯胺酶酶原的工藝由於胰蛋白酶已實現工業化生產且生產價格不高，所以採用胰蛋白酶作為激活劑，對工程菌E.coliBL21/proMTG表達的轉穀氨醯胺酶酶原激活成為成熟的轉穀氨醯胺酶。分別配製不同濃度的胰蛋白酶溶液，發現當胰蛋白酶的濃度為(g/ml)0.1X0.2X(胰蛋白酶購至北京普博欣公司，2-4U/mh)，加入胰蛋白酶的體積為待激活酶原溶液體積的1/10，作用時間為1030min時，均可激活轉穀氨醯胺酶酶原。實施例6HisTrap柱親和層析純化pro-MTG:採用GE公司AKTApurifier層析儀和lmLHisTrapFFcrude柱純化蛋白。(l)用蒸餾水洗柱至基線平穩。(2)用bindingbuffer(50mMTris/HClbufferwith300mMNaCl，20mMimidazole,pH8.0)平衡柱子至基線平穩，流速為lmL/min。(3)上樣，流速為lmL/min。(4)用bindingbuffer洗柱至基線平穩。(5)用elutionbuffer(50mMTris/HClbufferwith300mMNaCl，500mMimidazole,pH8.0)洗脫，見峰起開始收集蛋白。pro-MTG純化SDS-PAGE圖見附圖3:lanel破壁離心上清；lane2流穿液；lane3Marker;lane4和lane5均為洗脫液。表1.純化數據項BS活UZniL體積mL總,活U回收率蛋A濃度蛋Ait比,活粗提酶9.6純化酷34.1實施例72L發酵罐高密度發酵重組大腸桿菌產酶狀況2L發酵罐發酵(工作體積為1L)，接種量為20mL，菌體生長階段條件控制在溫度37t:，pH為7.0，溶氧控制在20%左右，轉速和溶氧關聯。發酵培養基為細菌學蛋白腖10g、酵母粉5g、12mmol/LNa2HP04、15mmol/LKH2P04、14mmol/LNaCL、40mmol/L(NH4)2SO4、20mmol/L葡萄糖和12mmol/LMgS04。補料培養基為20%的葡萄糖(含有2mmol/LNa2HP04，3mmol/LKH2P04)，待菌體密度的0D6。。達到5060時，改變發酵溫度至24t:，加入IPTG進行誘導表達，IPTG的終濃度為lmmol/L，溶氧控制在30%，同時不斷的流加補料培養基，誘導8h後放罐，並分別在lh、2h、3h、4h、5h、6h、7h及8h取樣測酶活及電泳如圖4所示，發現在6小時左右已達到了最高峰，酶活數據表明遠高於目前國內報導的最高的可溶性表達水平(0.24U/ml)，轉穀氨醯胺酶產量及比酶活達到直接在大腸桿菌中表達形成包涵體並經變性及復性生產該酶的水平，而且發酵工藝更簡便。表2.發酵罐08h發酵的酶活數據tableseeoriginaldocumentpage7在國內，還未有關於大腸桿菌可溶性表達轉穀氨醯胺酶的報導。在2005年9月第21巻第五期的《生物工程學報》發表的《茂原鏈黴菌轉穀氨醯胺酶基因在大腸桿菌中高效表達》(作者徐斌，韓之波，楊萍，劉擁軍，李妍涵，韓忠朝)一文中構建了基因工程菌成功地表達了轉穀氨醯胺酶，但是表達的MTG存在於包涵體中，需要經洗滌、變性和復性等過程，並以強陽離子交換層析純化，才獲得了SDS-PAGE純的MTG，所以其過程是很繁瑣，很難實現工業化生產。因此，現在市場上的轉穀氨醯胺酶有兩種途徑生產。一是通過茂原鏈黴菌發酵生產，但是茂原鏈黴菌發酵有以下幾個缺點酶活產量不高，生產周期長且生產不穩定。二是通過將轉穀氨醯胺酶酶原克隆到穀氨酸棒狀桿菌中表達生產，日本味之素公司就是採用此方法生產。大腸桿菌做為宿主生產蛋白已有多年的歷史，且工藝成熟和低成本。本發明在表達質粒的選擇，酶切位點的選擇，宿主的選擇及培養條件的優化等多方面綜合考慮，成功地實現了大腸桿菌可溶性表達轉穀氨醯胺酶，經過2L高密度發酵實驗，單位體積發酵液的酶活高達9.6U/ml，單位細胞乾重的酶活高達470U/gDCW，是一種高效的產酶方法。本發明的重組蛋白的C端有6個組氨酸標記，可以利用N產親和層析一步純化蛋白，從而簡化了純化步驟，且回收率高達90%左右。序列表SEQIDNo1:1ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCG61ATGGCCATGGACAATGGCGCGGGGGAAGAGACGAAGTCCTACGCCGAAACCTACCGCCTC121ACGGCGGATGACGTCGCGAACATCAACGCGCTCAACGAAAGCGCTCCGGCCGCTTCGAGC181GCCGGCCCGTCGTTCCGGGCCCCCGACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCCGAGCCG241CTCGACAGGATGCCCGACCCGTACCGTCCCTCGTACGGCAGGGCCGAGACGGTCGTCAAC301AACTACATACGCAAGTGGCAGCAGGTCTACAGCCACCGCGACGGCAGGAAGCAGCAGATG361ACCGAGGAGCAGCGGGAGTGGCTGTCCTACGGCTGCGTCGGTGTCACCTGGGTCAATTCG421GGTCAGTACCCGACGAACAGACTGGCCTTCGCGTCCTTCGACGAGGACAGGTTCAAGAAC481GAGCTGAAGAACGGCAGGCCCCGGTCCGGCGAGACGCGGGCGGAGTTCGAGGGCCGCGTC541GCGAAGGAGAGCTTCGACGAGGAGAAGGGCTTCCAGCGGGCGCGTGAGGTGGCGTCCGTC601ATGAACAGGGCCCTGGAGAACGCCCACGACGAGAGCGCTTACCTCGACAACCTCAAGAAG661GAACTGGCGAACGGCAACGACGCCCTGCGCAACGAGGACGCCCGTTCCCCGTTCTACTCG721GCGCTGCGGAACACGCCGTCCTTCAAGGAGCGGAACGGAGGCAATCACGACCCGTCCAGG781ATGAAGGCCGTCATCTACTCGAAGCACTTCTGGAGCGGCCAGGACCGGTCGAGTTCGGCC841GACAAGAGGAAGTACGGCGACCCGGACGCCTTCCGCCCCGCCCCGGGCACCGGCCTGGTC901GACATGTCGAGGGACAGGAACATTCCGCGCAGCCCCACCAGCCCCGGTGAGGGATTCGTC961AATTTCGACTACGGCTGGTTCGGCGCCCAGACGGAAGCGGACGCCGACAAGACCGTCTGG1021ACCCACGGAAATCACTATCACGCGCCCAATGGCAGCCTGGGTGCCATGCATGTCTACGAG1081AGCAAGTTCCGCAACTGGTCCGAGGGTTACTCGGACTTCGACCGCGGAGCCTATGTGATC1141ACCTTCATCCCCAAGAGCTGGAACACCGCCCCCGACAAGGTAAAGCAGGGCTGGCCGCTC1201GAGCACCACCACCACCACCACTGA序列表SEQIDNo2:ESAPAASSAGPSFRAP信號肽pelB酶原前導肽的胺基酸序列MTEEOREWLSYGCVG成熟酶的胺基酸序列EKGFORAREVASVMGNHDPSRMKAVIYSKFDYGWFGAOTEADAWNTAPDKVKOGWPLEHHHHHH-序列表SEQIDNo3:5'-CATGCCATGGACAATGGCGCGGGGGAAG-3'序列表SEQIDNo4:5'-CCGCTCGAGCGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'權利要求一種大腸桿菌E.coliBL21/proMTG，其特徵在於該菌株保藏號為CCTCCM208240。2.大腸桿菌可溶性表達轉穀氨醯胺酶酶原的方法，其特徵包括如下步驟(1)轉穀氨醯胺酶酶原基因的擴增及表達載體的構建由原鏈黴菌轉穀氨醯胺酶酶原的核苷酸序列設計PCR引物進行PCR擴增，所述PCR引物的正向引物為SEQIDNo3所示，所述PCR引物的反向引物為SEQIDNo4所示，獲得表達轉穀氨醯胺酶酶原的基因片段，通過NcoI和XhoI雙酶切，克隆到原核表達載體pET-22b(+)中，構建表達載體pET22-proMTG，並轉化E.coliBL21(DE3)成為權利要求1所述的大腸桿菌；(2)可溶性表達轉穀氨醯胺酶酶原先在3638t:LB培養基中活化、培養1214h，然後以l^2^(v/v)的接種量接種到新鮮的LB培養基中，3638t:發酵生長23h後降低培養溫度到2028°C，然後加入誘導劑異丙基硫代-13-D-半乳糖苷誘導表達轉穀氨醯胺酶酶原，誘導劑異丙基硫代-P-D-半乳糖苷的濃度為0.4mMl.OmM，誘導表達培養68h後結束培養收菌，超聲波破碎細胞，離心後的上清液即為可溶性蛋白，含有轉穀氨醯胺酶酶原；(3)轉穀氨醯胺酶酶原的激活採用胰蛋白酶作為激活劑，對表達的轉穀氨醯胺酶酶原激活成為成熟的轉穀氨醯胺酶，胰蛋白酶的濃度為0.1%0.2%(mg/ml)，加入體積為酶原體積的1/101/20，作用時間為1030min;(4)高密度發酵對大腸桿菌E.coliBL21/proMTG進行高密度發酵；前期菌體生長階段的參數為溫度3638t:，溶氧控制在1822%的飽和溶氧濃度，pH為6.57.5，；待OD6。。至5060時，降低溫度至2028t:，加IPTG誘導表達，溶氧控制在2832%左右的飽和溶氧濃度，pH6.57.5，繼續培養68h收菌；(5)蛋白純化工藝對發酵的大腸桿菌用超聲波裂解細胞後離心，上清液直接上親和層析柱純化蛋白，用高濃度咪唑洗脫目的蛋白，獲得轉穀氨醯胺酶酶原蛋白。3.根據權利要求2所述的大腸桿菌可溶性表達轉穀氨醯胺酶酶原的方法，其特徵所述的誘導劑異丙基硫代-P-D-半乳糖苷誘導表達轉穀氨醯胺酶酶原的溫度為2224°C。全文摘要本發明公開了大腸桿菌及其可溶性表達轉穀氨醯胺酶酶原的方法，該方法包括如下幾個步驟(1)根據茂原鏈黴菌轉穀氨醯胺酶酶原基因的核苷酸序列，設計PCR引物進行PCR擴增，克隆到原核表達載體pET22b(+)中，構建表達載體pET22b-proMTG，轉化為大腸桿菌E.coliBL21/proMTG，該菌株保藏號為CCTCCM208240；(2)可溶性表達轉穀氨醯胺酶酶原；(3)轉穀氨醯胺酶酶原的激活；(4)高密度發酵；(5)蛋白純化工藝。本發明方法的轉穀氨醯胺酶產量及比活力達到直接在大腸桿菌中表達形成包涵體並經變性及復性生產該酶的水平，而且發酵生產工藝更簡單。文檔編號C12N9/10GK101691560SQ200810220160公開日2010年4月7日申請日期2008年12月19日優先權日2008年12月19日發明者崔翠,楊慧林,潘力,苗小康申請人:華南理工大學