環境友好的高靈敏電化學發光檢測方法
2023-05-30 13:48:51
專利名稱：環境友好的高靈敏電化學發光檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種環境友好的高靈敏電化學發光檢測技術領域。
背景技術：
電化學發光是化學發光與電化學方法相互結合的產物，是指通過電化學方法產生一些特殊的物質，然後這些電生物質之間或電生物質與其它物質之間進一步反應而產生的一種發光現象。電化學發光分析法的靈敏度高，線性範圍寬，可控性強，選擇性好，裝置簡單，日益受到人們的關注。1927年，人們發現對Grignard化合物施加電位可產生發光。1929年Harvey在鹼性溶液中電解魯米諾時，發現在陰極及陽極上都有發光現象，揭開了電化學發光研究的序幕。八十年代發現吡啶釕電化學發光可用於草酸、胺類化合物、胺基酸、NADH、丙酮酸的測定以及吡啶釕的超靈敏測定。在此期間，電化學發光開始與流動注射分析(FIA)、高效液相色譜(HPLC)和毛細管電泳(CE)等分離技術聯用，提高了發光信號的重現性和穩定性，為其實際應用打下了良好的基礎。九十年代，電化學發光開始用於免疫分析、PCR分析和DNA的單分子檢測。目前研究和應用最廣泛的是吡啶釕電化學發光體系，因為它具有水溶性好、發光效率高、性能穩定以及電化學可逆等突出優點。
吡啶釕電化學發光分析是新一代標記免疫分析和核酸測定技術。現有技術是基於濃度高達100mM左右的三丙胺與較低濃度的吡啶釕標記物發生電化學發光反應來進行生物分析，是少數幾個被應用於實際測定的電分析技術之一。但是吡啶釕/三丙胺電化學發光體系存在以下主要不足之處。第一、三丙胺在電極上氧化速度較慢，導致電化學發光強度較低，限制了檢測的靈敏度；第二、需要很高濃度的三丙胺才能實現高靈敏檢測；第三、三丙胺在中性溶液中溶解度不太好，一般要採用很高濃度的磷酸鹽才能使高達100mM的三丙胺在中性磷酸鹽緩衝溶液中溶解；最後，三丙胺揮發性較大，具有較大的異味和一定的毒性。因此迫切需要尋找比三丙胺具有更加優異性質的物質。
吡啶釕不僅可以與三丙胺發生電化學發光反應，還可以與大量的其它胺類物質發生電化學發光反應。目前，人們主要研究了以下兩種情況下吡啶釕/胺類物質電化學發光規律。第一種情況是吡啶釕濃度接近或高於胺類物質的濃度。這種情況下，胺的結構對電化學發光的影響的研究較多也比較系統。此時，吡啶釕電催化氧化胺對電化學發光貢獻很大，而且通常含有吸電子基團的類發光較弱。第二種情況是吡啶釕的濃度遠遠低於胺的濃度。目前僅有一篇文獻(J.Electrochem.Soc.1990，137，3127)粗略比較了幾種胺的電化學發光強度，但沒有總結出發光規律。該文發現三丙胺的電化學發光強度優於其它的幾種胺，而且吡啶釕/三丙胺電化學發光體系可以用於免疫分析。隨後多篇文獻對吡啶釕/三丙胺體系的電化學發光機理進行了深入的研究。發現在吡啶釕的濃度遠遠低於三丙胺的濃度的情況下三丙胺在電極上的直接電化學氧化起著非常重要的作用(Anal.Chem.2000，72.3223)，吡啶釕電催化氧化三丙胺對電化學發光貢獻相對較小。通過加入表面活性劑等促進三丙胺在電極上的直接電化學氧化可以增強電化學發光強度。
發明內容
本發明的目的是提供一種發光強度更大，更加靈敏，對環境更加友好的電化學發光方法，提供應用於免疫電化學發光分析及其他重要物質分析的方法。
本發明是一種環境友好的高靈敏電化學發光檢測方法，該發光體系是以釕的絡合物為發光物質，以胺為共反應物，以表面活性劑為改良試劑，在緩衝溶液中混合，用電化學方法激發發光進行分析，其特徵在於共反應物胺的基本結構為(R1)(R2)N(R3)，其中R1，R2，R3為帶二到五個碳的烷基，而且至少一個烷基上帶有羥基、羧基、胺基或磺酸基；本發明所述的釕的絡合物的配體為聯吡啶、鄰菲咯啉或它們的衍生物；本發明所述的(R1)(R2)N(R3)至少一個烷基上帶有羥基的是二正丁基乙醇胺；本發明所述的改良試劑為表面活性劑，如曲拉通X-100、吐溫-20或十二烷基磺酸鈉；本發明所述的胺其使用濃度範圍為0.05-50mM；本發明所述的緩衝溶液為pH在5-9的磷酸鹽緩衝溶液或硼酸鹽緩衝溶液；
本發明所述電位範圍為1.1-1.5V。
本發明的突出優點是該體系發光效率高、靈敏度高、線性範圍寬、共反應試劑濃度低、環境友好、重現性好和試劑穩定。利用該體系檢測物質的線性範圍寬，檢測限低，可廣泛應用於免疫分析、核酸分析。吡啶釕濃度很低且二正丁基乙醇胺的濃度僅為20mM的情況下，就可以實現比採用三丙胺更加靈敏的檢測，相同條件下在金電極上吡啶釕/二正丁基乙醇胺甚至比吡啶釕/三丙胺電化學發光的強度強10倍以上，在鉑電極上強30倍以上。
附圖1是利用吡啶釕/二正丁基乙醇體系電化學發光測定吡啶釕含量的示意圖。
附圖2是pH對吡啶釕/二正丁基乙醇體系電化學發光的影響示意圖。
附圖3是二正丁基乙醇的濃度對吡啶釕/二正丁基乙醇體系電化學發光的影響示意圖。
附表說明表1是帶有不同結構或功能團的各種胺與吡啶釕組成的電化學發光體系的發光強度對比。
具體實施方式
實施例1固定二正丁基乙醇胺濃度為25mM，緩衝溶液為pH7.5的0.1M磷酸鹽，加入1fM的吡啶釕，以金為工作電極，施加1.35V的階越電位，同時施加適當發光檢測高壓，利用發光信號檢測吡啶釕，重複測定三次，得到吡啶釕發光信號的平均強度為47.41。
實施例2固定二正丁基乙醇胺濃度為0.05mM，吡啶釕濃度為1μM，緩衝溶液為pH5的0.1M磷酸鹽，以金為工作電極，施加1.5V的階越電位，同時施加適當發光檢測高壓，利用發光信號檢測吡啶釕，重複測定三次，得到的發光信號平均強度為52.4。
實施例3固定二正丁基乙醇胺的濃度為1mM，吡啶釕濃度為1mM，溶於pH9的的0.1M磷酸鹽緩衝溶液中，以金為工作電極，電極電位從0V循環伏安掃描至1.1V，同時施加適當的發光檢測高壓，重複測定三次，得到的發光信號平均強度為1.26×106。
實施例4固定二正丁基乙醇胺濃度為10mM，吡啶釕濃度為1μM，緩衝溶液為pH9的0.1M硼酸鹽，以金為工作電極，施加1.5V的階越電位，同時施加適當發光檢測高壓，利用發光信號檢測吡啶釕，重複測定三次，得到的發光信號平均強度為1.1×106。
實施例5固定吡啶釕濃度為1μM，緩衝溶液為pH7.5的0.1M磷酸鹽，加入含有不同結構或功能團的各種胺，固定胺的濃度為25mM。以金為工作電極，測定方法同實施例1，每種胺重複測定三次，其平均結果見下面表格1。
權利要求
1.一種環境友好的高靈敏電化學發光檢測方法，該發光體系是以釕的絡合物為發光物質，以胺為共反應物，以表面活性劑為改良試劑，在緩衝溶液中混合，用電化學方法激發發光進行分析，其特徵在於共反應物胺的基本結構為(R1)(R2)N(R3)，其中R1，R2，R3為帶二到五個碳的烷基，而且至少一個烷基上帶有羥基、羧基、胺基或磺酸基。
2.根據權利要求1所述的電化學發光檢測方法，其特徵在於所述的釕的絡合物的配體為聯吡啶、鄰菲咯啉或它們的衍生物。
3.根據權利要求1、或2所述的電化學發光檢測方法，其特徵在於所述的(R1)(R2)N(R3)至少一個烷基上帶有羥基的是二正丁基乙醇胺。
4.根據權利要求1、2、或3所述的電化學發光檢測方法，其特徵在於所述改良試劑為表面活性劑，如曲拉通X-100、吐溫-20或十二烷基磺酸鈉。
5.根據權利要求1、2、3或4所述的電化學發光檢測方法，其特徵在於所述的胺其使用濃度範圍為0.05-50mM。
6.根據權利要求1至5任意一個權利要求所述的電化學發光檢測方法，其特徵在於所述的緩衝溶液為pH在5-9的磷酸鹽緩衝溶液或硼酸鹽緩衝溶液。
7.根據權利要求1至5任意一個權利要求所述的電化學發光檢測方法，其特徵在於所述電位範圍為1.1-1.5V。
全文摘要
本發明屬於一種環境友好的高靈敏電化學發光檢測技術領域。該電化學發光體系以釕的絡合物為發光物質，以胺為共反應物。它具有發光強度大、靈敏度高、線性範圍寬、環境友好、重現性好和試劑穩定的優點。它可廣泛應用於免疫分析和核酸分析。
文檔編號G01N21/76GK1696666SQ200510016848
公開日2005年11月16日 申請日期2005年6月3日 優先權日2005年6月3日
發明者徐國寶, 劉曉慶, 史立紅 申請人:中國科學院長春應用化學研究所