一種來源於人肺未分化癌的細胞株及其製備方法
2023-05-30 13:49:16
專利名稱：一種來源於人肺未分化癌的細胞株及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種人肺癌細胞株及其製備方法，尤其是一種來源於人肺未分化癌的細胞株及其製備方法。
背景技術：
腫瘤是嚴重危害人類健康的主要疾病之一，世界衛生組織發表的一項研究報告表明，全球癌症狀況將日益嚴重，因此，深入研究腫瘤發生、發展和轉移的分子機制，尋找更為有效的腫瘤治療方案，成為當今醫學研究的前沿課題。隨著腫瘤生物學研究的不斷深入，腫瘤的早期診斷及預防水平有了較大的提高，但是腫瘤治療後的高轉移及高復發仍是腫瘤臨床治療中一個亟待解決的難題。近年來，「腫瘤幹細胞」學說的提出及其研究進展，從一個全新的角度去認識腫瘤。該學說認為，腫瘤中存在一部分獨特的具有自我更新和分化功能的幹細胞樣亞群並將之稱為腫瘤幹細胞，這一亞群細胞正是腫瘤的起源細胞並維持腫瘤的生長。因此，腫瘤細胞株是研究細胞癌變機理、腫瘤轉移、腫瘤放療和化療敏感性分子基礎等生物醫學問題的重要材料，建立和鑑定不同的腫瘤細胞株是一項很有意義的工作。
發明內容
本發明的目的是提供一種來源於人肺未分化癌的細胞株，所述細胞株具有典型的腫瘤細胞生物學特性；同時，還提供一種所述細胞株的製備方法。為實現上述目的，本發明採取的技術方案為一種來源於人肺未分化癌的細胞株， 命名為人肺癌細胞株0114，保藏號為CCTCC NO :C201026。所述細胞株在電鏡下觀察顯示，細胞表面長絨毛，細胞間絨毛交纏，連接緊密，核大，核膜邊緣分布有異染色質，細胞器以線粒體和內質網較多，線粒體多為斑馬樣線粒體。所述細胞株在倒置顯微鏡下觀察有兩種生長形態，一種為懸浮生長，細胞折光性較好，胞漿豐富，含有大量折光性物質，一種為貼壁生長，細胞間連接緊密，細胞間界限不清，細胞與平皿之間緊密貼附，不易消化分散；懸浮細胞可以向貼壁細胞轉化，一旦貼壁，便不易脫落。所述細胞株的體外倍增時間為42. 685h。所述細胞株的蛋白表達特徵為vimentin、CK7和TTF-1均表達陽性。所述細胞株的染色體數為40-52條。本發明所述人肺癌細胞株0114，是一株中國南方人肺未分化癌細胞株，來源於一位59歲女性肺癌病人的左下肺癌病灶。病人在接受手術前未接受任何化療、放療及靶向治療等治療，術中發現肺部腫瘤位於左下肺，質地脆軟，大量壞死，局部侵潤生長，壁胸膜廣泛轉移。所述來源於人肺未分化癌的細胞株，是從病理類型為未分化癌的肺癌病人肺部腫塊切除物中培養所得，經病理鑑定為肺未分化癌，為多邊形上皮細胞，具有典型的腫瘤細胞生物學特性，它能在體外連續長期傳代，在體外製備一年，傳100多代，細胞仍然生長增殖活躍。 一種來源於人肺未分化癌的細胞株的製備方法，包括以下步驟
(1)組織塊機械解離將切除的人肺未分化癌組織解離，清洗去除雜質，分離肺癌實質組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質組織，得到剩餘的組織；
(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩餘的組織切成組織片，清洗，然後向組織片加入膠原酶，孵育，過濾，然後收集腫瘤細胞，進行接種培養，得到存活細胞；
(3)對步驟(2)得到的存活細胞進行純化，去除纖維細胞等雜質，純化後的肺癌細胞連續培養並傳代大於12個月，即得細胞株。作為本發明所述製備方法的優選實施方式，所述製備方法包括以下步驟
(1)組織塊機械解離將切除的人肺未分化癌組織解離，清洗去除粘液和紅細胞等雜質，分離肺癌實質組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質組織，得到剩餘的組織；
(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩餘的組織切成Imm3的組織片，清洗組織片，讓組織片沉澱，去除上清液，把剩餘組織再細切，清洗組織碎片，然後向組織片加入膠原酶，在 37°C下孵育4-18小時；過濾，然後收集腫瘤細胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養基中懸浮細胞，進行接種培養，得到存活細胞；
(3)對步驟(2)得到的存活細胞進行純化，去除纖維細胞等雜質，純化後的肺癌細胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養基中連續培養並傳代大於12個月，即得細胞株。作為本發明所述製備方法的優選實施方式，所述步驟(1)為將切除的人肺未分化癌組織解離成0. 5cm3，用100%的青-鏈黴素雙抗溶液浸泡移至生物安全櫃，用消毒的PBS 緩衝液反覆清洗組織去除粘液和紅細胞等雜質，再浸泡於培養基中移至解剖顯微鏡下，用兩個10號注射器針頭分離肺癌實質組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質組織，得到剩餘的組織。作為本發明所述製備方法的優選實施方式，步驟(2)為使用無菌的解剖刀和剪子把步驟(1)得到的剩餘的組織切成Imm3的組織片，用PBS緩衝液清洗組織片，讓組織片沉澱，去除上清液，用無菌解剖刀和剪子把剩餘組織再細切，用PBS清洗組織碎片數次，然後加入膠原酶(50-200單位/ml，溶解在PBS中)，在37°C下孵育4_18小時，通過無菌不鏽鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，然後收集腫瘤細胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養基中懸浮細胞，進行接種培養，得到存活細胞。更優選地，步驟(2)中，加入膠原酶的同時還加入有3mM的CaCl2。加入CaCl2可提高膠原酶對組織的解離效率。作為本發明所述製備方法的優選實施方式，步驟(3)中純化後的肺癌細胞的培養溫度為37°C，氣體環境為5%C02/95%空氣，溼度為飽和溼度，每3天更換一次培養液，每3_5 天傳代一次。採用本發明所述製備方法得到的來源於人肺未分化癌的細胞株，是從病理類型為未分化癌的肺癌病人肺部腫塊切除物中製備所得，經病理鑑定為肺未分化癌，為上皮細胞， 具有典型的腫瘤細胞生物學特性，它能在體外連續長期傳代，在體外培養一年，傳100多代，細胞仍然生長增殖活躍。本發明所述細胞株經檢測，其一般生物學特性表明，所述細胞株為多邊形上皮樣細胞，可成囊球狀懸浮生長，一旦貼壁，也可生長，且貼壁緊密，接觸性生長抑制消失。
圖1為本發明所述細胞株倒置顯微鏡下懸浮生長活細胞像。圖2為本發明所述細胞株倒置顯微鏡下貼壁生長活細胞像。圖3為本發明所述細胞株的染色體的一種影像圖。圖4為本發明所述細胞株的染色體的另一種影像圖。圖5為本發明所述細胞株的電鏡超微結構圖。圖6為本發明所述細胞株種植在NOD-SCID鼠肩胛部皮下移植瘤組織的形態圖。
具體實施例方式為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步描述。實施例1
本發明一種來源於人肺未分化癌的細胞株，按照以下製備方法所得
(1)組織塊機械解離將手術切除的肺癌組織以消毒小剪刀迅速解離到0.5cm3大小，用 100%青-鏈黴素雙抗溶液浸泡移至生物安全櫃，消毒PBS緩衝液反覆清洗組織去除粘液和紅細胞等雜質，再浸泡於培養基中移至解剖顯微鏡下，用兩個10號注射器針頭細心分離肺癌實質組織，儘量去除正常肺泡及支氣管組織和間質組織，得到剩餘的組織；
(2)膠原酶消化在解剖顯微鏡下去除肺癌標本中的間質組織後，使用無菌的解剖刀和剪子把步驟(1)所得的剩餘的組織切成Imm3組織片，用PBS緩衝液清洗組織片。讓組織片沉澱，去除上清液，用無菌解剖刀和剪子把剩餘組織再細切，用PBS清洗組織碎片數次，然後加入膠原酶(50-200單位/ml，溶解在PBS中)，在37°C孵育4_18小時後。在膠乳膠原酶的同時可加入3mM CaCl2,以提高膠原酶對組織的解離效率。通過無菌不鏽鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片；對較大的組織碎片可以加入新鮮的膠原酶進行進一步的解離。消化完全後，收集腫瘤細胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM 培養基中懸浮細胞，進行接種培養，得到存活細胞；
(3)對步驟(2)所得存活細胞進行純化，去除纖維細胞等雜質細胞，純化後的肺癌細胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養基中培養，培養溫度為37°C，氣體環境為5% C02/95%空氣，溼度為飽和溼度，每3天更換一次培養液，每3-5天傳代一次，連續培養並傳代超過12 個月，得細胞株。所述步驟(1)中的肺癌組織，來源於一位59歲女性肺癌病人的左下肺癌病灶。病人在接受手術前未接受任何化療、放療及靶向治療等治療，術中發現肺部腫瘤位於左下肺， 質地脆軟，大量壞死，局部侵潤生長，壁胸膜廣泛轉移。所述步驟(3)中得到的細胞株，於2010年4月1日送達中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO :C201026，命名為人肺癌細胞株0114。實施例2
本發明所述人肺癌細胞株0114的檢測鑑定 1、G6PD同工酶檢測物種來源(由中國典型培養物保藏中心檢測)。本發明所述人肺癌細胞株0114是一株中國南方人肺未分化癌細胞株，來源於一位59歲女性肺癌病人的左下肺癌病灶。病人在接受手術前未接受任何化療、放療及靶向治療等治療，術中發現肺部腫瘤位於左下肺，質地脆軟，大量壞死，局部侵潤生長，壁胸膜廣泛轉移。2、形態觀察
主要觀察細胞的一般形態，如大體形態、核 漿比例、染色質和核仁大小、多少等，以及細胞骨架微絲微管的排列狀態等。2. 1倒置光學顯微鏡觀察
主要在正常生長狀態下觀察細胞的一般形態，如大體形態、核漿比例、粘附特性等。倒置光學相差顯微鏡下觀察本發明所述人肺癌細胞株0114，可見其有兩種生長形態，部分細胞呈懸浮生長，細胞折光性較好，胞漿豐富含有大量折光性物質，部分貼壁生長， 細胞間連接緊密，細胞間界限不清，細胞與平皿之間緊密貼附，不易消化分散；懸浮細胞可以向貼壁細胞轉化，一旦貼壁，便不易再脫落。如附圖1和2所示。2.2投射電鏡觀察
(1)從2.5%戊二醛固定液中取出樣品，用0. 2mol/L PBS(pH7. 4)漂洗3次，每次15min ；
(2)1% OsO4後固定，室溫Ih ；
(3)0. 2mol/L PBS (ρΗ7· 4)漂洗 3 次，每次 15min ；
(4)50%、70%、90%及100%的丙酮逐級脫水，每梯度濃度15min ；
(5)浸透用丙酮樹脂=1:1浸lh，然後用丙酮樹脂=1 2浸2h最後純樹脂浸過夜；
(6)樣品包埋後進行聚合，70°C，24h；
(7)超薄切片，厚度SOnm；
(8)鉛-鈾染色後，上機觀察。電鏡超微結構顯示，本發明所述人肺癌細胞株0114細胞有著令人印象深刻的細胞表面長絨毛，細胞間絨毛交纏，連接緊密。核大，核膜邊緣分布少許異染色質，細胞器以線粒體和內質網較多，線粒體多為斑馬樣線粒體，如附圖5所示。2.3免疫組化檢測細胞標記蛋白
採用S-P法進行免疫組化染色，免疫組化染色S-P試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。所用的抗體為CK7、TTF-I、vimentin、EGFR、VEGF 和 NSE。具體步驟為
(1)待檢測細胞株提前24小時爬片於消毒載玻片上，24小時後，用PBS緩衝液衝洗2 次，冷丙酮固定15分鐘，浸泡於PBS中備用；
(2)取所需玻片加1滴或50μ 1過氧化物酶阻斷溶液(試劑Α)室溫下孵育10分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶的活性；PBS衝洗三次，每次3分鐘；
(3)除去PBS液，每張切片加1滴或50μ 1正常非免疫動物血清(試劑B)，室溫下孵育 10分鐘；
(4)除去血清，每張切片加1滴或50μ 1的第一抗體，室溫下孵育60分鐘；
(5)PBS衝洗三次，每次3-5分鐘；除去PBS液，每張切片加一滴或50μ 1生物素標記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10分鐘；PBS衝洗三次，每次3分鐘；
(6)除去PBS液，每張切片加1滴或50μ 1鏈黴菌抗生物素過氧化酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10分鐘；PBS衝洗三次，每次3分鐘；
(7)除去PBS液，每張切片加2滴或100μ 1新鮮配製的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘；
(8)自來水衝洗，蘇木素復染， PBS或自來水衝洗返藍；
(9)DAB顯色，切片經過梯度酒精脫水乾燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。免疫組化檢測結果判斷方法按細胞著色評分棕褐色3分；棕黃色2分；淡黃色 1分；無著色0分。同樣物鏡下計數陽性細胞數，按陽性細胞的數量評分一個視野內著色細胞>70%為4分；51%-75%為3分；11%_50%為2分；1%_10%為1分；陰性為0分。兩項得分相乘，滿3分為「 + 」 ；4分為「++」 ；5分以上為「+++」。「+ +++」為陽性表達。本發明所述人肺癌細胞株0114的免疫組織化學染色顯示，其與來源於轉移灶腫瘤組織的細胞株有著相似的蛋白表達，其突出的表達特徵為vimentin、CK7和TTF-I均表達陽性。Vimentin是波形蛋白，是一種間質細胞廣泛表達的標記物，CK7和TTF-1則是上皮來源的肺腺癌最常表達的標記物，三者同時表達往往顯示腫瘤開始出現了上皮間質樣轉化 (EMT)的傾向，腫瘤細胞的轉移能力提高，這從側面提示，人肺癌細胞株0114是一株有著較高轉移潛能的細胞株。3、細胞生長增殖
檢測細胞生長曲線、細胞分裂指數、倍增時間、細胞周期時間。3.1 MTT法測定細胞生長增殖和對藥物的敏感性
(1)取96孔細胞製備板，每孔中加0.Iml含2X IO4 IOXlO4靶細胞的製備液(含10% 小牛血清的DMEM製備液)，在37°C 5% C02的飽和水汽二氧化碳製備箱中製備2_3小時，讓細胞貼壁；
(2)用DMEM製備液0.1 100倍遞次配置藥物，每孔加0. Iml稀釋的藥物和待檢細胞， 每個稀釋度3個重複孔。對照孔9個3個陽性對照孔，每孔加0. Iml含1000倍藥物的DMEM 製備液和細胞，3個陰性對照孔，每孔加不含藥物的0. Iml DMEM製備液和細胞，3個空白對照孔，每孔加0.1ml DMEM製備液，不加細胞。在37°C 5% CO2的飽和水汽二氧化碳製備箱中製備24 48小時或預定的時間；
(3)吸去製備液，用PBS洗滌一次(如為懸浮細胞，應在吸去上清液前離心製備板)；
(4)每孔加0.Iml PBS和10 μ 1 MTT染液，在37°C 5% CO2的飽和水汽二氧化碳製備箱中製備4 6小時；
(5)每孔加0.Iml酸化異丙醇，也可用含10% SDS的lOmmol/L HCl代替酸化異丙醇， 在振蕩器上振蕩混勻，讓還原產物充分溶解。置酶聯檢測儀上測定光密度(OD)值，檢測波長570nm，參考波長630nm。以OD值對樣品稀釋度作圖，比較標準曲線和待測樣品曲線即可求得待測樣品中細胞因子的含量。3. 2細胞流式細胞儀檢測細胞周期與凋亡
流式細胞儀是美國BECKMAN-COULTER(貝克曼-庫爾特)公司生產。機器型號ELITE， 雷射波長488nm，功率15麗。取IO6已固定的細胞，用PBS洗兩遍，去上清後加入300 μ 1 DNA染液(內含碘化丙啶100 μ g/ml和RNase 20單位/ml)，室溫30min。上機雷射管預熱30min後用螢光微球(美國BECKMAN-COULTER公司)調整儀器，使各放大器接收的信號的 HCV值<2%，收集12000個細胞，DNA周期分析用美國ΡΗΕ0ΝΙΧ公司的MULTYCYCLE軟體，最後計算出細胞各期的百分數。另外，細胞凋亡是用儀器自帶軟體處理，直接得出細胞的凋亡率。本發明所述人肺癌細胞株0114的體外倍增時間為42. 685h。4、細胞核型分析
檢測核型特點，染色體數量、標記染色體的有無、帶型等。4. 1準備秋水仙鹼(秋水仙素)，生理鹽水配製成10 μ g/ml濃度，15磅20分鐘滅菌，分裝，置_20°C ；低滲液0. 35% KCl ；固定液(Carnoy固定液)甲醇冰乙酸(3 :1)，臨時配製；Giemsa工作液1份原液和10份磷酸緩衝液，臨時配製。4. 2秋水仙素處理終止製備前2-4小時，在製備液中加入秋水仙鹼(用Iml注射器5號針尖滴加2滴，使終濃度為0. 07 μ g/ml )。4. 3染色體製備
(1)收集細胞將製備物全部轉入潔淨離心管中，以IOOOrpm離心8-10分鐘，棄上清
液；
(2)低滲處理向刻度離心管中加入預溫37°C的低滲液8ml，用滴管混勻，置37°C恆溫水浴中低滲15-25分鐘；
(3)預固定低滲後加入0.5ml固定液，輕輕混勻後IOOOrpm離心8—10分鐘；
(4)一固定棄上清液，加入5ml固定液，輕輕混勻，靜置20分鐘；IOOOrpm離心，棄上清
液；
(5)二固定、三固定同一固定；
(6)制懸液棄上清液後，視細胞數量多少加入適量固定液製成細胞懸液；
(7)滴片吸取細胞懸液自10-20cm高滴在一張乾燥潔淨的載玻片上，輕吹散，氣幹；
(8)染色110 Giemsa染色5-10分鐘，細水洗去多餘染液，氣幹；
(9)鏡檢低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，油鏡下觀察染色體形態並計數。本發明所述人肺癌細胞株0114的染色體數較其他的肺癌細胞株少，對50個分裂期的細胞進行的記錄分析，染色體數從40條-52條，染色體中位數為46條，多為亞二倍體。 未發現標記染色體，如附圖3和4所示。5、異體動物接種
向異體動物體內接種細胞懸液，觀察成瘤能力。採用皮下注射的方法，注射時用左手拇指及食指輕輕捏起皮膚，右手持注射器將針頭刺入，固定後在小鼠背部或前肢腋下進行注射。 IO6個本發明所述人肺癌細胞株0114細胞種植在5隻4周齡的NOD-SCID鼠肩胛部皮下，第3周種植部位均出現直徑約2mm的移植瘤，2個月後，瘤體增大到1. 2cm，麻醉後處死動物，移植瘤組織經包埋切片HE染色，形態如附圖6所示，細胞體積巨大，核大，核仁明顯，與來源的病人組織相似。最後所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護範圍的限制，儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和範圍。
權利要求
1.一種來源於人肺未分化癌的細胞株，其特徵在於，命名為人肺癌細胞株0114，保藏號為 CCTCC NO :C201026。
2.如權利要求1所述的來源於人肺未分化癌的細胞株，其特徵在於，所述細胞株在電鏡下觀察顯示，細胞表面長絨毛，細胞間絨毛交纏，連接緊密，核大，核膜邊緣分布有異染色質，細胞器以線粒體和內質網較多，線粒體多為斑馬樣線粒體。
3.如權利要求1所述的來源於人肺未分化癌的細胞株，其特徵在於，所述細胞株在倒置顯微鏡下觀察有兩種生長形態，一種為懸浮生長，細胞折光性較好，胞漿豐富，含有大量折光性物質，一種為貼壁生長，細胞間連接緊密，細胞間界限不清，細胞與平皿之間緊密貼附，不易消化分散；懸浮細胞可以向貼壁細胞轉化，一旦貼壁，便不易脫落。
4.如權利要求1所述的來源於人肺未分化癌的細胞株，其特徵在於，所述細胞株的體外倍增時間為42. 685h。
5.如權利要求1所述的來源於人肺未分化癌的細胞株，其特徵在於，所述細胞株的蛋白表達特徵為vimentin、CK7和TTF-I均表達陽性。
6.如權利要求1所述的來源於人肺未分化癌的細胞株，其特徵在於，所述細胞株的染色體數為40-52條。
7.一種來源於人肺未分化癌的細胞株的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)組織塊機械解離將切除的人肺未分化癌組織解離，清洗去除雜質，分離肺癌實質組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質組織，得到剩餘的組織；(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩餘的組織切成組織片，清洗，然後向組織片加入膠原酶，孵育，過濾，然後收集腫瘤細胞，進行接種培養，得到存活細胞；(3)對步驟(2)得到的存活細胞進行純化，去除纖維細胞等雜質，純化後的肺癌細胞連續培養並傳代大於12個月，即得細胞株。
全文摘要
本發明公開一種來源於人肺未分化癌的細胞株，所述細胞株命名為人肺癌細胞株0114，保藏號為CCTCCNOC201026。所述細胞株是從病理類型為未分化癌的肺癌病人肺部腫塊切除物中製備所得，具有典型的腫瘤細胞生物學特性，能在體外連續長期傳代。同時，本發明還公開了所述細胞株的製備方法。
文檔編號C12N5/09GK102424815SQ20111045730
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月31日 優先權日2011年12月31日
發明者何建行, 李慧靈 申請人:何建行, 廣州呼吸疾病研究所, 李慧靈