包裝流感病毒載體的信號的製作方法

2023-05-30 20:27:11

專利名稱：包裝流感病毒載體的信號的製作方法
政府權益聲明本發明至少有一部分是在美利堅合眾國政府的資助下完成的(國立衛生院資助號為AI47446)。政府享有本發明中的某些權利。
背景技術：
流感病毒A和B的基因組由八段負極性單鏈RNA片段組成，其中兩段編碼包膜糖蛋白、血凝素(HA)及唾液酸苷酶(NA)。流感病毒複製以病毒顆粒表面上的病毒HA蛋白與含唾液酸的細胞受體結合為起始。與受體結合後，宿主細胞通過胞飲作用將病毒攝入。晚期核內體中的酸性環境激發HA的構象發生變化，啟動病毒包膜與核內體膜之間的融合，並使M2離子通道活化，導致質子流入病毒顆粒內。據認為將病毒顆粒內部暴露於低pH中，可以破壞M1蛋白和核糖核蛋白(RNP)複合物之間酸依賴性的相互作用，最終使RNP釋放入細胞質中。然後RNP會轉運到核，在這裡合成病毒mRNA及病毒基因組。mRNA進入細胞質中，從而病毒蛋白得以合成。核蛋白(NP)進入核內並用殼體包裝新合成的vRNA，並與三種聚合酶亞基蛋白(PA、PB1、PB2)一起形成RNP。當有M1及NS2蛋白存在時，RNP輸出核外。三種漿膜相關蛋白(HA、NA及M2)與RNP相互作用並以芽殖的方式形成新的病毒顆粒。NA負責從細胞的複合糖及病毒糖蛋白中去除唾液酸，從而將病毒從感染細胞中釋放出來(Lamb等，2000)。
根據HA(H1～H5)及NA(N1～N9)的抗原性A型病毒分成數種亞型。兩種不同的A型病毒所感染的細胞中，可以生成具有各種基因片段組合的類型內重排體(Wright等，2000)。但是，儘管兩種病毒均在人類群體共傳播，仍未發現A型病毒與B型病毒之間的天然類型間重排體。
研究者已嘗試在實驗室內生成A型和B型病毒之間的重排體，但沒有成功(Kaverin等，1983；Mikheera等，1982；Tobita等，1983)。Muster等(1991)生成了一種突變A型病毒，其中一個片段的NA片段非編碼區由B型病毒非結構性(NS)基因的非編碼區片段所取代。儘管此突變病毒的複製比野生型病毒慢得多，所達到的滴度也比野生型低，此類病毒的生成表明B型NS片段的非編碼區與A型流感病毒組分在RNA轉錄及複製水平上是兼容的。相反，當RNA片段所含外源編碼片段的旁側為A型流感病毒RNA片段3′和5』端非編碼區時，經過反覆傳代後不能在病毒顆粒內穩定維持(Luytjes等，1989)。Muster等(1991)也發現突變病毒在小鼠中減毒了，用突變病毒感染的動物可以耐受野生型病毒的攻擊。
因此需要有一種方法鑑別流感病毒複製期間負責所連結序列導入及/或維持的流感病毒序列。
發明概述本發明提供了分離重組核酸分子(多核苷酸)，如載體，其中該分子含有流感病毒的導入序列(「包裝信號」或vRNA衣殼化信號)及任選異源核酸片段。通常導入序列存在於各流感vRNA片段一端或兩端約150至250個核苷酸處。在一個實施方案中，流感病毒導入序列包含與NA 3』末端對應的序列，包括與NA編碼區N端對應的序列，例如包括3』非編碼區19個核苷酸及至少與NA起始19個編碼核苷酸對應的序列的A型NA vRNA 3』末端37個核苷酸；與任選NA vRNA 5』末端對應的導入序列，包括與NA編碼區C-末端對應的序列，例如包括5』非編碼區28個核苷酸的A型NA vRNA 5′末端67個核苷酸；以及至少39個與此NA 3′編碼區39個核苷酸對應的核苷酸。在另一實施方案中，流感病毒導入序列包含與NS vRNA 3』末端對應的序列，包括與NS編碼區N-末端對應的序列。在另一實施方案中，流感病毒導入序列包含與HA vRNA 5』末端對應的序列，包括與HA編碼區C-末端對應的序列，例如包括5』非編碼序列45個核苷酸及至少80個與HA 80個3』編碼核苷酸對應的核苷酸的A型HA vRNA 5』末端135個核苷酸；和任選與HA vRNA 3』末端對應的導入序列，包括與HA編碼區N-末端對應的序列，例如包括33個3』非編碼序列核苷酸及至少3個與HA編碼核苷酸起始3個對應的核苷酸的A型HA vRNA 5′末端36個核苷酸。在一個進一步的實施方案中，流感病毒導入序列包含與PB2 vRNA 5』末端對應的序列，包括與PB2編碼區C-末端對應的序列。在另一實施方案中，流感病毒導入序列包含與M vRNA 3』末端對應的序列，包括與M編碼區N端對應的序列，例如包括3』非編碼序列26個核苷酸及221個與M編碼核苷酸對應的核苷酸的A型M vRNA 3』末端247個核苷酸；與M vRNA 5』末端對應的序列，包括與M編碼區C-末端對應的導入序列，例如包括23個3』非編碼序列核苷酸及219個與M編碼區C-末端核苷酸最後219個對應的核苷酸的A型M vRNA 5′末端242個核苷酸。在另一實施方案中，流感病毒導入序列包含與NS vRNA 5』末端對應的序列，包括與NS編碼區N-末端對應的序列，例如包括3』非編碼序列和與NS編碼區N-末端對應的至少30個核苷酸的序列；與NSvRNA 5』末端對應的序列，包括與NS編碼區C端對應的導入序列，例如包括5』非編碼序列及與NS編碼區C-末端對應的序列的至少30個核苷酸的序列。在一個實施方案中，流感病毒導入序列包含與PB1 vRNA 5』末端對應的序列，包括與PB1編碼區N-末端對應的序列和與PB1 vRNA5』末端對應的序列，包括與PB1編碼區C-末端對應的導入序列。在另一實施方案中，流感病毒導入序列包含與PA vRNA 5』末端對應的序列，包括與PA編碼區N-末端對應的序列和與PA vRNA 5』末端對應的序列，包括與PA編碼區C-末端對應的序列。本文所述流感病毒「導入序列」，是指當存在於具有相應(同源)3』及5』非編碼區的vRNA中時可使含該序列的核酸分子導入病毒顆粒中並在反覆傳代過程中使該分子在病毒顆粒中得以維持的序列。
正如下文所述，利用基於質粒的反向遺傳學已在含截短NA片段的突變病毒中鑑定到了NA導入序列。該NA導入序列位於一個包括NAvRNA 3』末端的區域中，其中該3』末端延伸入部分NA編碼區中。因此，該區域可用於包裝和維持野生型NA RNA以及突變NA RNA，例如內部發生缺失及/或插入的RNA，包括表達目的開放閱讀框如含目的開放閱讀框的異源核酸片段的重組RNA。
也如此處所述，為了深入了解A型與B型流感病毒之間的類型間不兼容性，採用反向遺傳學在A型病毒背景下生成含完整B型HA片段的重排體。儘管B型HA片段確實由A型聚合酶複合物進行了轉錄，但是並未產生病毒。雖然含由B型HA全部編碼序列及其旁側A型HA非編碼序列組成的嵌合HA片段的A型病毒可以存活，但僅能微弱複製。生成一系列基於A型、包含嵌合HA的病毒，其中嵌合HA具有A型非編碼區、編碼A型病毒信號肽或跨膜/胞漿區或二者均有，以及B型HA來源區域的其它部分。這些病毒在細胞培養物中均長到超過106組織培養感染劑量50/ml，但是A型HA序列越多則複製情況越好，說明蛋白質-蛋白質相互作用或更多HA片段導入病毒顆粒中對於病毒高效生長起一定作用。與野生型A型或B型病毒相比，這些A/B嵌合病毒在小鼠中均減毒了。而且，對這些用嵌合病毒在鼻內免疫的動物給予致死量的野生型B型病毒攻擊時，所有動物均存活下來，示範了一種設計全新活疫苗病毒很有希望的方法。
這樣，當含特定流感病毒片段導入序列、同源3』及5』非編碼序列(區)和異源核酸片段的本發明分離核酸分子，以vRNA生產載體形式且在PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、諸如M1及/或M2之類的M及/或NS中一個或多個的病毒蛋白或編碼病毒蛋白的載體存在下，以及在PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、諸如M1及M2之類的M及/或NS中一個或多個的用於vRNA生產的vRNA或載體存在時導入到細胞中，就產生了重組病毒。該重組病毒可用於感染細胞。與本發明核酸分子對應的vRNA優選以是相應野生型vRNA的至少10％、更優選至少30％、甚至更優選至少50％的效率導入病毒顆粒中。在一個實施方案中，該核酸分子包括與野生型vRNA對應的序列和異源核酸片段，其中該異源核酸片段導入vRNA中與該vRNA編碼區對應的序列中，優選此插入基本上不破壞該導入序列。例如，該異源核酸片段導入到與NA編碼區起始300個核苷酸對應的序列之後。
在另一實施方案中，3』NA導入序列與NA編碼區N-末端1～183、1～90、1～45、1～21、1～19或19至183之間任意整數個核苷酸對應，在NA起始密碼子處還可包括突變。在另一實施方案中，5』NA導入序列與NA編碼區C-末端中的序列、相當於NA編碼區C-末端3』最多39、78或157或1至157之間任意整數個核苷酸的序列對應。在另一實施方案中，5』HA導入序列與HA編碼區C-末端中的序列、對應於HA編碼區C-末端3』最多75、80、268、291或518或1至518之間任意整數個核苷酸的序列對應。3』HA導入序列與HA編碼區N-末端的1～3、1～6、1～9、1～15、1～216、1～468或1～468間任意整數個核苷酸對應。在一實施方案中，3』PB1導入序列與PB1編碼區C-末端的1～250、1～200、1～150或1～250間任意整數個核苷酸對應。在一實施方案中，3』PA導入序列與PA編碼區N-末端的1～250、1～200、1～150或1～250間任意整數個核苷酸對應。在一實施方案中，5』PA導入序列與PA編碼區C-末端3』絕大部分核苷酸對應，如與PA編碼區C-末端3′1～250、1～200、1～150或1～250間任意整數個核苷酸對應。在另一實施方案中，3』M導入序列與M編碼區N-末端的1～250、1～242、1～240或1～250間任意整數個核苷酸對應，在M起始密碼子處還可包括突變。在另一實施方案中，5』M導入序列與M編碼區C-末端中的序列、對應於M編碼區C-末端3』最多50、100或220或1至250之間任意整數個核苷酸的序列對應。在另一實施方案中，3』NS導入序列與NS編碼區N-末端的1～250、1～200、1～150、1～30、1～20或1～250間任意整數個核苷酸對應，在NS起始密碼子處還可包括突變。在另一實施方案中，5』NS導入序列與NS編碼區C-末端中的序列、對應於NS編碼區C-末端3』最多10、30、150、200或250或1至250之間任意整數個核苷酸的序列對應。
相應地，本發明提供了包含與特定vRNA 3』及5』非編碼區對應的序列、相應vRNA的導入序列以及異源核酸片段的流感病毒載體。這樣，在一實施方案中，該載體包含NA vRNA 3』非編碼區、3』或5』NA vRNA導入序列、和任選3』或5』NA導入序列、異源核酸片段及NA vRNA 5』非編碼區。在另一實施方案中，該載體包含HA vRNA 3』非編碼區、5』或3』HA vRNA導入序列、或5』和3』HA導入序列、異源核酸片段及HAvRNA 5』非編碼區。在另一實施方案中，該載體包含NS vRNA 3』非編碼區、NS導入序列、異源核酸片段及NS vRNA 5』非編碼區。在另一實施方案中，該載體包含M vRNA 3』非編碼區、5』或3』M導入序列、或5』和3』M導入序列、異源核酸片段及M vRNA 5』非編碼區。在另一實施方案中，該載體包含PB2 vRNA 3』非編碼區、異源核酸片段、PB2導入序列、及PB2 vRNA 5』非編碼區。當在載體中使用兩段導入序列時，優選用異源核酸片段將它們隔開。可使用各載體製備用於導入細胞的vRNA或在細胞中表達vRNA，細胞中也存在病毒生產所需的其它流感病毒vRNA及蛋白。
在一實施方案中，該異源核酸片段包含與標記基因開放閱讀框對應的序列。在另一實施方案中，該異源核酸片段包含與治療基因開放閱讀框對應的序列。在另一實施方案中，該異源核酸片段包含與病原體或腫瘤細胞免疫原性肽或蛋白的開放閱讀框對應的序列，如用於誘導保護性免疫反應的肽或蛋白。舉例來說，該異源核酸片段可編碼在癌症治療或疫苗中使用的免疫原表位。因而可以製備包含該異源核酸片段的載體，以便載體vRNA的轉錄可生成編碼與諸如NA之類流感病毒蛋白融合的蛋白的mRNA。由此可考慮將該異源核酸片段與病毒導入序列融合以編碼融合蛋白，如與NA N-末端21個殘基的融合體。該融合蛋白可包含來自兩種不同流感病毒蛋白的序列，包括來自兩種不同NA或HA蛋白的序列。在另一實施方案中，異源核酸片段可包含與連接於開放閱讀框5』端的IRES對應的序列。
為通過基於質粒的反向遺傳學用大量流感病毒載體製備重組病毒，載體中的流感病毒DNA相對於啟動子來說可以在正義的也可以在反義的方向。這樣，載體可編碼A型、B型或C型流感病毒、病毒株或隔離體或重組流感病毒的流感病毒蛋白(正義)或vRNA(反義)[參見《病毒學》第45及46章相關部分(Fields等編，Lippincott-Rawen出版社，費城，PA(1996))，在此特別引入作為參考]。可用任意啟動子來表達病毒蛋白，所得載體包括與特定流感病毒蛋白的DNA操縱性連接的啟動子。用於編碼vRNA的載體的啟動子優選包括但不限於RNA聚合酶I啟動子、RNA聚合酶II啟動子、RNA聚合酶III啟動子、T7啟動子及T3啟動子。在一實施方案中，RNA聚合酶I啟動子為人RNA聚合酶I啟動子。編碼vRNA的載體其轉錄終止序列優選包括但不限於RNA聚合酶I轉錄終止序列、RNA聚合酶II轉錄終止序列、RNA聚合酶III轉錄終止序列或核酶。因此，vRNA載體包括與流感病毒蛋白cDNA以相對於啟動子反義的方向操縱性連接的啟動子，所述cDNA與轉錄終止序列操縱性連接。為生成帶有本發明載體的重組病毒，可省略一些野生型vRNA載體和對一些編碼野生型病毒蛋白的載體加以代替。例如，對於含HA 3』和5』非編碼序列、5』HA導入序列以及與流感病毒蛋白編碼序列如VSV G蛋白編碼序列對應的異源核酸片段的vRNA載體來說，可以忽略HA的野生型vRNA載體。本發明的載體可以依次或同時導入一個細胞中。也提供了含多個上述所提到載體的組合物、與這些載體一個或多個相接觸的宿主細胞及病毒感染的細胞。
多個本發明的載體可物理連接，或各載體位於單個質粒或其它例如線性核酸輸送載體上。
用上述重組DNA分子增大的宿主細胞可用於製備具有感染性複製缺陷的流感病毒。例如，用編碼HA、NA、M1、M2及NS2的重組DNA分子穩定轉化的宿主細胞，可與多個載體接觸，即表達包含PA的vRNA、包含NP的vRNA、包含PB1的vRNA、包含PB2的vRNA和任選包含目標基因的vRNA的載體；以及編碼PA、PB1、PB2及NP的載體。
本文所述的病毒生產方法不需要輔助病毒的感染，在病毒突變性研究、疫苗(如用於AIDS、流感、B型肝炎、C型肝炎、鼻病毒感染、絲狀病毒感染、瘧疾、皰疹、以及口蹄疫的疫苗)和基因治療載體(如用於癌症、AIDS、腺苷脫氨酶、肌營養不良、鳥氨酸轉氨甲醯酶缺乏及中樞神經系統腫瘤)的生產中很有用。
這樣就提供了藥物治療(如疫苗治療或基因治療)中使用的重組病毒。例如，本發明提供了使個體對病原體如細菌、病毒、寄生蟲或惡性腫瘤產生免疫的方法。該方法包括將有效免疫個體的一定量本發明至少一種分離病毒施用於個體，任選與佐劑聯用。所述病毒包括含病原體所編碼多肽或腫瘤特異性多肽的vRNA。
本發明也提供了增大或促進內源性蛋白在哺乳動物中表達的方法，其中所述哺乳動物具有以該內源性蛋白含量下降或缺乏為特徵的適應症或疾病。該方法包括向哺乳動物施用可有效增大或促進內源性蛋白在哺乳動物中表達的一定量本發明重組病毒。哺乳動物優選人類。
本發明進一步提供了抑制流感病毒感染及/或複製的方法。該方法包括讓細胞與可有效抑制流感病毒感染及/或複製的一定量組合物接觸，其中包含於組合物中的分離核酸分子含有NA、M、HA、NS、NP、PB1、PB2、PA或其任意組合的流感病毒導入序列。細胞可以是未感染的細胞，也可以是流感病毒感染的細胞。導入序列可以對一種或多種類型NA或HA特異。在一實施方案中，細胞還進一步與M2通道抑制劑或唾液酸苷酶抑制劑接觸。
本發明也提供了鑑定可選擇性抑制或防止流感病毒導入病毒顆粒的試劑的方法。該方法包括讓流感病毒感染的細胞與試劑接觸，檢測或測定該試劑是否抑制諸如NA vRNA或重組NA vRNA之類的流感病毒RNA導入病毒顆粒中。也提供了通過此方法鑑定的試劑及其用途，如抑制或防止流感病毒複製。
附圖簡述

圖1.凝集素抗性細胞系的結合。對於每一細胞系，細胞與洋地黃毒甙標記的朝鮮槐(maakia amurensis)(MAA)或西洋接骨木(Sambucus)(SNA)凝集素一起孵育，再與異硫氰酸螢光素標記的抗洋地黃毒甙抗體一起孵育，然後用FACS分析。粗線為MAA凝集素的結合，細線為SNA凝集素的結合，陰影部分為陰性對照(不加凝集素)。
圖2.AL3(MaKS)-13及K4(MaKS)-13突變體的NA基因結構。(A)AL3(MaKS)-13包含一個936-核苷酸的缺失(第220個鹼基至1253個鹼基)，該缺失去除了NA基因的一大部分編碼區。該突變也將一個TAG終止密碼子帶入到缺失外兩個鹼基的框架中，使該基因僅編碼66個胺基酸的肽，該肽與NA的胞漿尾端、跨膜區、莖及頭部的一部分對應。(B)K4(MaKS)-13包含一個1066-核苷酸的缺失(第130個鹼基至1193個鹼基)，該缺失去除了NA基因的一大部分編碼區。該突變也將一個TAG終止密碼子帶入到缺失外四個鹼基的框架中，使該基因僅編碼38個胺基酸的肽，該肽與NA基因的胞漿尾端及跨膜區對應。
圖3.AM2AL3和K4親代病毒及AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13突變體的唾液酸酶活性。對於每一樣品來說，將一式兩份病毒(5×102PFU)在可產生螢光的唾液酸酶底物(4-甲基傘形酮基-α-D-N-乙醯神經氨酸)存在的條件下於37℃孵育1小時。用螢光儀(LabsystemsFluoroskan II)測定4-甲基傘形花內酯的螢光強度，激發波長為360nm，發射波長為460nm。
圖4A.野生型及NAFLAG載體的示意圖。
圖4B.NAFLAG病毒的生產方法示意圖。
圖4C.NAFLAGWT病毒或NA(-)病毒感染的MDCK細胞的免疫染色。細胞用抗-FLAG單克隆抗體(MAb)M2或抗-WSN多克隆抗體染色。
圖5.重組7片段流感病毒和NAFLAG病毒的競爭分析示意圖。
圖6A.NAFLAG及NAFLAGM(-)(「-ATG」)載體的示意圖。
圖6B.用NAFLAGM(-)病毒感染的MDCK細胞的免疫染色。細胞用抗-FLAG單克隆抗體M2或抗-WSN多克隆抗體染色。
圖7A.NAFLAG及NAFLAGM(-)感染細胞的FLAG序列原位雜交分析。
圖7B.NAFLAGWT病毒或NAFLAGM(-)病毒的複製效率。
圖8A.NA缺失病毒的示意圖。
圖8B.NA缺失病毒的包裝率。
圖9.含6、7或8個片段的流感病毒隨時間變化的病毒滴度。
圖10.顯示流感病毒片段(stipled)導入信號的示意圖。
圖11A.流感病毒的電子顯微鏡斷層攝影圖。
圖11B～F.用電子顯微鏡斷層攝影所發現的流感病毒顆粒彩色圖譜。
圖12.A)A型流感病毒及HA編碼序列用B型HA取代的A型流感病毒的病毒片段。B)A型流感病毒及HA編碼序列用B型HA取代的A型流感病毒的病毒顆粒。
圖13.A/B嵌合HA構建體圖。嵌合HA構建體如Neumann等(1999)所述在基於pPolI的質粒(pHH21)中於野生型A型/WSN病毒HA(pPolI-WSN-HA)和野生型B型/LEE病毒HA(pPolI-B-HA)之間生成。
圖14.A/B HA嵌合病毒的B型HA表達。用各病毒感染的MDCK細胞在感染後24小時固定，然後用抗-A/HA、抗-B/HA或抗-A/NP抗體免疫染色。
圖15.A/B HA嵌合病毒的生長性。用MOI為0.01 TCID50的各病毒感染MDCK細胞，然後監測病毒的生長。圖中所示為兩次獨立試驗相似結果中的一次結果。
圖16.接種A/B HA嵌合病毒的小鼠對B型病毒的抗體反應。A)鼻內接種各病毒(103TCID50)的小鼠(3隻小鼠/組)。接種3天後，從各鼠取鼻/氣管洗液和血清樣品用ELISA方法檢測抗B型病毒特異性IgA(鼻/氣管洗液)或IgG(血清)抗體。B)測定血清樣品中的HI滴度。每條柱代表用該嵌合病毒感染的小鼠個體。
圖17.突變HA vRNA及其病毒顆粒導入效率的示意圖。所有突變HA RNA均以與正義相反的方向表示。每個突變體包含旁側有終止密碼子、HA vRNA(黑色柱條)3』非編碼區33個核苷酸及5』非編碼區45個核苷酸的GFP開放閱讀框(插入到帶HA開放閱讀框的框架中)。這些突變體根據來源於HA編碼區的核苷酸數來命名。HA編碼區用灰色柱條表示。水平虛線表示缺失。區域的長度不按比例描繪。感染後16小時固定，將表達GFP的細胞數除以VLP-感染細胞中表達NP的細胞數，以此測定突變HA vRNA導入VLPs的導入效率。
圖18.用表達突變HA vRNA的質粒所感染的293T細胞中的vRNA水平。293T細胞用pPol IHA(0)GFP(0)或pPol IHA(9)GFP(80)及表達PA、PB1、PB2和NP的質粒感染。
圖19.VSVG(HA)GFP(NA)病毒感染的細胞表達VSV G和GFP。MDCK細胞用VSVG(HA)GFP(NA)病毒或WSN病毒感染，並用1.0％的瓊脂糖覆蓋。感染的細胞於37℃孵育48小時，將噬斑在正常光線下(A、B)及帶有限正常光的螢光下(C、D)拍照以鑑定噬斑。用溶於3％甲醛中的0.1％Triton-X100固定細胞並穿透。用抗-VSVG單克隆抗體(E、F)、抗-HA單克隆抗體(G、H)或抗-NP單克隆抗體(I、J)作為第一抗體和生物素化的第二抗體，使用Vectastain ABC試劑盒(Vector，Burlingame，CA)，進行免疫染色來檢測病毒蛋白。
圖20.VSG蛋白向VSVG(HA)GFP(NA)病毒的導入。濃縮的WNS、VSVG(HA)GFP(NA)和VSV病毒在樣本緩衝液中裂解。病毒蛋白用2-巰基乙醇處理，10％SDS-PAGE分離，轉到PVDF膜上，與抗-VSV G單克隆抗體或抗-WSN-HA-單克隆抗體一起孵育。左邊所示為標記蛋白的分子量。
圖21.VSVG(HA)GFP(NA)病毒在BHK、CHO及MDCK細胞中的生長曲線。BHK(A)、CHO(B)及MDCK(C)細胞用MOI為0.001的病毒感染。在感染後指定時間用MDCK細胞測定上清液中的病毒滴度。所示值為兩次試驗值的均值。
圖22.突變NS vRNA及其導入效率的示意圖。
圖23.突變M vRNA及其導入效率的示意圖。
圖24.病毒片段(A)及表達兩種異源蛋白的病毒顆粒(B)的示意圖。
圖25.病毒片段含有HIV gp160和gag兩種異源蛋白的流感病毒示意圖。
圖26.使用Cre/lox生產不可複製型病毒的示意圖。
發明詳述本文所用術語「分離的及/或純化的」指本發明的宿主細胞或病毒在體外製備、分離及/或純化，從而與體內物質無關聯，或從體外物質基本純化出來。本文所用「基本純化」意為目標物質佔主要部分(即按摩爾數算，它的豐度比組合物中的其它任意物質均高)，優選的基本純化組分為目標物質至少構成所有存在大分子物質的50％(按摩爾數算)的組合物。一般地，基本純化的組合物將包含組合物存中所有存在大分子物質的約50％、更優選約80％、甚至更優選約85％、90％、95％及99％。最優選的是，目標物質純化到基本同質(用常規檢測方法不能檢測到組合物中的汙染物質)。
本文所用術語「重組核酸」或「重組DNA序列或片段」指核酸如DNA等，已從原始材料進行衍生或分離，隨後可在體外進行化學改變，使其序列不是天然存在的，或與天然存在的序列一致但其位置與天然基因組中的位置不同。鑑定為有用片段DNA序列或從RNA逆轉錄而來然後以基本純化形式合成的DNA序列是「衍生」於原始材料的DNA實例。此類從原始材料「分離」的DNA實例之一是，將有用DNA序列用化學方法如使用限制性內切酶，從所述原始材料切下來、移走，以便利用基因工程方法進一步操作如擴增以便在本發明中使用。重組病毒從重組核酸製備。
本文使用的「異源」核酸片段、序列或分子意為片段、序列或分子所來源的原始材料與參照核酸片段、序列或分子的來源不同。例如，A型流感病毒片段或其中一部分對相應的B型流感病毒片段或其中一部分來說是異源的，一種流感病毒株或血清型的NA病毒片段對於不同株或血清型的NA病毒片段來說是異源的，非流感病毒核酸分子如HIVgap160對於流感病毒核酸分子來說是異源的。相反，同源核酸片段來源於與參照核酸片段來源相同的原始材料。因此，本發明的核酸分子是嵌合分子，它包括3』非編碼區、互為同源的至少一段導入序列及5′非編碼區。
短語「高效複製」在本發明的上下文中定義為在體外組織培養系統中產生很高的感染滴度，如104～1010PFU/ml、優選106～109PFU/ml。複製或疫苗生產中使用的流感病毒篩選，可使用本領域內任意已知及/或合適的測定方法進行測定。適合於篩選的測定方法(單用或任意聯用)包括但不限於，使用諸如反向遺傳學、重排、互補及/或感染的方法的病毒複製、滅活(如使用抗血清滅活)的定量及/或定性測定、轉錄、複製、翻譯、病毒顆粒導入、毒性、HA或NA活性、病毒產率及/或形態學。例如，病毒複製測定可用於篩選病毒的減毒或滅活。參見Krug，R.M.等，《流感病毒》，Plenum出版社，紐約，1989。
「唾液酸」指一族含9個或更多碳原子的氨基糖，如神經氨酸的N-及O-取代衍生物。
本文使用的「位點特異性重組」應包括下列三種事件1)旁側有位點特異性重組位點或序列如lox位點的目標DNA片段刪除；2)旁側有位點特異性重組位點或序列如lox位點的目標DNA片段的核酸序列反轉；和3)不同DNA分子上位點特異性重組位點或序列如lox位點旁邊的目標DNA片段發生相互交換。位點特異性重組酶系統包括但不限於，噬茵體P1的Cre/lox系統(No.5,658,772號美國專利)、酵母的FLP/FRT系統(Golic和lindquist，1989)、Mu的Gin重組酶(Maeser等，1991)、E.coli的Pin重組酶(Enomoto等，1983)及質粒pSR1的R/RS系統(Araki等，1992)。
可在本發明中使用的細胞系和流感病毒根據本發明，任何支持流感病毒高效複製的細胞均可在本發明中使用，包括作為流感病毒受體的一種或多種唾液酸表達水平減少或下降的突變細胞。此方法所得病毒可製備成重排體病毒。
優選的細胞是WHO鑑定的或可鑑定的可連續傳代細胞系。認證此類細胞系的需求包括系譜學、生長特性、免疫學標記、病毒易感性、致瘤性及儲存條件中至少一種特徵，以及動物、卵及細胞培養。這些特徵用於確認細胞不含可檢測的外來物。在一些國家中，還需要細胞核學。另外，優選在與疫苗生產所用細胞同代水平的細胞中檢驗致瘤性。在疫苗生成的滅活或減毒前，病毒優選用已表明可給出一致結果的方法進行純化(參見世界衛生組織，1982)。
優選完成所用細胞系的全部鑑定，以包括合適的終產品純度檢驗。可用於本發明中所用細胞鑑定的數據包括(a)其起源、衍生及傳代歷史的信息；(b)其生長及形態學特徵的信息；(c)外源性物質檢驗結果；(d)可在其它細胞系中清楚識別該細胞的明顯特性，如生化、免疫學及細胞遺傳模式；及(e)致瘤性檢驗結果。優選的是，所用宿主細胞的傳代水平或數量擴增儘可能低。
優選在疫苗或基因治療製劑製備前將細胞中產生的病毒高度純化。一般地，純化過程可以除去大量細胞DNA、其它細胞組分及外源性物質。使DNA廣泛降解或變性的方法也可使用。參見Mizrahi，1990。
疫苗本發明的疫苗可包含包括任意病原體糖蛋白在內免疫原性蛋白，如來自一種或多種細菌、病毒、酵母或真菌的免疫原性蛋白。因此，在一實施方案中，本發明的流感病毒可以是流感病毒或其它病毒性病原體的疫苗載體，這些病原體包括但不限於諸如HIV、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒的慢病毒，諸如CMV或HSV或口蹄疫病毒之類的皰疹病毒。
完全病毒顆粒疫苗用超濾法濃縮，然後用區帶離心或層析方法純化。病毒在純化前或純化後進行滅活，如用甲醛或β-丙內酯滅活。
亞單位疫苗包含純化的糖蛋白。此類疫苗可按如下所述製備用去汙劑處理片段化的病毒懸液，純化表面抗原，如利用超速離心。因而亞單位疫苗主要包含HA蛋白，也包含NA。所用去汙劑可以是陽離子去汙劑，如十六烷基三甲基溴化銨(Bachmeyer，1975)；陰離子去汙劑，如去氧膽酸胺(Laver Webster，1976；Webster等，1977)；或非離子去汙劑，如名為TRITON X100的商用去汙劑。病毒顆粒用諸如菠蘿蛋白酶的蛋白酶處理後，可將血凝素分離出來，然後加以純化，如用Grand及Skehel(1972)所述的方法純化。
片段疫苗包含已用可溶解脂質的試劑處理過的病毒顆粒。片段疫苗可按如下所述製備如上述所獲得的純化病毒水性懸液，不管其滅活與否，在振搖下用諸如乙醚或氯仿等與去汙劑相關的脂溶解劑處理。水相恢復成包含片段疫苗，主要由起始脂質外界已除去的血凝素及唾液酸酶、核心或其降解產物。如果殘留的感染性顆粒還未滅活，則將其滅活。
滅活的疫苗。
本發明的滅活流感病毒疫苗可用已知方法使複製後的病毒滅活而得以製備，這些方法包括但不限於用甲醛或β-丙內酯處理。可在本發明中使用的滅活疫苗類型可包括全病毒(WV)疫苗或亞病毒顆粒(SV)(片段)疫苗。WV疫苗包含完整、滅活的病毒；而SV疫苗包含純化病毒，該病毒用可溶解含脂病毒包膜的去汙劑破壞，然後將殘留病毒用化學方法滅活。
另外，可用的疫苗包括含分離HA及NA表面蛋白的疫苗，表面蛋白指表面抗原或亞單位疫苗。通常，對SV及表面抗原(即純化的HA或NA)疫苗的反應是類似的。含有流行病毒相關NA抗原及不相關HA的試驗性滅活WV疫苗似乎比常規疫苗的效率低(Ogra等，1977)。優選包含兩種表面抗原的滅活疫苗。
活的減毒病毒疫苗。
按照已知方法的步驟操作，活的減毒病毒疫苗也可用於預防或治療流感病毒感染。優選按照已知方法(參見Murphy，1993)，在一個步驟中將減毒的基因從減毒的供體病毒轉移到複製的分離體或重排病毒，從而實現減毒。由於對流感病毒A的抗性由對HA及NA糖蛋白的免疫反應發展所介導，編碼這些表面抗原的基因必須來源於這些重排病毒或高速生長的臨床分離體。減毒的基因來源於減毒的親代。在此方法中，負責減毒的基因優選不編碼HA及NA糖蛋白。否則，這些基因不能轉移到含重排體的臨床病毒分離體表面抗原。
已評價了許多供體病毒再現性地減毒流感病毒的能力。作為非限制性的實施例之一，A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2)耐寒(ca)的供體病毒可用於減毒疫苗的生產(參見Edwards，1994；Murphy，1993)。另外，可以將ca供體病毒與本發明的有毒複製病毒配對，從而生成活的減毒重排病毒疫苗。然後在H2N2抗血清存在的條件下於25℃(限制有毒病毒的複製)對重排體的子代進行選擇，所述抗血清抑制含減毒A/AA/6/60(H2N2)ca供體病毒表面抗原的病毒複製。
已在人類評價了大部分的H1N1及H3N2重排體系列，並發現它們滿足(a)具感染性；(b)對血清反應陰性兒童及免疫學刺激的成人發生減毒；(c)具免疫原性；及(d)遺傳穩定。Ca重排體的免疫原性與其複製水平平行。因此，通過新的野生型病毒獲得ca供體病毒的6個可轉移基因可以再現地使這些病毒減毒以用於易感成人及兒童的疫苗接種。
可利用定點突變將其它減毒突變導入流感病毒基因中以維持含這些突變基因的病毒。減毒突變可導入基因組的非編碼區和編碼區。此類減毒突變也可導入HA或NA之外的基因中，如PB2聚合酶基因(Subbarao等，1993)。這樣，新供體病毒生成時也可含有定點突變所導入的減毒突變，並且這些新的病毒可用於以與上述A/AA/6/60 ca供體病毒類同的方式還原活的減毒重排體H1N1和H3N2疫苗侯選者。類似地，其它已知及合適的減毒病毒可與本發明的流感病毒一起進行重排以獲得適合在哺乳動物疫苗接種中使用的減毒病毒(Ewami等，1990；Muster等，1991；Subbarao等，1993)。
優選的是這些減毒病毒維持來自於病毒的基因，所述基因編碼與原始臨床分離體基本類似的抗原決定簇。這是因為減毒疫苗的目標是提供與病毒原始分離體基本相同的抗原性，同時感染性減少到疫苗可導致在接種哺乳動物中誘導嚴重疾病狀態發生微小改變的程度。
這樣病毒可根據已知方法減毒或滅活，製成製劑作為疫苗施用以在動物如哺乳動物中誘導免疫反應。此類減毒或滅活疫苗是否保持了與臨床分離體或其衍生高速生長株類似的抗原性，其測定方法在本領域內眾所周知。這樣的方法包括使用抗血清或抗體清除表達供體病毒抗原決定簇的病毒；化學選擇(如金剛烷胺或rimantidine)；HA及NA的活性和抑制；以及DNA篩選(諸如探針雜交或PCR)來確認減毒病毒中不存在編碼抗原決定簇(如HA或NA基因)的供體基因。參見Robertson等，1988；Kilbourne等，1969；Aymard-Henry等，1985；Robertson等，1992。
藥用組合物本發明適合於接種、非腸道使用或口服的藥用組合物包含減毒或滅活的流感病毒，任選還包括無菌水性或非水性溶液、懸液及乳液。組合物還可進一步包含領域內已知的輔助劑或賦形劑，參見Berkow等，1987；Goodman等，1990；Avery的藥物治療，1987；Osol，1980；Katzung，1992。本發明的組合物通常以單劑(單位劑量)的形式提供。
常規疫苗通常包含約0.1～200μg、優選約10～15μg來自各株而進入其組合物的血凝素。構成本發明疫苗組合物的主要成分的疫苗可包含A型、B型或C型或是其任意組合，如三種類型中的至少兩種、不同亞型的至少兩種、相同類型的至少兩種、相同亞型的至少兩種，或不同的分離體或重排體。A型人類流感病毒包括H1N1、H2N2及H3N2亞型。
非腸道施用製品包括無菌水性或非水性溶液、懸液及/或乳液，它們可包含領域內已知的輔助試劑或賦形劑。非水性溶媒實例包括丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油之類的植物油及諸如油酸乙酯之類的可注射有機酯類。可用載體或密閉的敷料增強皮膚的滲透性和抗原吸收。口服的液體製劑通常可包括含該液體製劑的脂質體溶液。用於懸浮脂質體的合適形式包括乳液、懸液、溶液、糖漿及含純化水等本領域內常用惰性稀釋劑的酏劑。除了惰性稀釋劑外，此類組合物也可包括佐劑、潤溼劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、調味劑或加香劑。參見Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery’s等，1987；Osol等，1980；以及Katzung，1992。
當本發明的組合物用於個體施用時，它還可包括鹽、緩衝液、佐劑或其它增強組合物效能所需的物質。例如，可使用佐劑這種能擴大特異性免疫反應的物質。正常情況下，在施用給免疫系統前將佐劑和組合物混合，或分開施用但進入接種器官的同一部位。適合在疫苗組合物中使用的材料實例見Oso1(1980)。
疫苗中的異源性可以通過使諸如2～50株或其任意範圍內、任意數目的至少兩種流感病毒株的複製流感病毒混合而實現。優選含現代抗原組合物的A型或B型流感病毒株。根據本發明，可提供使用本領域內已知技術使流感病毒單株發生變異的疫苗。
根照本發明，藥用組合物還可進一步或另外包含一種化學治療化合物如用於基因治療的化合物、免疫抑制劑、抗炎劑或免疫增強劑；對於疫苗來說，化學治療劑包括但不限於γ-球蛋白、金剛烷胺、胍類、羥基苯並咪唑、α-幹擾素、β-幹擾素、γ-幹擾素、腫瘤壞死因子-α、縮氨基硫脲類、美替沙腙、利福平、利巴韋林、嘧啶類似物、嘌呤類似物、膦甲酸、膦醯基乙酸、阿昔洛韋、雙脫氧核苷、蛋白酶抑制劑或更昔洛韋。參見Katzung(1992)，及其在第798-800和680-681頁分別引用的文獻。
組合物也可包含可調但小量的無內毒素甲醛及防腐劑，它們均已知是安全的，並不會在組合物所施用的生物體內產生不需要的效應。
藥學目的施用組合物(或其所激發的抗血清)的目的可以是「預防性」的，也可以是「治療性的」。當預防性使用時，本發明組合物為疫苗，在病原體感染的任何症狀顯現前使用。本發明組合物的預防性施用可作預防或減弱隨後的感染用。當治療性使用時，減毒或來活的病毒疫苗在檢測到真正感染的症狀後施用。本發明組合物的治療性施用可用於減弱任何真正的感染。參見Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery，1987；以及Katzung，1992。
因此，本發明的減毒或滅活疫苗組合物可以在感染發生前使用(以便預防或減弱預期的感染)，也可在真正的感染啟動後使用。
類似的，對於基因治療來說，組合物可以在病症或疾病的任意症狀顯現出來之前使用，也可在檢測到一個或多個症狀後使用。
如果組合物可以為接受患者所耐受，則該組合為稱為「藥理學可接受」。如果所用量具有生理學上的意義，則稱「以治療有效量」施用。如果本發明組合物的存在可以使接受患者發生可檢測到的生理學變化，例如增強針對感染性流感病毒至少一株的初級或次級體液或細胞免疫反應，則可稱具有生理學意義。
所提供的「保護」不一定是絕對的，也就是說如果與對照人群或一組患者相比，獲得了令人滿意的改善，則流感感染不一定是完全預防或根除了。保護可能僅限於緩解流感病毒感染症狀的嚴重程度或發生速度。
藥學施用本發明的組合物通過被動免疫或主動免疫提供了對一種或多種病原體的抗性，如對一株或多株流感病毒株的抗性。主動免疫時，滅活或減毒活疫苗組合物預防性的施用於宿主(如哺乳動物)，而宿主對所施用疫苗的免疫反應保護宿主免受感染及/或發病。對於被動免疫來說，所激發的抗血清可以復原並施用於可能帶有由至少一種流感病毒株導致的感染的接受者。
在第二個實施方案中，疫苗施用於哺乳動物的雌性(妊娠或分娩之時或之前施用)，施用時間和劑量足以產生可同時保護雌性及其胎兒或嬰兒(通過抗體被動穿過胎盤或進入母親的奶中起作用)的免疫反應。
因此，本發明包括預防或改善病症或疾病，例如由至少一株病原體所致的感染的方法。正如本文所述，如果疫苗的施用可獲得疾病病情或症狀的完全或部分改善(即抑制)，或個體對該病的完全或部分免疫力，則說該疫苗可預防或緩解該疾病。
本發明的滅活或減毒流感病毒或其組合物至少有一種可利用前述藥用組合物通過可達到所需目的任意方法施用。
例如，可以通過各種非腸道途徑來施用這樣的組合物，如皮下、靜脈內、腹腹腔、肌內、腹膜內、鼻內、口腔或透皮途徑。非腸道施用可以是以一起注射或隨時間逐步推注。使用本發明藥用組合物的優選模式之一是在肌內或皮下應用。參見Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery，1987；以及Katzung，1992。
預防、抑制或治療流感病毒相關病狀的典型方案包括施用有效量的本文前述疫苗組合物，可單次施用治療，或在包括1周到約24個月或其中任意範圍或數值的一段時期內以增強或追加劑量重複施用。
按據本發明，「有效量」疫苗組合物是能獲得所需生物學效應的量。可以理解的是有效劑量依賴於年齡、性別、接受者的健康狀況和體重，如果有合併治療則也依賴於合併治療的種類及治療的頻率，還依賴於所需效應的本性。下面提供的有效劑量範圍不是想限制本發明，而是代表了優選的劑量範圍。但是，最優選的劑量依個體受試者而定，並為本領域內的熟練技術人員所清楚和可由其決定。參見Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery，1987；以及Katzung，1992。
哺乳類(如人)或禽類成年生物體的減毒病毒疫苗用量可以是約103～107噬斑形成單位(PFU)/kg，或是其中任意範圍或數值的量。滅活疫苗的劑量可以是約0.1～200μg血凝素蛋白，如50μg。但是用已有疫苗作為起點，常規方法測定所用量應當是安全和有效的量。
具免疫反應性的HA在複製病毒疫苗各劑量中的用量可以標準化為含有適當的含量，如1～50μg或其中任意範圍或數值，或是美國公共衛生部所推薦的用量，通常是不小於3歲的兒童每組分15μg，小於3歲的兒童每組分7.5μg。NA的量也可標準化，但是該糖蛋白在純化過程及儲存時不穩定(Kendal等，1980；kerr等，1975)。優選每0.5-ml量的疫苗包含約1-50億個病毒顆粒，更優選10億個顆粒。
本發明將在下面的非限限制性實施例作進一步的說明。
實施例1材料與方法病毒和細胞。從單個患者分離、位於含胚雞蛋(A/Tottori/AT1/AM2AL3/94；AM1AL3)或madin-darby犬腎內的人H3N2病毒，從T.ito(Tottori大學，Tottori，日本)獲得。病毒原種在10天齡含胚雞蛋(AMZAL3病毒)中培養，或在補充有0.3％牛血清白蛋白及0.5mg胰蛋白酶/ml的最小基本培養基(MEM)中的MDCK細胞(K4病毒)上培養。MDCK細胞在補充有5％新生牛血清(Sigma，St.Louis，MO)的MEM中培養。
凝集素抗性細胞系的產生。長至75％融合的MDCK細胞用磷酸鹽緩衝鹽水洗滌三次，與朝鮮槐(MMA)凝集素(100mg/ml，BoehringerMannheim)或西洋接骨木(SNA)凝集素(100mg/ml，BoehringerMannheim)一起在含0.3％牛血清白蛋白的MEM中孵育。孵育48小時後，培養基用生長培養基(MEM-5％胎牛血清)取代。凝集素選擇如上所述另外重複兩次。存活下來的細胞集落加以克隆，SNA及MAA選擇的細胞系分別指定為MDCK-Sn10和MDCK-Ma。
用螢光計HPLC方法測定唾液酸含量。按Suzuki等(1997)所述，用高效液相色譜以螢光計測定兩種細胞系和純化病毒中的唾液酸(N-乙醯神經氨酸[NeuAc]和N-糖基神經氨酸[NeuGc])含量。各樣品置於5-ml頂部磨砂玻璃瓶中，與100μl(25mM)硫酸混合。然後將瓶於60℃加熱12小時水解唾液-糖鏈。冷卻後，50μl水解物中加入50μl 1，2-二氨-4，5-亞甲二氧基苯，混合物避光於60℃加熱2.5小時以使唾液酸的螢光顯影。所得溶液取10μl等分液注入裝有樣品注射閥(模型7125，Reodyne)和螢光分光光度計(650-105，Hirachi，東京，日本)的880-PU高效液相色譜(JASCO，東京，日本)，該螢光分光光度計帶有20-μl流動池和記錄儀(Chromatopac C-RSA，Shionadzu，東京，日本)。螢光分光光度計設置成激發波長為373nm、發射波長為448nm。NeuAc(Sigma)和NeuGc(Sigma)的標準混合物(200pmol/μl)用於建立校正曲線。
使用螢光計的唾液酸酶活性測定。病毒唾液酸酶活性(5×105PFU)按Hara等(1987)所述，以2』-(4-甲基傘形酮基)-α-D-N-乙醯神經氨酸(Sigma)為底物進行測定。簡單地說，螢光底物用0.5M醋酸鈉(pH4.6)以1∶2稀釋後，加到等量樣品中，於37℃孵育30分鐘。用200ml 0.5M的Na2CO2(pH10.7)終止反應，於激發波長360nm和發射波長460nm孵化螢光。所有反應一式兩份實施。
NA及HA基因的序列分析。使用Qiappin vRNA純化試劑盒，按廠商(Qiagen，Inc.，Valencia，Calif.)說明從病毒樣品獲得總病毒RNA(vRNA)。生產cDNA時，使用與A型病毒基因片段3』端12個保守vRNA核苷酸互補的寡核苷酸Uni-12作為莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶(Promega，Madison，WI)反應的引物。NA基因cDNA用NA基因特異性引物 JN2-43 (5′cRNA 正義序列5』-TGGCTCGTTTCTCTCACTATTGCC-3』；SEQ ID NO1)、JN2-1410r(3′cRNA反義序列5』-TTATATAGGCATGAGATTGATGTTCCG-3』；SEQ ID NO2)和10U Pwo DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)進行30輪循環擴增。所得PCR產物亞克隆入載體pCR21(Inbitrogen，Carlsbad，Calif.)，在自動化螢光測序中使用。HA基因用HA基因特異性引物JH3-Up(5′cRNA正義引物序列AGCAAAAGCAGGGGATAATTCTATTAACCATGAAGAC-3』；SEQ ID NO3)和JH3-Down(3′cRNA反義引物序列5′-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAATTAATGCACTC-3』；SEQ ID NO4)以與NA基因類似的方式進行克隆。對於每一個分離體，檢驗三個克隆以獲得NA和HA的共有序列。
結果凝集素抗性細胞系的產生。為了產生細胞表面唾液酸表達水平下降的細胞系，使用了唾液酸結合特異性不同的凝集素SNA和MAA。與MAA結合的唾液酸通過α(2，3)鍵與半乳糖(Wang等，1988)，而與SNA結合的唾液酸通過α(2-6)鍵與半乳糖或N-乙醯半乳糖胺連接(Shibuya等，1987)。使用支持流感病毒生長的MDCK細胞作為凝集素選擇的親代細胞。當在其中任意一種凝集素存在的條件下導入時，大部分細胞在一周內死亡。然後讓抗性細胞克隆長出來作為原種培養物。MAA及SNA凝集素選擇所得到的細胞系分別指定為MDCK-Ma和MDCK-Sn10。
用洋地黃毒甙標記的MAA和SNA凝集素進行的螢光激活細胞分選(圖1A)證明正如以前所報導的那樣(Ito等，1997)，MDCK細胞與兩種凝集素的結合水平都很高。用α(2，6)鍵特異性凝集素選擇的MDCK-Sn10細胞，仍保持與α(2，3)特異性MAA凝集素的強烈結合，但對SNA凝集素的結合與親代MDCK親代相比變弱了。相比之下，用α(2，3)鍵特異性凝集素選擇的MDCK-Ma細胞，對兩種凝集素的結合均比MDCK細胞弱得多。
病毒在MDCK-Sn10和MDCK-Ma細胞系中的生長。為了獲悉流感病毒如何適應受體表達減少的細胞，使用兩種唾液酸受體鍵特異性已知的流感病毒變體(AM2AL3及K4)(Ito等，1997)。K4病毒特異性地識別通過α(2，6)鍵與半乳糖連接的NeuAc[NeuAcα(2，6)Gal]，而AM2AL3病毒特異性識別NeuAcα(2，3)Gal。兩種病毒在MDCK-Sn10細胞中的複製與在MDCK細胞中的複製一樣好(表1)。但是，兩種細胞在MDCK-Ma細胞中的滴度均比MDCK細胞中的滴度低1個log。同樣，其中任意一種病毒感染後，即使感染複數達到10也僅有一小部分MDCK-Ma細胞繼續長至融合且不發生細胞病變效應。當培養基用含可促進病毒生長的胰蛋白酶的培養基替換時，血細胞凝集測定不能檢測到這些存活細胞中的病毒生成。這些細胞的HA和NP蛋白免疫化學染色也呈陰性(數據未列出)，因而證明細胞未持續感染。存活的細胞指定為MaKS。
表1.流感病毒在凝集素抗性細胞系中的複製*
*用AM2AL3或K4和病毒一起感染細胞，並測定感染50％組織培養細胞所需要的劑量(TCID50)，以此測定各細胞系的敏感性。
SNA和MAA凝集素的FACS分析證明，MaKS細胞象其衍生來源的MDCK-Ma細胞一樣，與α(2，6)特異性SNA的結合比MDCK細胞弱得多(圖1B)。另外，MaKS細胞的MAA凝集素結合峰比MDCK-Ma細胞系的結合峰窄得多，並且缺失了代表更高MAA結合群的小肩峰(圖1)。
為了測定唾液酸含量減少是MaKS細胞凝集素結合減少的原因，用液相色譜分析對MaKS細胞中存在的唾液酸進行定量。儘管NeuGc的水平低得多，MaKS細胞的NeuAC和NeuGc水平(分別為8.2和0.4pmol/μg蛋白)比MDCK細胞中的水平(分別為216.0和2.5pmol/μg蛋白)低得多。這些數據說明MaKS細胞中唾液酸受體決定簇大量減少。
病毒在MaKS細胞中的適應。為測定AM2AL3及K4病毒如何在病毒表達水平非常低的細胞中繁殖並適應生長，兩種病毒先後在液體培養中的MaKS細胞內傳代。由於兩種病毒在MaKs細胞中的複製均比在MDCK細胞中的複製弱得多(表2)，第1至3代不稀釋，第4至13代按1∶1,000稀釋。第8代後，任意一種變體所產生的噬斑直徑由大(超過3mm)變小(約1mm)。到了10代或更高的代數，用MDCK細胞測定的病毒只呈現更小的噬斑(數據未列出)。經過連續的13代後，兩種病毒均能在MaKS細胞中生長得與在MDCK細胞中一樣或長得更好(表2)。13代後由任一變種產生的病毒原種進行擴增，並分別指定為AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13。
表2.適應於在凝集素選擇細胞中生長的病毒的複製*
*用AM2AL3(在卵中生長)、K4(在MDCK細胞中生長)、AL3(MaKS)-13或K4(MaKS)-13原種病毒感染的細胞，測定感染50％組織培養細胞所需要的劑量(TCID50)，以此測定各細胞系的敏感性。注意適應於MaKS細胞中生長的兩種病毒在這些細胞中生長情況與MDCK細胞中一樣良好(AL3(MaKS)-13)或更好(K4(MaKS)-13)，而起始病毒在MDCK中生長得更好一些。
AL3(MaKS)-13如K4(MaKS)-13病毒HA及NA基因的突變分析。為測定病毒適應以受體濃度降低為特徵的細胞環境，將AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13病毒的HA基因逆轉錄，用PCR擴增cDNA，對所得產物測序。與兩親代病毒的相應HA基因相比，兩種病毒的基因均不含突變。
由於NA唾液酸酶活性很可能影響HA受體結合活性，因而測定了AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13病毒的NA序列。兩種變體的NA基因序列分析均表明內部有一大片缺失(圖2)。AL3(MaKS)-13內，缺失從第220個核苷酸延伸到第1253個核苷酸，使一個閱讀框發生移支，從而在緊接該缺失後產生了一個終止密碼子。此NA的編碼容量為66個胺基酸，與NA的胞漿尾端、跨膜區、莖及頭部的一部分對應。類似地，K4(MaKS)-13分離體在NA基因中從第130個鹼基到1193個鹼基發生，在第39個密碼子處引入了一個終止密碼子。和AL3(MaKS)-13一樣，該基因不再編碼完整的催化頭部區。因而，在受體表達水平下降的細胞中傳代的病毒已喪失其NA催化活性。
為了確認此結果，用螢光唾液酸酶底物[2』-(4-甲基傘形酮基)-α-D-N-乙醯神經氨酸]分析了AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13變體的唾液酸酶活性。與親代病毒不同，兩個NA缺失突變體均未檢測到唾液酸酶活性(圖3)。
病毒糖蛋白的唾液酸化程度。正常感染時，唾液酸酶活性下降的病毒不能在細胞表達有效生長和聚集(Palese等，1974；Shibata等，1993)。那麼，為什麼缺乏唾液酸酶活性的AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13病毒可以在MaKS細胞中生長呢？一種可能的解釋是由於這些細胞的唾液酸含量低，HA及NA寡糖的唾液酸化程度也低，阻止了病毒在感染細胞表面上的聚集，即使無病毒唾液酸酶活性時也如此。為了檢驗此假設，對在MDCK細胞中生長的AM2AL3及K4病毒和MaKS細胞中生長的AL3(MaKS)-13病毒作了純化病毒製品的唾液酸含量比較。雖然AM2AL3病毒的唾液酸含量(0.9pmol NeuAc/g蛋白)比其它兩種的含量(A/Tottori/872/K4/94，3.8pmol NeuAc/g蛋白；AL3(MaKS)-13，2.6pmol NeuAc/g蛋白)要低，三種病毒樣品中的NeuAc含量類似。
因此，缺乏唾液酸酶活性的病毒可在唾液酸水平下降的細胞中高效生長，因為與正常細胞系相比，病毒蛋白並沒有廣泛地唾液酸化及與HA結合，而這些會阻止病毒的聚集。
討論以前的研究裡，A型流感病毒在有外源細茵唾液酸酶活性及病毒NA抗體存在的條件下傳代導致病毒NA基因缺失(Liu等，1993；Liu等，1995；Yang等，1997)。而且，作為該分子對唾液酸殘基親和力下降的HA蛋白的補償性突變結果，如此傳代所得NA突變體可在缺乏外源唾液酸酶活性的細胞培養物、及卵和小鼠中生長(Hughes等，2000)。正如本文所述，A型流感病毒可適應於在因NA基因大量缺失受體表達極度下降的細胞中生長，其中NA基因大量缺失使其唾液酸酶活性喪失。儘管病毒受體的減少理論上會影響結合受體的HA蛋白，只有NA基因發生了改變。
該結果的分子基礎是什麼呢？在正常的細胞環境中，唾液酸受體豐度很高，NA活性的缺失可以通過減少唾液酸對病毒HA的親和力來補償，可以使子代有效地從宿主細胞釋放出來，防止病毒顆粒聚集(Hughes等，2000)。當病毒受體不夠高時，如我們的MaKS細胞，HA親和力下降並不為病毒子代釋放及NA缺失突變體生長所必需。實際上，對於在病毒受表達水平下降細胞中的病毒複製來說，必須維持HA蛋白的高親和力結合。但是唾液酸酶活性對於在此類環境中病毒顆粒的釋放和防止病毒顆粒聚集來說不是必需的，因為細胞表面分子的唾液酸含量非常低，NA缺失的病毒顆粒其唾液酸含量與野生型病毒顆粒類似。實際上，對於病毒生長來說唾液酸酶活性很可能是有害的，因為它進一步從細胞表面去除了受體決定簇唾液酸。最近，發現缺失NA莖從而不能在卵中生長的A型流感病毒通過非同源RNA-RNA重組獲得了多至22個胺基酸的莖插入(Mitnau等，2000)。概括起來，這些結果表明流感病毒可通過進行包括大量插入及缺失在內的根本遺傳學改變來適應於新的宿主環境。
本研究及以前的研究(Hughes等，2000；Liu等，1993)均發現病毒通過NA基因片段中的缺失而喪失其唾液酸酶活性，其中剩下的片段編碼胞漿尾和跨膜區。因此，這些突變體中的NA基因保守區域可能對於諸如病毒形態形成和穩定來說是必須的。
MaKS細胞的唾液酸含量比其親代(MDCK)細胞低。儘管也從CHO細胞生成了類似的細胞系(Ray等，1991)，但不能證明可在流感病毒研究中使用，因為它們不能有效的支持流感病毒。相反，MaKS細胞來源於流感病毒研究中的標準細胞系MDCK細胞，應該可以在基於病毒受體的分析中使用。例如，由於外源性添加的神經節苷酯可以合到宿主細胞膜中(Cafroll等，1985)，因而可以將一種已知的神經節苷酯與MaKS一起孵育，並檢驗其作為病毒受體的能力。
在上個世紀，當新興病毒的HA或HA及NA基因兩者引入人類時，三種A型流感病毒流行開來。不同宿主動物來源的病毒對照研究表明，這些流行的病毒株中NA基因引入了突變(Bean等，1992)。病毒突破宿主種屬障礙是否需要NA中發生類似的突變尚不清楚，但是來源於一種禽類病毒的人類病毒N2 NA其底物特異性在人類的複製過程中逐漸發生改變(Baum等，1991)。上述結果說明NA突變確實能有助於A型流感病毒適應於新的環境。例如，人類病毒NA和鴨病毒其餘基因的重排體病毒不能在鴨子中複製(Hinshaw等，1983)，即使人類病毒的NA來源於禽類病毒也是如此(Scholtissek等，1978)。說明NA基因在適應人類的過程中很可能發生了突變。不同動物來源的病毒NA對照研究，和最近發展出來的基於質粒的反向遺傳學(Fodor等，1999；Neumann等，1999)一起，可能且助於深入理解這些表面糖蛋白有助於流感病毒適應自然中的變化。
實施例2材料與方法細胞。293T人胚腎細胞於補充有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s培養基中培養，Madindarby犬腎(MDCK)細胞於補充有5％新生牛血清的Eagle’s培養基中培養。
基於質粒的反向遺傳學。按Neumann等(1999)所述，用含受RNA聚合酶I啟動子和終止子控制的A/WSN/33(H1N1)病毒基因cNDA的質粒(稱為Pol1質粒)和表達流感病毒蛋白的pCAGGS/MCS質粒生成A型流感病毒(圖4)。簡單地說，Pol1質粒及蛋白表達質粒和感染試劑Trans ITLT-1(Panvera，Madison，WI)混合後，於室溫孵育10分鐘，加到Opti-MEM(GIBCO/BRL)培養的1×106個293T細胞中。轉染48小時後，培養基中加入0.5μg/ml胰蛋白酶的以激活HA蛋白，於37℃孵育1小時。收集上清。
質粒。NAFLAG基因含NA cRNA的5』非編碼區；與胞漿尾(6個胺基酸)、跨膜區(29個胺基酸)和莖區(16個胺基酸)對應的51個NA密碼子(圖4A)；FLAG表位(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；SEQ ID5)；兩個相連的終止密碼子(TAA TAG；SEQ ID NO6)；以及NA cRNA 3』端序列的185個鹼基。該長度的3』端序列是截短NA片段中發現的最短片段(Yang等，1997)。用PCR將pT7Blue-NA中WSN基因的第173至1070(正義鏈中)個核苷酸缺失、並插入FLAG序列、兩個終止密碼子和一個StuI位點，生成可產生反義NAFLAG RNA的pPol1-NAFLAGWT。用StuI消化此片段，使之自我連接。用BsmBI將NAFLAG切下來，插到pHH21的BsmBI位點內。
用於NAFLAGM(-)生產的pPOl1-NAFLAGM(-)缺乏NA蛋白的起始密碼子。用體外定點突變系統(GeneEditor，Promega)將截短NAFLAG蛋白的ATG起始密碼子變成GCG，來實現此目標。
通過反向PCR將pT7Blue-NA中WSN基因的第203至1109(正義鏈中)個核苷酸用BglII位點取代，生成pPOl1-(183)GFP(157)，它生成的RNA含NA vRNA 3』末端非編碼區及編碼帶61個NA N-端密碼子的融合蛋白的互補序列，以及NA vRNA 5』末端的185個鹼基，其中融合蛋白為增強螢光蛋白(eGFP，Clontech)。eGFP基因克隆入此BglII位點和位於NA蛋白框中1226位處(野生型NA基因中)的StuI位點。然後將NA-(183)GFP(157)基因插入pHH21的BsmBI位點。
用含BbsI位點的寡核苷酸引物通過PCR生成NA(0)GFP(0)基因，它含NA vRNA 3』末端非編碼區、eGFP的互補編碼序列及NA vRNA 5』非編碼區。此PCR片段用BbsI消化並插入這HH21的BsmBI位點中以便將質粒引入細胞時，可以合成負鏈方向中含旁側有5』及3』NA vRNA區非編碼區的eGFP編碼序列的RNA。
通過PCR突變生成一系列缺失突變體。NA-eGFP融合蛋白的缺失突變體從pT7Blue載體中的NA-(183)GFP(157)基因製備。通過PCR突變生成NA-(183)GFP(0)基因，它缺失了NA-(183)GFP(157)的NA編碼區的整個3』端(正義)。該突變體含5』非編碼區(正義)、NA序列的61個胺基酸、eGFP基因、兩個終止密碼子及3』非編碼區。NA-(90)GFP(0)、NA-(45)GFP(0)、NA-(21)GFP(0)和NA-(18)GFP(0)等PCR突變體分別包含NA-(180)GFP(0)NA編碼區的30、15、7或6個N-末端胺基酸缺失。
用與NA(61)GFP基因相同的方式製備NA0G185基因，它含NA基因(正義)的5』非編碼區、eGFP基因、兩個終止密碼子及3』非編碼區的185個核苷酸。此突變體具有NA vRNA的5』非編碼區(28個苷酸)和NA vRNA 5』編碼區的157個核苷酸。NA-(183)GFP(78)和NA-(183)GFP(39)突變體是NA0G185的缺失突變體，分別象NA0G185那樣具有NA 5』編碼區的一半或四分之一。
免疫染色。為了檢測粘附到截短NA蛋白上的FLAG表位，用含該表位的病毒感染MDCK細胞，並用含0.5μg胰蛋白酶/ml及100μU/ml霍亂弧茵唾液酸酶(GIBCO/BRL)的0.6％瓊脂糖覆蓋。感染的細胞用3％甲醛溶液固定。然後以抗-FLAG單克隆抗體M2(Sigma)為第一抗體並以生物素化的抗小鼠IgG為第二抗體，用Vectastain ABC試劑盒(Vector，Burlingame，CA)檢測FLAG表位。為了鑑定WSN病毒感染的細胞，用兔抗WSN血清作為第一抗體。
原位雜交。用洋地黃毒甙(DIG)標記的探針與感染細胞雜交，並根據製造商的說明用DIG核酸檢測試劑盒(Roche)染色。與編碼FLAG表位核苷酸序列互補的寡核苷酸(100pmol)(GAC TAC AAG GAC GAC GATGAC AAG；SEQ ID NO7)用DIG寡核苷酸加尾試劑盒(Roche)於37℃標記6小時。病毒感染的細胞用3％甲醛溶液固定，用溶於3％甲醛中的0.1％Triton-X100穿透，在預雜交緩衝液(5X SSC，檢測試劑盒中的1％封閉試劑，1％N-十二烷基肌氨酸，含0.1mg/ml檢測試劑盒的多聚(A)-DNA的0.02％十二烷基硫酸鈉[SDS])中於65℃預雜交30分鐘。預雜交緩衝液中加入寡核苷酸探針(10pmol)，於55℃雜交1小時。雜交的細胞用洗滌液(0.1M馬來酸，0.15M NaCl，0.3％吐溫20，pH7.5)洗滌5分鐘，用1％封閉試劑於室溫封閉30分鐘，與偶聯有鹼性磷酸酶的抗-DIG抗體(1∶5000)於室溫孵育30分鐘。然後用洗滌緩衝液洗滌細胞，與檢測緩衝液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5)的氯化氮藍四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT/BCIP)中於室溫避光孵育3小時。
競爭傳代。NAFLAGWT或NAFLAGM(-)病毒(300噬斑形成單位[PFU])與3×104PFU NA(-)病毒混合，用於感染亞融合的MDCK細胞(感染複數為0.01)，並在含0.5μg胰蛋白酶/ml及100μU/ml霍亂弧茵唾液酸酶的培養基中孵育72小時。用收穫的病毒感染MDCK細胞。此過程重複5次。
結果。
缺乏NA基因片段的A型流感病毒可以存活。反覆傳代後截短NA基因得以保留下來說明其對於病毒複製的重要性。為了生成沒有NA RNA片段的突變A型流感病毒，用生產除NA vRNA外vRNA和表達九種結構蛋白的質粒轉染293T細胞。當293T細胞培養上清與MDCK細胞在霍亂病毒唾液酸酶存在的條件下一起孵育時，觀測到了噬斑(直徑為189±15.6μm)。在液體培養物中，該病毒(指定為NA(-))長到了105PFU/ml。因而，只有7個vRNA片段的A型流感病毒可以存活。
截短NA片段對於病毒高效生長是必需的。為了理解反覆傳代後NA基因穩定維持的分子基礎，將含截短NA基因的病毒生長情況與缺乏NA基因起始密碼子、編碼NA(-病毒)的病毒生長情況作對比。用反向遺傳學生成NAFLAGWT突變病毒。NAFLAGWT所含的NA基因內部有缺失及與截短NA融合的FLAG表位序列。NAFLAGWT生長至105PFU/ml，並在細菌唾液酸酶存在的條件下生成了噬斑。噬斑用抗-FLAG單克隆抗體或抗-WSN多克隆抗體進行免疫染色(圖4C)。NA(-)或NAFLAGWT病毒生成的噬斑用抗-WSN抗體染色，僅對後者產生的噬斑用抗-FLAG抗體染色。
為了測定複製能力的差別，NA(-)和NAFLAGWT病毒以100∶1的比例混合，將此混合物與MDCK細胞一起孵育(圖5)。感染48小時後，取上清用於生成噬斑，噬斑用抗-FLAG單克隆抗體免疫染色。計算總噬斑中FLAG-陽性噬斑的百分比，以此測定含截短NA片段的病毒的發生率。該過程重複4次以上。如圖7B所示，群體中FLAG陽性噬斑在傳代的過程中逐漸增加，到第5代時幾乎達到90％。此結果說明，含8個片段的病毒(即使該截短的NA基因不編碼功能性唾液酸酶)比含7個片段的病毒生長得更好。
病毒RNA對於病毒高效生長來說是重要的。為了測定截短的NA蛋白或病毒RNA對於病毒高效複製是否重要，構建了缺乏NA起始密碼子及框中另一ATG密碼(第15個密碼子)的NAFLAGM(-)基因(圖6A)。用抗-FLAG抗體未能檢測到NAFLAGM(-)病毒生成的噬斑(圖6B)，表明蛋白未翻譯出來。為了確保NAFLAGM(-)病毒具有NAFLAGM(-)基因，對該病毒生成的噬斑用FLAG特異性探針進行原位雜交。這些噬斑與探針發生反應，確認此病毒中NAFLAGM(-)基因的存在。然後將此病毒的複製能力與上述7片段病毒相比。用FLAG序列特異性探針標記的噬斑百分率逐步上升(圖7B)，到第5代時接近80％的噬斑變成FLAG序列陽性(圖7A)。如缺乏抗-FLAG抗體免疫染色的噬斑所證明，傳代過程中未發現表達截短NA蛋白的回覆突變體。因此，儘管由於混合感染物中NAFLAGM(-)變得佔統治地位時病毒複製速率低於NAFLGWT的複製速率，因而NA蛋白可能在高效病毒有效複製中起一定作用，但是病毒RNA本身可能在高效病毒複製中起重要作用。
病毒NA vRNA包裝信號延伸入編碼區。CK2-29及E17E病毒即使在廣泛的傳代後，截短NA基因仍得以保留下來，表明NA RNA片段的編碼區中有vRNA導入到病毒中的信號(即包裝信號)存在。為了檢驗此假設，將編碼eGFP的序列插入截短NA基因閱讀框內NA序列缺失的位置。將此重組基因指定為NA-(183)GFP(157)，它具有NA vRNA的3』非編碼區和NA編碼區的N-末端61個密碼子、eGFP編碼區及NA vRNA5』末端的185個核苷酸。製備用NA-(183)GFP(157)基因取代相應野生型NA基因的病毒，進行噬斑測定(圖8A)。超過90％的噬斑表達eGFP，表明NA-(183)GFP(157)基因導入了病毒顆粒並在病毒的複製過程中得以保留下來(圖8B)。考慮到旁側有NS非編碼區序列CAT基因未能保持留到超過5代以上(Luytjes等，1989)，該結果是引人注目的。
既然NA-(183)GFP(157)和CAT構建體之間的差異表現在病毒編碼序列，構建了與CAT構建體類似的基因NA(0)GFP(0)，它包含旁側有3』及5』NA非編碼區的eGFP編碼序列。此構建體缺失NA編碼區。儘管用此基因生成的病毒可以生成噬斑，只有一小部分(0.1％)噬斑有一兩個表達eGFP的細胞，表明NA(0)GFP(0)基因未能在病毒複製過程中得以保留下來。用質粒感染的293T細胞，包括一個表達生產病毒所用NA(0)GFP(0)基因的質粒所感染的293T細胞，其eGFP的表達程度低於表達NA(61)GFP的質粒所感染病毒的表達水平。用於NA(0)GFP(0)的PolI質粒量增加了10倍，結果使表達eGFP的293T細胞數與用NA(0)GFP(0)的polI質粒所轉染的細胞數類似。即使用於NA(61)GFP的PolI質粒用量高出10倍，NA(0)GFP(0)病毒生成的噬斑僅有1％包含eGFP陽性細胞，而且這些噬斑中的細胞只有少量表達eGFP。這些結果表明，病毒NA RNA的包裝信號延伸到了NA編碼區內。
RNA片段在高效病毒生產中的作用。為了理解為什麼8片段RNA病毒比7片段RNA病毒長得好，對具有6、7或8個病毒RNA片段的病毒作了感染性病毒顆粒生產的比較(圖9)。為了生成8片段病毒，用正常病毒生產的所有9個片段結構蛋白的蛋白表達質粒和8種PolI質粒轉染293T細胞。同時也使用具有兩突變使NS2不能生成的NS PolI質粒，這樣從293T細胞生成的病毒不會進行多次複製循環。另外，分別使用具有使HA及NA蛋白不能生成的突變的HA和NA PolI質粒，以便基因片段的消除僅限於RNA片段，而不是基因產物。對於7片段病毒的生產，不包括NA基因的PolI基因，但包括一個表達NA蛋白的質粒。為製備6片段病毒，不用HA及NA RNA的質粒，但包括HA及NA蛋白表達質粒。
為了比較三種病毒的病毒顆粒產量，用這些病毒感染MDCK細胞，在感染後48小時用抗WSN抗體對感染的細胞進行免疫染色，從而滴定從質粒轉染細胞生成的感染性病毒顆粒數量。如圖9所示，感染性病毒顆粒生產的效率與病毒RNA片段的數量成正相關病毒RNA片段越多，病毒顆粒的生產越好。這些結果表明病毒RNA片段在高效病毒顆粒生產中起一定作用。
Na vRNA的3』末端對於其包裝入病毒顆粒內很重要。縮小NA vRNA中包裝信號的範圍，製備了截短NA基因的3』或5』(vRNA正義)編碼區中有進一步缺失的病毒(圖8A)。由缺乏NA編碼區5』末端的NA-(183)GFP(0)病毒生成的噬斑約有40％表達eGFP，而由缺乏NA編碼區3』末端的NA0G185病毒生成的噬斑僅有1.8％表達eGFP。這些數據表明NA vRNA的3』末端對於其包裝入病毒顆粒內很重要(圖8)。
討論通過製備缺失構建體，測定了使NA片段導入病毒顆粒的NA編碼區。發現編碼區的兩端均很重要，但與NA編碼區5』末端相對應的vRNA3』末端比另一端更為重要。對於NS片段來說，與NS編碼區5』末端相對應的vRNA 3』末端看起來比另一端更為重要(圖22)。相比之下，對於HA、M及NP片段來說，兩端均很重要，而對於PB2來說，與PB2編碼區3』末端相對應的vRNA 5』末端更重要。這些結果說明，對於vRNA片段導入來說重要的序列位於編碼區內，並且對於每一片段來說是唯一的。那些區域有可能通過鹼基配對與其它病毒RNA相互作用，導致一組8個vRNA片段重新進入病毒顆粒。由於vRNA和病毒組分之間的相互作用是病毒特異性的，這樣的相互作用可以成為抗病毒化合物研發的靶點。
實施例3為了獲得病毒內含物的真實形象，進行了電子顯微鏡斷層攝影(圖11A)。採集了厚度為50nm的病毒顆粒的圖象。然後，對這些病毒顆粒中的一個進行分析，重構病毒顆粒內含物的3D圖象。顆粒內的結構(杆)進行著色，以區分各結構(圖11B～F，顯示頂視圖、側視圖及仰視圖)。杆的大部分視圖為橫截面，但是在杆從中間橫截的視圖中，顯示了整個分子。不過，所有視圖均顯示了杆之間的相互作用。
基於上述概要結果，以及支持每一病毒片段包含一段對於導入病毒顆粒內來說很重要的唯一序列的數據，該序列可能有助於病毒內含物獨特形態學特性的形成，vRNA片段很可能選擇性地導入流感病毒顆粒中。此信息不僅對鑑定研發抗病毒化合物有用，而且對製備減毒活疫苗也很有用，因為破壞病毒特異性相互作用可以抑制病毒複製並使之減毒。
實施例4材料與方法細胞。293T人胚腎細胞和COS-7細胞於補充有10％胎牛血清(FCS)和抗生素的Dulbecco’s改良Eagle’s最基本培養基(DMEM)中培養。Madindarby犬腎(MDCK)細胞於補充有5％新生牛血清和抗生素的MEM中培養。細胞在5％CO2中於37℃培養。
質粒的構建。Neumann等(1999)描述了如何生成含野生型A/WSN/33(H1N1)HA基因(命名為pPolI-WSN-HA)和野生型B/Lee/40HA基因(pPolI-B-HA)、用於病毒RNA生產的質粒構建體，其中兩者的HA基因旁側有人RNA聚合酶I啟動子及小鼠RNA聚合酶I終止子。使用引物及ProofStart聚合酶(QiaGEN)經過PCR擴增生成一系列的A/B嵌合HA pPolI構建體，然後用野生型HA構建體進行連接(圖13)。所有構建體均進行測序，確保未包含不需要的突變。
細胞培養中所表達HA的生物測定。用Trans IT試劑(Mirus)將各A/B嵌合HA pPolI構建體(1μg)和其它四種基於pCAGGS的質粒(各1μg)一起轉染入COS-7細胞，其中基於pCAGGS的質粒表達三種聚合酶亞基(PA、PB1和PB2)和A/WSN病毒的核蛋白(NP)(Neumann等，1991)。轉染後48小時，細胞用霍亂弧茵唾液酸酶(10U/ml)和TPCK-胰蛋白酶(2.5μg/ml)於37℃處理30分鐘。然後細胞用4％多聚甲醛固定，並用抗-B/HA抗體和商用ABC檢測試劑盒(Vector實驗室)進行免疫染色。同樣，進行血細胞吸附測定來評估各HA的受體結合性質。簡單地說，轉染細胞在磷酸鹽緩液中的1％雞紅細胞懸液內於室溫孵育30分鐘，觀察前洗滌5次。另外，進行融合測定。簡單地說，轉染細胞在HEPES緩衝液(pH5.0)中於37℃孵育5分鐘，然後在培養基中孵育7小時。用冰甲醇固定後，融合細胞如上所述進行免疫染色。
反向遺傳學。按Neumann等(1999)所述用基於質粒的A/WSN或Blee反向遺傳系統生成病毒。帶來自於質粒的野生型基因型的病毒分別指定為A/WSN-R或B/Lee-R，用作對比的對照。為了生成A/B嵌合病毒，用嵌合HA PolI構建體取代了pPolI-WSN-HA。從293T細胞生成的病毒進行一次有限稀釋，實施生物克隆，在MDCK細胞中生成原種病毒。
實驗性感染。為了測定病毒的病原性，四周齡的雌性BALB/c小鼠經七氟烷麻醉後，用A/B嵌合病毒或野生型病毒(105TCID50/50μl)進行鼻內感染。監測感染後14天的死亡率及體重。感染三天後，一些感染的小鼠處以無痛處死，測定器官中的病毒滴度。
為了評價各嵌合病毒對野生型病毒攻擊的疫苗效力，小鼠用嵌合病毒或野生型病毒(103TCID50/50μl)進行鼻內感染。三周後，一組小鼠處以無痛處死，獲取血清及氣管-鼻洗液，檢測病毒特異性的IgA或IgG抗體。感染4周後，乘餘的小鼠在麻醉狀態下用50倍LD50的野生型病毒(B/Lee-R)攻擊，監測14天內的死亡率及體重。
病毒特異性抗體的檢測。用Kida等(1982)所述酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢驗血清及氣管-鼻洗液中的IgA或IgG抗體。血清樣品用受體破壞酶(REDIIDenka Seken)處理後也檢驗了HI抗體。
結果A/B嵌合HA基因的構建。為了測定B型HA與A型病毒組分的兼容性，在A/WSN和B/Lee HA基因之間構建了一系列嵌合基因(圖14)。由於RNA片段兩個末端的非編碼區很可能可以在A型病毒和B型病毒之間互相交換，以進行RNA轉錄和複製(Crescenzo-Chaigne等，1999；Desselberger等，1980；Mster等，1981)，製備了含A型病毒非編碼區及B型病毒完整編碼區的嵌合HA基因(圖14A，ANBH)。此構建體將產生完整的B型HA蛋白。然後製備B型病毒HA編碼區及非編碼區換成A型病毒相應部分的嵌合基因(ANSBH)。此構建體經細胞信號肽酶除去A型信號肽後也會產生完整的B型HA。類似的，製備編碼B型HA跨膜區及胞漿區的序列換成A型的嵌合基因(ANTBH)，從而編碼A/B嵌合HA蛋白。製備編碼B型HA信號、跨膜區及胞漿區的序列均換成A型的嵌合基因(ANSTBH)。此構建體在切去信號肽後也會產生與ANTBH相同的嵌合HA蛋白。另外，製備HA編碼區切割位點上遊所有相應序列來自於B型病毒、下遊序列來自A型病毒的嵌合體(ANBW)。此構建體將會產生包含B型病毒HA1區和A型病毒HA2區的嵌合HA蛋白。最後製備ANBW構建體中信號序列從B型換成A型的嵌合基因，也可以產生與ANBW一樣的嵌合HA蛋白。
細胞培養中所表達A/B嵌合Ha的生物學性質。為了評價嵌合HA的功能性，將每一pPolI構建體與表達野生型PA、PB1、PB2及NP的質粒一起轉染入COS-7細胞中。這些嵌合HA構建體均可在細胞表面表達。為了檢驗這些HA的受體結合活性，進行血細胞吸附測定。測定前，轉染的細胞用細菌唾液酸酶處理以除去HA寡糖側鏈中的末端唾液酸，因為這些唾液酸會干擾受體結合活性(Luo等，1999)。表達ANBH、ANSBH、ANTBH及ANSTBH的細胞發生了血細胞吸附，而表達另外兩種(ANBW和ANSBW)的細胞未發生血細胞吸附(表3)。類似的，前面的HA誘導細胞融合，而後者不會。這些結果表明，前面的HA嵌合體具有生物學功能，而後面兩相沒有，可能是結構改變所致。與以前報導所預期的一樣，A型聚合酶複合物和NP從完整的野生型B型HA片段生成了功能性B型HA(表3)，確證了B型啟動子結構與A型聚合酶複合物之間的兼容性。
表3.A/B嵌合HA在所表達細胞及包含它們的病毒中的性質
a)每一HA構建體與表達A型聚合酶及表達NA的質粒一起轉染入COS-7細胞。轉染48小時後測定各HA的生物學性質。
b)含有野生型或嵌合HA基因和其它A型流感病毒基因的病毒用基於質粒的反向遺傳學系統生成。轉染48小時後收集294T細胞上清，進行感染性滴定。
c)用MDCK細胞製備病毒原種。發生細胞病變效應時收穫病毒。
d)NA不能測得。
含嵌合HA的病毒生成。為了測定A型流感病毒感染時嵌合HA基因是否起作用，製備了HA基因為A/B HA嵌合基因所取代的突變WSN病毒。基於質粒的反向遺傳學可以產生滴度約為107TCID50/ml的野生型病毒(表3)。當用pPolI-B-HA替換掉pPolI-WSN-HA時，未產生感染性病毒。雖然由質粒所轉染細胞的上清病毒滴度判定的效率不同，這四種具有生物學功能的嵌合HA構建體(表3)均成功地在感染性A型病毒中保留下來了。含ANBH HA的病毒僅有微弱的複製，而含ANSTBHHA的病毒效率最高，長到了超過106TCID50/ml。另外兩種不表達具有生物功能的蛋白的HA基因不能支持病毒生長。這些A/B嵌合病毒指定為ANBH病毒、ANSBH病毒、ANTBH病毒和ANSTBH病毒。
為了確認哪一種產生的病毒確實包含B型HA外功能域，用這些病毒感染MDCK細胞，並檢驗它們與A型病毒或B型病毒HA抗體的反應性(圖14)。用含嵌合HA構建體的病毒感染的細胞與抗-B/HA抗體及抗-A/NP抗體反應，但不與抗-A/HA抗體反應，確證了這些病毒包含B型HA外功能域。
A/B嵌合病毒在細胞培養中的生長特徵。為了測定A/B HA嵌合病毒的複製性質，用這此病毒以0.01的MOI感染細胞，對所得病毒檢驗其生長動學(圖15)。儘管這些帶嵌合HA的病毒沒有一種長得比野生型A型病毒更好，ANSTBH和ANTBH嵌合病毒幾乎長到了106TCID50/ml。與A型及B型病毒均不一樣，這些病毒均形成極小的噬斑，只有用免疫染色才能檢測到(數據未列出)。
A/B嵌合病毒在小鼠中的複製。A/B嵌合病毒在細胞培養中的限制性複製提示這些病毒可在體外減毒。因此，小鼠用A/B HA嵌合病毒(105TCID50/50μl)進行鼻內接種。ANBH病毒未做檢驗，因為其原種滴度太低(約103TCID50/ml)。其它三種檢驗的嵌合病毒沒有一種可致小鼠死亡，而同樣劑量的A型病毒殺死了所有感染的小鼠，同樣劑量的B型病毒則殺死了8隻受感染小鼠中的7隻(表4)。接種後第3天從肺和鼻甲復原出了嵌合病毒，表明這些病毒在小鼠中得以複製。有趣的是，嵌合病毒的複製在肺部更受限，而在鼻甲的複製受到的限制要少一些。說明肺中的病毒複製與致死性之間可能存在聯繫。與野生型A型病毒感染的小鼠相比，ANTBH及ANSTBH嵌合病毒感染的小鼠其體重下降的程度要小一些。總而言之，這些數據表明A/B HA嵌合病毒在小鼠中減毒了。
表4.小鼠中A/B嵌合病毒的病原性
a)小鼠用病毒(106TCID50)在鼻內接種，監測14天。體重變化用均值±標準差(SD，n＝3)表示。
b)接種後第3天測定器官中的病毒滴度，以Log10TCID50/g的均值±SD(n＝3)表示。
c)NA不能測得d)對照小鼠用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)進行模擬接種。
當野生型病毒感染時，A/B HA嵌合病毒免疫對小鼠的保護作用。由於A/BHA嵌合病毒表達來源於B型病毒的HA外功能域，可以預測的是這些病毒能提供對野生型B型病毒感染的保護性免疫反應。在攻擊實驗之前測定小鼠經嵌合病毒感染後是否誘導出了抗-B型抗體。接種三周後，用ELISA檢驗在來自於嵌合病毒所感染小鼠的鼻/氣管洗液內檢測到了B型病毒特異性IgA，在血清中則檢測到了IgG抗體(圖16A)。來自於A/B HA嵌合病毒所感染小鼠的血清樣品中也檢測到了HI抗體(圖16B)。因此，儘管ANSBH誘導的免疫反應效率低一些，在所有用嵌合病毒感染的小鼠中均證明產生了特異性的抗體反應。
這些嵌合病毒免疫的小鼠於免疫後4周用50倍LD50的B型病毒攻擊(表5)。攻擊後，這些小鼠均存活下來，而所有對照模擬免疫的小鼠均死了，用亞致死量(103TCID50)WSN病毒免疫的8隻小鼠在野生型B型病毒攻擊後僅有2隻存活下採，表明嵌合病毒的免疫反應對野生型B型病毒感染具有特異性保護作用。另外，除一隻攻擊3天後接受ANSBH病毒的小鼠外，從嵌合病毒預免疫的小鼠鼻甲或肺未復原出B型病毒(數據未列出)。
表5.A/B嵌合病毒免疫小鼠對野生型B型病毒攻擊的保護作用
a)小鼠用所列病毒進行鼻內感染b)免疫4周後，小鼠用野生型B/Lee-R病毒(50倍LD50)在鼻內進行攻擊，攻擊後監測14天。體重的變化用均值±SD(n＝3)。
c)NA不能測得d)對照小鼠用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)進行模擬接種和攻擊。
討論正如本文所述，首次在A型病毒背景下生成了具有B型而不是A型HA的流感病毒，從而同時包含A型和B型病毒蛋白。生成A/B HA嵌合病毒所必需的是什麼呢？嵌合基因必須轉錄和複製以便在病毒顆粒中維持下來。儘管在相同病毒類型中是保守的，A型和B型RNA片段之間的非編碼區(含RNA轉錄和複製所需啟動子序列(Luyt jes等，1989)兩端的末端序列不同(Crescenzo-Chaigne等，1999；Desselberger等，1980)。但是，以前的研究顯示A型聚合酶使旁側有B型病毒NS片段非編碼區的報導基因得以轉錄(Muster等，1991)。而且，生成了包含嵌合基因的嵌合A/B流感病毒(NA/B-NS)，其中嵌合基因包含A型病毒NA的編碼序列和B型病毒NS的非編碼區(Muster等，1991)。這些數據表明雖然程度低於A型病毒基因的同源啟動子，A型聚合酶複合物還是識別出了B型NS基因的啟動子序列。
各RNA片段的非編碼區包括兩個結構性區域所有8個RNA片段中保守的終止序列和內部片段特異性的序列。由於啟動子活性主要由前面區域決定(Portela等，1999)，所有B型基因片段均有可能被A型聚合酶複合物轉錄和複製。實際上，用含B型非編碼區的pPolI-B-HA質粒和表達A型聚合酶及NP的質粒感染細胞後，細胞中有B型HA表達(表3)，這一數據支持上述觀念。因此，未生成含完整B型HA片段的病毒即HA類型間重排體，不能解釋為缺乏RNA的轉錄和複製。
嵌合病毒生成的限制性可能起始於RNA片段導入病毒顆粒的水平；對於病毒生成來說，嵌合片段必須包裝入病毒顆粒。儘管有報導認為A型NS片段的非編區包含RNA包裝信號(Luyt jes等，1989)，流感病毒RNA片段的包裝機制尚未完全闡明。病毒顆粒導入所需RNA片段的序列或結構特性大半仍是未知的，但是，最近發現A型NA RNA片段在編碼區的兩端均有其自身的病毒顆粒導入信號(Fujii等，2002，實施例2)。在此研究中，ANSBH病毒的複製效率比ANBH病毒的複製效率更高(圖14和表3)。因為這兩種病毒中表達的HA蛋白應該是一樣的，那麼複製效率的差異可能是RNA包裝效率不同的結果。也就是說，編碼HA信號序列的區域內可能存在高效RNA包裝所需的結構性特性。類似地，這也可解釋ANTBH和ANSTBH病毒之間複製效率的差異，它們也表達相同的HA蛋白。事實上，A型HA片段的包裝信號位於編碼區的兩端(數據未公開)。有趣的是，含A型病毒NA非編碼序列及B型病毒NA編碼區序列的嵌合NA基因不能進入A型病毒中(Ghate等，1999)。這可以解釋為缺乏含RNA包裝信號的A型病毒NA編碼區所致，與前面提及的最近發現(Fujii等，2002)一致。
就A/B HA嵌合病毒的生成來說可能也存在蛋白質水平上的關鍵相互作用嵌合蛋白必須包裝入病毒顆粒中，而且必須對病毒複製發揮作用。反式方式供應的B型NA蛋折可以替代A型NA的功能並導入A型病毒顆粒中，支持NA缺失的A型病毒在細胞培養中完成多個複製循環(Ghate等，1999)。但是，正如前面所討論的，並沒有產生含B型NA的A型病毒。儘管產生了嵌合A/B HA病毒，與野生型病毒相比它們還是弱化了。這種弱化可能起始於B型HA受體結合活性和A型NA唾液酸酶活性之間的次最佳平衡。另外，HA中信號肽及/或跨膜區/胞漿域的替換可能已經使結構發生了改變。例如，HA中的跨膜區/胞漿域可以與其它病毒組分如引導高效病毒裝配的M1相互作用(Ali等，2000；Cenami等，1996；Jin等，1997；Zhang等，2000)。因此，不能產生含完整B型RNA片段的A型病毒或含完整A型RNA片段的B型病毒，其原因可能為RNA片段導入水平或蛋白功能性相互作用水平上受到限制，或者二者兼而有之。
A/B HA嵌合病毒在小鼠中因肺部受限制的複製得以減毒，並為小鼠提供了對野生型B型病毒感染的保護性免疫，提出了一種研發流感疫苗的新方法。目前，皮下施用三價滅活流感疫苗是全世界的標準，但是它們的效率不是最優的。這主要是因為在流感病毒起始入侵的上呼吸道外未能誘導出令人滿意的體液免疫(Wavening等，2001)。因而，雖然這些疫苗可以減輕疾病的嚴重程度，但不能預防病毒感染。與滅活疫苗不同，活疫苗同時誘導體液免疫反應和細胞毒性T細胞免疫反應。此處所述的研究表明HA基因的嵌合操縱可以控制病毒減毒到不同的程度。這樣，此方法可允許生產在減毒和免疫原性間達成適當平衡的活疫苗株。此外，A/B嵌合HA可以導入減毒突變已得到良好鑑定的耐寒A型流感病毒中(Maassab等，1999)。目前耐寒疫苗是A型病毒和B型病毒的混合物。兩種病毒之間的相互作用可能影響疫苗的效力，雖然此問題已通過調整病毒的劑量比而得以解決。含A/B嵌合HA的A型病毒將允許生產基於單個而不是兩個減毒病毒的活疫苗，從而消除A型病毒和B型病毒之間潛在的幹擾。
因此，與對B型疫苗株減毒突變所知甚少、含A型病毒及B型病毒混合物的活減毒疫苗不同，可以生成含A型病毒背景下B型HA及NA的病毒。此方法允許生產基於主疫苗株的活疫苗，其中主疫苗株用於表達A型及B型HA和NA的減毒突變已得到良好界定。而且，病毒片段包裝信號的知識也促進了改良活減毒流感疫苗的研發。
實施例5材料與方法細胞和病毒。293T人胚腎細胞(293細胞系中插入了猿病毒40T抗原基因的衍生系)在補充有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s改良Eagle培養基中培養。Baby倉鼠腎細胞(BHK)、中國倉鼠卵細胞(CHO)和Madindarby犬腎細胞(MDCK)分別用含5％FCS的DMEM、含10％新生牛血清的MEM和含5％新生牛血清的MEM培養。所有細胞在5％CO2中於37℃培養。A/WSN/33(H1N1)(WSN)病毒經Neumann等(1999)所述反向遺傳學生成，並在MDCK細胞中繁殖。VSV印第安那株由反向遺傳學生成並在BHK細胞中繁殖。
反向遺傳學。為生成流感病毒樣的顆粒(VLP)及突變A型流病毒，使用了含WSN病毒基因cDNA的質粒(稱為PolI質粒)和真核蛋白表達載體pCAGGS/MCS(受雞β-肌動蛋白啟動子控制)，其中WSN病毒基因受人RNA聚合酶I啟動子和小鼠RNA聚合酶I終止子控制。簡單地說，PolI質粒和蛋白表達載體與轉染試劑Trans IT LT-1(Panver，MadisCon，WI)混合，於室溫孵育15分鐘，加到Opti-MEM(GIBCO/BRL)培養的1×106個293T細胞中。6小時後，DNA轉染試劑換成含0.3％BSA和0.01％FCS的Opti-MEMI(GIBCO/BRL)。48小時後，收穫上清中的VLP或突變A型流感病毒。此研究中生成的轉染體均包含突變的HA vRNA片段和WSN病毒的其它vRNA片段，並按突變HA vRNA片段命名(例如，含HA(0)GFP(0)RNA片段的VLP指定為HA(0)GFP(0)VLP)。
質粒的構建。pPolI HA(0)GFP(0)用於生成含HA vRNA3』非編碼區、增強螢光蛋白互補編碼序列及HA vRNA 5』非編碼區的反義RNA。簡單地說，GFP基因用含BsmBI位點和HA 5』或3』非編碼序列的引物經PCR擴增，用BsmBI消化，並克隆入PolI質粒的BsmBI位點。此質粒導入細胞可以生成反義方向上含編碼GFP的序列的RNA，其中所該序列旁側有HA vRNA的5』及3』非編碼區。
pPol IHA(468)GFP(513)這樣製備先用緊接引物Bam500R(5′-GCGGAT CCT CCC CTA TGG GAG CAT GAT AC-3』；SEQ ID NO6)和Xba1218F(5′-GCT CTA GAA ACT CTG TTA TCG AGA AAA TG-3』；SEQ ID NO7)經反向PCR擴增用於生成WSN vRNA的pPolIHA。PCR產物用BamHI和XbaI消化，然後將GFP基因克隆入BamHI位點和XbaI位點。所得質粒pPol IHA(468)GFP(513)用於生產含HA vRNA 3』非編碼區和3』編碼區468個鹼基、GFP編碼序列、HA vRNA 5』編碼區513個鹼基和5』非編碼區的反義RNA。以同樣的方式經反向PCR生成一系列HA缺失突變體。這些突變體根據來源於HA編碼區的核苷酸數命名，例如HA(9)GFP(80)RNA片段包含HA 3』非編碼區，與N-末端區對應、來自於HA編碼區的9個核苷酸，GFP閱讀框，與C-末端區對應、來自於HA編碼區的80個核苷酸，以及HA 5』非編碼序列。這些質粒構建體均進行測序，確保PCR未引入不需要的突變。
用PCR生成pPol IHA(0)VSVG(0)，它用於生成含HA vRNA 3』非編碼區、V SVG互補編碼序列及HA vRNA 5』非編碼區的反義RNA。簡單地說，用含BsmBI位點和HA 5』或3』非編碼序列的引物，以pCAGGS-VSVG為模板經PCR擴增VSV G基因。PCR產物用BsmBI消化，並克隆入pHH21載體的BsmBI位點。將VSV G的編碼序列克隆入HA(9)GFP(80)的BamHI位點和XbaI位點，從而製備pPol IHA(9)VSVG(80)。pPol INA(183)GFP(157)包含NA vRNA 3』非編碼區和編碼融合蛋白的互補序列，其中編碼融合蛋白的序列含61個NA的N-末端密碼子、兩個連續的終止密碼子(TAA-TAG)及NA vRNA 5』末端的185個鹼基。它的製備方法如下pT7Blue-NA內WSN NA基因中與第203個至1099個核苷酸(正義)對應的區域先經PCR用BglII位點取代，然後將GFP基因克隆入此BglII位點和1226位的StuI位點。然後將NA(183)GFP(157)基因插入PolI質粒pHH21的BsmBI位點。
用於生產反義INA(183)GFP(157)Met(-)RNA的pPol INA(183)GFP(157)Met(-)缺少NA蛋白的起始密碼。它的製備方法如下通過體外定點突變(GeneEditor，Promega)將pPol INA(183)GFP(157)中pPol INA(183)GFP(157)基因的ATG起始密碼子和位於第15個密碼子的另一個ATG換成GCG。所得構建體pPol INA(183)GFP(157)Met(-)包含NA 3』非編碼區(19個核苷酸)、與NA編碼區N端對應的183個核苷酸、GFP開放閱讀框、兩個連續的終止密碼子(TAA-TAG)、與NA編碼區C端對應的157個核苷酸及NA 5』非編碼區(28個核苷酸)，它受人RNA聚合酶I啟動子和小鼠RNA聚合酶I終止子控制。
免疫染色測定。在流感VLP感染16小時後，細胞用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌兩次，用3.7％甲醛(在PBS中)於室溫固定20分鐘，然後用0.1％TritonX-100處理。為了檢驗VLP的生成效率，取106個細胞與0.1ml質粒轉染的293T細胞培養上清一起孵育，記錄感染16小時後免疫染色測定NP為陽性的細胞數。
Western印跡。VLP或突變病毒於4℃以50,000×g的離心力離心下來。濃縮後的VLP或病毒重懸於裂解緩衝液(0.6M KCl，50mM TrisHCl，pH7.5，0.5％TritonX-100)中。裂解液置於15％SDS-聚丙烯醯胺凝膠上，電轉移到聚偏乙烯二氟(PVDF)膜上，用PBS中的5％脫脂奶於4℃封閉過夜，然後與抗-WSN病毒多克隆抗體、抗-HA單克隆抗體或抗-VSVG單克隆抗體於室溫孵育1小時。膜用含0.05％吐溫-20的PBS洗滌三次。結合的抗體用VECTASTAIN ABC試劑盒(Vector)及Konica免疫染色試劑盒(Konica)檢測。
Northern雜交。存在於PolI質粒所感染293T細胞中的vRNA用Isogen RNA提取試劑盒(Nippon Gene，東京，日本)於轉染24小後提取出來。RNA在乙二醛/DMSO/磷酸緩衝液中於50℃乙二醛化Glyoxalate化，在10mM磷酸緩衝液(pH7.0)中的1.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳分離。RNA點樣到尼龍膜上，並與寡核苷酸探針雜交，該探針與GFP序列(ATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGG；SEQ ID NO8)(10pmol)互補，並用DI G寡核苷酸加尾試劑盒(Roche)於37℃標記30分鐘。利用該GFP探針於Easy Hyb(Roche)中於42℃過夜完成雜交。RNA條帶用DIG核酸檢測試劑盒(Roche)檢測。簡單地說，雜交膜用洗液(0.1M馬來酸、0.15M NaCl、0.3％吐溫-20，pH7.5)洗滌，用1％封閉試劑於室溫封閉30分鐘，與偶聯有鹼性磷酸酶的抗-DIG抗體(1∶5000)一起於室溫孵育30分鐘。然後膜用洗滌緩衝液洗滌，與檢測緩衝液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5)的氯化氮藍四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT/BCIP)中於室溫避光孵育。RNA條帶用DIG核酸檢測試劑盒(Roche)檢測。對照RNA從模擬轉染的293T細胞中提取。
轉染體病毒的複製性質。24孔板中的雙孔RHK、CHO或MDCK細胞用病毒感染，用含0.01％FCS的MEM培養基覆蓋，於37℃孵育。於不同時間取上清測定MDCK細胞噬斑測定中的感染性病毒。
結果。
HA vRNA的編碼區是HA片段導入病毒顆粒中所必需的。為了測定HA vRNA的編碼區是否象NA vRNA那樣為導入病毒顆粒所必需，構建了兩個質粒僅含HA vRNA 5』及3』非編碼區和GFP編碼序列的pPol IHA(0)GFP(0)，和HA序列於500～1218位(正義方向)核苷酸缺失後GFP編碼序列插入HA基因框內的pPol IHA(468)GFP(513)(圖17)。後面一個構建體含HA 3』非編碼區(33個核苷酸)、與編碼區N-端對應的468個核苷酸、帶一個終止密碼子的GFP開放閱讀框以及HA 5』非編碼區(45個核苷酸)。所得融合蛋白包含HA N-端的156個胺基酸和完整的GFP序列。
為了產生含這些突變HA vRNA的VLP，用pPol IHA(0)GFP(0)或pPol IHA(468)GFP(513)、7 RNA PolI質粒和蛋白表達質粒轉染293T細胞，其中7 RNA PolI質粒用於生成剩餘的病毒RNA片段，蛋白表達載體用於表達9種病毒蛋白(即PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、M1、M2和NS2)。轉染48小時後，收穫293T細胞培養上清中的VLP，用它們感染MDCK細胞。由於所得VLP含突變HA，它們表達GFP及除HA之外的所有病毒蛋白。因此未產生無感染性的子代病毒(數據未列出)。感染16小時後，將表達GFP的細胞數(即含編碼GFP基因的片段的VLP數)除以表達NP的細胞數(即所有感染性VLP的數目)，以此測定突變HA vRNA的病毒顆粒導入效率。所有感染性VLP在pPol IHA(468)GFP(513)所感染293T細胞(即所有NP陽性的細胞數)培養上清中的滴度是7.4×105感染性VLP/ml，而含pPol IHA(468)GFP(513)RNA的VLP(即GFP陽性的細胞數)滴度是3.2×105VLP/ml。這些結果表明，所有感染性VLP中有42.8％產生了隱匿的突變HA vRNA(圖18)。相板只有3.9％的VLP含pPol IHA(0)GFP(0)RNA片段(圖18)。這些結果提示，HA vRNA的編碼區對於HA片段導入流感病毒顆粒內是必需的。
HA vRNA編碼區的3』和5』端對於HA片段導入病毒顆粒內均很重要。以前人們發現NA vRNA編碼區的3』端在病毒顆粒導入時發揮著比5』端更為關鍵的作用。因此，測定了3』端、5』端或是兩端對於HA vRNA片段的病毒顆粒導入是否重要。為了解決這一問題，製備了缺乏HA vRNA編碼區3』端的HA(0)GFP(1011)基因和缺乏HA vRNA編碼區5』端的HA(966)GFP(0)基因(圖17)，並如上所述檢驗了HA vRNA的病毒顆粒導入。儘管質粒感染細胞中兩種vRNA的量均與HA(468)GFP(513)vRNA量相當(數據未列出)，HA(0)GFP(1011)和HA(966)GFP(0)的片段導入效率分別只有6.8％和8.4％(圖17)，表明HA vRNA編碼區的3』和5』端對於HA片段導入病毒顆粒內均很重要。
為了進一步確定HA vRNA中對於其自身導入病毒顆粒的關鍵區域，生成了一系列所含截短HA vRNA還進一步在3』及/或5』編碼區中發生缺失的VLPs(圖17)。然後測定突變HA vRNA導入VLPs的導入效率。由於使3』端只剩下15個核苷酸和5』端剩下268個核苷酸的進一步缺失不影響HA vRNA導入效率(HA(468)GFP(513)與HA(15)GFP(268)比較)，用含HA編碼區3』端15個核苷酸和5』端268個核苷酸的HA(15)GFP(268)另外構建了缺失構建體。雖然隨著缺失的程度增加vRNA導入程度逐漸下降，HA編碼區5』端的80個核苷酸是HA vRNA高效導入病毒顆粒所至少必需的(HA(15)GFP(80)與HA(15)GFP(75)比較)。進一步的缺失分析證明，雖然轉染細胞中的HA(9)GFP(80)水平與HA(0)GFP(0)RNA水平沒有一點差別，HA編碼區3』端剩下9個核苷酸殘基的HA(9)GFP(80)可以使HA vRNA高效導入病毒顆粒(超過65％)(圖17和18)。這些結果表明HA編碼區中3』端的9個核苷酸和5』端的80個核苷酸對於HA vRNA有效地導入病毒顆粒中是必需的。
HA及NA基因含外源基因編碼序列的新的A型流感病毒的生成。由於HA片段導入病毒顆粒所需序 已測定，又檢驗了旁側有這些序列的外源基因是否可以導入A型流感病毒並在反覆傳代時可以保留下來。作為外源基因模型的VSV G編碼區序列插入pPol IHA(9)GFP(80)的BamHI和XbaI位點取代GFP序列。所得構建體指定為pPolIHA(9)VSVG(80)，它包含HA 3』非編碼區(33個核苷酸)、與HA編碼式N端對應的9個核苷酸、帶一個終止密碼子VSVG開放閱讀框(1552個核苷酸)、與HA編碼區C端對應的80個核苷酸以及HA 5』非編碼區(45個核苷酸)。構建只含3』及5』非編碼區但不含HA vRNA編碼區的載體pPol IHA(0)VSVG(0)作為對照。由於VSV G蛋白應該替換HA和NA蛋白，NA編碼區可以用外源基因替換。因此，構建pPol INA(183)GFP(157)Met(-)用於生產含GFP編碼序列和NA片段高效導入病毒顆粒所需NA編碼序列的重組NA RNA片段。此構建體中，將ATG替換成GCG使NA開放閱讀框的起始密碼子破壞掉。這樣，GFP開放閱讀框將會從其自身的起始密碼子開始翻譯。
用生產HA(9)VSVG(80)、NA(183)GFP(157)Met(-)和剩餘6種病毒RNA片段的質粒以及表達流感病毒聚合酶蛋白NP、M1、M2、NS2和VSVG的質粒轉染293T細胞。轉染72小時後，收集293T細胞上清用MDCK細胞進行噬斑測定。含 HA(9)VSVG(80)RNA片段和NA(183)GFP(157)Met(-)RNA片段的轉染體病毒(指定為VSVG(HA)GFP(NA)病毒)可以存活並在無胰蛋白酶的條件下生成了表達GFP的噬茵體(圖19)。免疫染色確認了含VSV G但不是HA的噬斑的表達(圖19)。VSVG(HA)GFP(NA)病毒但不是對照WSN病毒感染的細胞也表達GFP。相反，當用pPol IHA(0)VSVG(0)質粒取代pPol IHA(9)VSVG(80)時，雖然可在MDCK細胞中檢測表達GFP及/或NP蛋白的單個細胞，但未能觀測到噬斑(數據未列出)。而且，在5次連續傳代後還觀測到VSVG及GFP均在VSVG(HA)GFP(NA)感染的MDCK細胞中持續表達(數據未列出)。5次傳代後在VSVG(HA)GFP(NA)病毒中HA(9)VSVG(80)RNA片段的剩餘HA區域未檢測到突變。但是，VSVG胺基酸序列中發現了三個突變57位的Ile變成Leu、95位的Gln變成His以及499位的Gln變成終止子。雖然野生型VSV G蛋白含有胞漿域的29個殘基，但499位的Gln變成終止子突變使該結構域的最後13個殘基缺失了。
VSVG(HA)GFP(NA)病毒的生物學性質。為了測定VSV G蛋白是否確實導入了含其它流感病毒蛋白的病毒顆粒中，對濃縮VSVG(HA)GFP(NA)病毒和WSN(對照)病毒進行western印跡分析。如圖20所示，VSVG(HA)GFP(NA)病毒顆粒中檢測到了VSV G蛋白而未檢測到HA，確認了VSV G蛋白導入了病毒顆粒。
接下來，檢驗了VSVG(HA)GFP(NA)病毒在BHK、CHO或MDCK細胞中的生長性質。以0.001的MOI感染細胞，在感染後的不同時間於37℃用MDCK細胞上的噬斑測定來測定培養上清中的病毒產率。儘管低於WSN病毒的滴度，VSVG(HA)GFP(NA)病毒在BHK和MDCK細胞中的最大滴度至少達到了106PFU/ml(圖21)。與WSN病毒在CHO細胞中生長不良相比，VSVG(HA)GFP(NA)病毒在這些細胞中與在另外兩種受試細胞系中長得一樣好(圖21)。另外，在各細胞系中複製時，VSVG(HA)GFP(NA)病毒感染的細胞表達GFP。
這些結果表明，HA(9)VSVG(80)和NA(183)GFP(157)Met(-)片段均高效導入了流感病毒顆粒中，而且反覆傳代時這兩種外源基因在A型流感病毒中得以穩定地保留下來。
討論測定基因組包裝機制對理解流感病毒生活周期及研發基於流感病毒的載體用於表達外源蛋白很關鍵。本研究證明了HA vRNA編碼區3，及5』末端的序列均是此片段高效導入病毒顆粒所必需的。另外，利用此知識生成了一種基於流感病毒的新病毒，證明了兩種外源基因的穩定表達；該新病毒包含兩種含VSV G和GFP編碼序列的重組RNA片段，它們旁側分別有HA vRNA和NA vRNA導入病毒顆粒所需的序列。
已報導有數種方法用於研發基於A型流感病毒的疫苗載體，這些載體用於表達來源於不相關感染性試劑的基因或其一部分。短多肽插入了HA的抗原位點，造成了對所插入肽段的陽性免疫反應。對於更長的多肽及蛋白質來說，外源基因插入流感病毒基因的一個基因中，在這裡外源蛋白利用內部核糖體入口位點(IRES)或口蹄疫病毒2A蛋白酶表達。這裡，建立了一種利用NA及HA vRNA中順式作用病毒顆粒導入信號的新系統用於表達外源蛋白。此系統可以使基於流感的病毒導入超過1.5kb的外源基因(如VSV G)，證明了此載體系統的潛能。由於不可複製型流感VLP在中小鼠中的疫苗效率已知，所帶重組RNA片段含來源於不相關病原體的基因、基於不可複製型流感(病毒)的VLP可用作很有希望的疫苗。此潛能對於針對HIV、口蹄疫、及其它感染的疫苗尤基有吸引力，這些情況下活疫苗病毒向野生型病毒的任意回復均不可接受，或是由於體液免疫及細胞毒T淋巴細胞反應而造成滅活疫苗的效率很有限。因此，使用此方法可以將流感病毒用作疫苗載體。例如，可以製備一種HIV gp160編碼區取代HA、gag編碼區取代NA的病毒(圖24和25)。另外，如果VSV G取代了HA，M2就不再需要了，因而就有三種基因可以用異源基因替代。例如，HA可以用HIV gp160取代，NA可以用gag取代，而M2可用nef取代。所得重組流感病毒可用作疫苗或作為另一種HIV疫苗如HIV DNA疫苗的增強劑。此外，疫苗也可以是基於重組流感病毒的多價體疫苗，其中該重組病毒中的NA編碼片段用另一種病原體如皰疹病毒D糖蛋白的編碼片段，這樣該疫苗可以對流感病毒和皰疹病毒感染產生保護性免疫反應。
來源於腺病毒、逆轉錄病毒和痘病毒的病毒載體可有效地將外源基因導入靶細胞中。由於這些病毒包含可以整合入宿主染色體的DNA或DNA複製中間體，無法消除發生不良後果的危險。相反，由於在受感染細胞中缺乏DNA期，這樣的整合在流感病毒中是不會發生的。另外，由於VSVG(HA)GFP(NA)病毒不象其它典型流感病毒那樣需要HA切割所需的胰蛋白酶，它可以有更廣泛的用途。另外，可以通過改變病毒顆粒表面上的糖蛋白而生成具有所需細胞向性的重組病毒。這樣，利用vRNA片段中病毒顆粒導入順式作用信號的系統可以設計基於流感的重組病毒載體，這些載體可以將多個外源基因輸送入靶細胞。
來源於上皮細胞的病毒其裝配和釋放在一些病毒中是極化的，選擇性地發生在頂點或基側的表面。據認為極化病毒芽殖在測定病毒感染病原性時起一定作用。A型流感病毒從受感染上皮細胞的頂部芽殖，個別表達的HA、NA及M2蛋白也靶向到細胞的頂部表面。另一方面，VSV從受感染細胞基側表面釋放，VSV G蛋白也轉運到基側表面。本研究中，成功地生成了用VSV G取代HA及NA蛋白的重組病毒VSVG(HA)GFP(NA)病毒。但是，由於點突變此重組病毒的VSV G蛋白缺乏胞漿結構域的最後13個殘基。已知胞漿結構域中這13個殘基缺失而生成的蛋白轉運到頂部表面的效率比轉運到基側表面的效率高。因此，VSVG(HA)GFP(NA)病毒中VSV G蛋白內引入的突變很可能促進它高效轉運到頂部表面，造成了VSVG(HA)GFP(NA)病毒的高效芽殖。
流感的流行常常在流感病毒RNA片段發生重排使病毒的HA及/或NA與以前傳播的病毒株有著免疫學不同時發生。HA、NA、M及NS vRNA內編碼區3』和5』的序列對於它們高效導入病毒顆粒是必需的。vRNA片段的包裝(很可能是病毒核蛋白複合物的形式)由病毒RNA片段間反式發生的RNA-RNA相互作用介導。如果是這樣，各片段內的特異性導入信號可能限制RNA片段的重排。從經驗上來說，已知流感病毒RNA片段不會發生隨機重排。據認為蛋白間的功能性相互作用(如聚合酶複合物的形成、HA-NA及或切割HA-M2功能性連接)限制了隨機重排。除了蛋白質水平上的這些重排限制外，RNA水平上可能也存在類似的限制。在此背景下，1957及1968年流行時，除HA及/或NA基因外PB1基因也導入了來源於禽病毒的人病毒，提示HA和PB1 RNA片段間可能存在關聯。進一步鑑定對於其它RNA片段導入病毒顆粒的關鍵區域可提供理解RNA片段重排的線索，從而預測新型A型流感病毒流行株的出現。
總之，有了vRNA包裝信號的信息，就可以研發新的流感疫苗和基於流感的疫苗載體。
實施例6如圖26所示，可以製備組成性表達編碼蛋白如NS2的流感病毒樣RNA的細胞系，即使此RNA缺乏導入信號。也可製備缺乏NS2編碼序列(NS2 KO)的病毒(Neumann等，2000；Watanabe等，2002)。因為病毒缺乏NS2，當NS2 KO病毒感染正常細胞時將不會產生子代病毒。相反，當NS2 KO病毒感染表達編碼NS但缺乏導入信號的流感病毒樣RNA的細胞時，病毒感染後NS2得以表達從而產生了子代NS2 KO病毒。但是，編碼NS2的流感病毒樣RNA不會導入NS2 KO病毒中，因為它缺乏病毒顆粒導入信號。因此，NS2 KO在正常細胞中仍然是不可複製型。此系統可用於生產不可複製型病毒的生產細胞。利用此系統，可以製備表達病毒蛋白的生產細胞，其對細胞的毒性通常會阻止組成性表達它們的細胞系產生。因此，在本申請中，病毒顆粒導入信號的知識可以用於設計不允許特定片段導入病毒顆粒的系統。
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所有出版物、專利及專利申請在此引入作為參考。儘管在前述說明書中本發明已說明了相關的其中一些優選實施方案，出於闡述目的也列出的許多細節；對於本領域內的熟練技術人員來說，本發明容許另外的實施方案及本文所述某些細節可以作出很大改變而不背離本發明的基本原則是非常直觀的。
權利要求
1.包含流感病毒導入序列的流感病毒載體，該載體包含a)與流感病毒NA vRNA3』非編碼區對應的序列，3』NA導入序列，異源核酸片段和NA vRNA5』非編碼區；b)與流感病毒HA vRNA3』非編碼區對應的序列，異源核酸片段，5』HA導入序列和HA vRNA5』非編碼區；c)與流感病毒M vRNA3』非編碼區對應的序列，3』M導入序列，異源核酸片段，5』M導入序列和M vRNA5』非編碼區；d)與流感病毒NS vRNA3』非編碼區對應的序列，3』NS導入序列，異源核酸片段和NS vRNA5』非編碼區；e)與流感病毒PB2 vRNA3』非編碼區對應的序列，異源核酸片段，5』PB2導入序列和PB2 vRNA5』非編碼區；f)與流感病毒PB1 vRNA3』非編碼區對應的序列，異源核酸片段，5』PB1導入序列和PB1 vRNA5』非編碼區；或g)與流感病毒PA vRNA3』非編碼區對應的序列，異源核酸片段，5』PA導入序列和PA vRNA5』非編碼區；其中當與該載體對應的vRNA存在於表達流感病毒蛋白並包含除與該載體對應的vRNA之外的vRNA的細胞中時，與該載體對應的vRNA包裝入病毒顆粒中。
2.權利要求1a)的載體，其中3』NA導入序列包括至少19個與NA起始19個編碼核苷酸對應的核苷酸。
3.權利要求2的載體，其中所述載體還包含5』NA導入序列。
4.權利要求3的載體，其中所述5』NA導入序列包括至少39個與NA3』39個編碼核苷酸對應的核苷酸。
5.權利要求1a)的載體，其中3』NA導入序列包括至少90個與NA起始90個編碼核苷酸對應的核苷酸。
6.權利要求1b)的載體，其中5』HA導入序列包括至少80個與HA3』80個編碼核苷酸對應的核苷酸。
7.權利要求1b)的載體，其中5』HA導入序列包括至少291個與HA3』291個編碼核苷酸對應的核苷酸。
8.權利要求1b)的載體，其中所述載體還包含3』HA導入序列。
9.權利要求8的載體，其中3』HA導入序列包括至少3個與HA起始3個編碼核苷酸對應的核苷酸。
10.權利要求8的載體，其中3』HA導入序列包括至少9個與HA起始9個編碼核苷酸對應的核苷酸。
11.權利要求1的載體，其中所述異源核酸片段包含與內部核糖體入口序列對應的序列。
12.權利要求1的載體，其中所述異源核酸片段包含與標記基因開放閱讀框對應的序列。
13.權利要求1的載體，其中所述異源核酸片段包含與病原體免疫原性蛋白或肽或治療性蛋白的開放閱讀框對應的序列。
14.權利要求1的載體，其中所述導入序列來自於A型流感病毒。
15.權利要求1的載體，其中所述導入序列來自於B型流感病毒。
16.權利要求1的載體，其中所述異源核酸片段與另一核酸片段融合以編碼融合蛋白。
17.包含與權利要求1的載體對應的vRNA的重組流感病毒。
18.權利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與標記基因開放閱讀框對應的序列。
19.權利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與病原體免疫原性蛋白或肽的開放閱讀框對應的序列。
20.權利要求19的重組病毒，其中所述開放閱讀框編碼HA蛋白。
21.權利要求19的重組病毒，其中所述開放閱讀框編碼NA蛋白。
22.權利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與跨膜蛋白開放閱讀框對應的序列。
23.權利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與蛋白開放閱讀框對應的序列，該蛋白具有膜融合活性。
24.權利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與病毒衣殼蛋白開放閱讀框對應的序列。
25.權利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與水泡性口炎病毒G蛋白開放閱讀框對應的序列。
26.權利要求17的重組病毒，其中所述異源核酸片段包含與治療性蛋白開放閱讀框對應的序列。
27.權利要求20的重組病毒，其中所述HA蛋白為B型HA蛋白。
28.在細胞中表達異源核酸片段的方法，該方法包括讓細胞與權利要求17的重組病毒接觸，檢測或測定細胞中是否有所述異源核酸片段編碼的產物表達。
29.包含與NA5』編碼區對應的流感病毒NA導入序列和異源核酸片段的分離核酸分子。
30.包含與NS5』編碼區對應的流感病毒NS導入序列和異源核酸片段的分離核酸分子。
31.包含與HA3』編碼區對應的流感病毒HA導入序列和異源核酸片段的分離核酸分子。
32.包含與PB23』編碼區對應的流感病毒PB2導入序列和異源核酸片段的分離核酸分子。
33.包含與M3』編碼區及M5』編碼區對應的流感病毒M導入序列和異源核酸片段的分離核酸分子。
34.權利要求1的載體，其中與所述載體對應的vRNA當在細胞中存在時以是相應野生型vRNA的至少10％的效率包裝入病毒顆粒中。
35.權利要求1的載體，其中與所述載體對應的vRNA當在細胞中存在時以是相應野生型vRNA的至少30％的效率包裝入病毒顆粒中。
36.權利要求1的載體，其中與所述載體對應的vRNA當在細胞中存在時以是相應野生型vRNA的至少60％的效率包裝入病毒顆粒中。
37.製備不可複製型流感樣病毒的方法，該方法包括a)讓重組宿主細胞與缺乏含野生型NS編碼序列的vRNA及包含重組酶序列的重組流感病毒接觸，其中重組宿主細胞包含重組核酸分子，該重組核酸分子包含與兩位點特異性重組序列操縱性連接的NS2開放閱讀框而不是導入序列，所述重組序列與NS2開放閱讀框的5』端連接，並且所述重組序列由重組酶識別；而且在無重組酶存在時NS2不表達；和b)將不可複製型流感樣病毒與重組宿主細胞分離開來。
38.權利要求37的方法，其中所述重組酶為Cre，位點特異性重組序列為loxP序列。
39.權利要求37的方法，其中所述重組酶為FLP，位點特異性重組序列為frt序列。
全文摘要
本發明提供了流感病毒載體的一種包裝(導入)信號，以及使用該信號在病毒及細胞中傳遞和維持流感病毒及外源核酸的方法。
文檔編號C12N15/09GK1997734SQ03808356
公開日2007年7月11日 申請日期2003年2月12日 優先權日2002年2月13日
發明者河岡義裕 申請人:威斯康星舊生研究基金會