從中藥中篩選胰脂肪酶抑制劑的方法
2023-05-30 13:52:06
專利名稱：從中藥中篩選胰脂肪酶抑制劑的方法
技術領域：
本發明涉及從中藥中篩選胰脂肪酶抑制劑的方法。
技術背景肥胖是指由於能量攝入超過消耗，導致體內脂肪積聚過多而造成的疾病。據世界衛生組織統計全球肥胖症患者達3億人，其中兒童 佔2200萬人，11億人體重過重。肥胖與多種疾病的發生相關，是糖 尿病、心腦血管病、高血壓、胰島素抵抗、膽結石、某些癌症的危險 因素，此外，由此帶來的健康問題還包括生殖與性功能障礙、負重關 節的疾病、精神失常、意外傷害。因此，肥胖已成為全球性的公共衛 生問題。隨著肥胖發病率的日益增高，迫切需要新的、有效的且安全 的治療手段幫助肥胖患者減輕並進一步維持體重，同時降低與肥胖相 關的心血管疾病方面的危險因素。目前國際上減肥藥物的開發主要依據兩個原理抑制食慾和減少 脂肪吸收。其中，後者可以在維持正常飲食的前提下達到控制體重的 目的。來自飲食的脂肪酸有50%-70%是通過胰脂肪酶的水解作用產生 的[1]，因此胰脂肪酶在脂肪的吸收方面具有重要的作用。胰脂肪酶抑 製劑能通過減少飲食中的脂肪吸收，減少人體的熱量攝入，達到控制 體重的目的，並進一步減少與肥胖伴發的疾病危險因素發生的可能性。 這類藥物的代表產品是賽尼可，這類產品可以抑制大約30%攝入脂肪 的吸收。[1] F Carriere, J A Barrowman， R Verger et al . Secretion and contribution to lipolysis of gastric and pancreatic lipases during a test meal in human [ J〗.Cflsfroe/^er0/0^7， 1993， 105(3): 876-88
中藥是以中醫理論為基礎，用於防治疾病的物質的總稱，其來源 有植物藥、動物藥、礦物藥，中藥具有二千多年臨床用藥歷史，是人 類經過了自身長期的篩選所積累的寶責資源，研究表明， 一個羊味中 藥的化學成分數以百計，中藥是一個數量龐大，資源豐富的天然的混 合化合物庫.但中藥往往成分複雜，作用機理不明確，基於胰脂肪酶 對於脂肪吸收的重要性，通過建立胰脂肪醉抑制劑篩選模型，以中藥 提取物庫為對象進行篩選，是開發療效明確、機理清楚的減肥新藥的 一條可行途徑。發明內容本發明的目的是提供用於從中藥中篩選胰脂肪醉抑制劑的篩選方法。因此，本發明涉及一種從中藥中篩選胰脂肪酶抑制劑的方法，其包括a. 將胰脂肪酶採用固相包被方法包被在酶標板上；b. 洗滌後加入活化劑孵育一定時間使酶活化；c. 洗塗後加入中藥提取物樣品孵育一定時間；d. 洗滌後加入底物試卣靈甘油酯反應一定時間，利用酶標儀測定 反應一定時間後生成的終產物試卣靈(r^ori;/7/z)的螢光強度，該產 物具有螢光，EX-572nm， EM-590nm，通過與對照孔螢光強度的對比， 計算樣品對胰脂肪酶的抑制率。與常規的均相篩選方法比較，本發明採用固相包被和加樣孵育後 進行洗滌的方法，可大大減少假陽性結果的產生。例如，避免樣品對 底物影響造成的假陽性。具體講，在胰脂肪酶催化脂類底物水解時， 其通過吸附在乳化底物的脂-水界面上改變了自身的結構，從無活性的 關閉構象轉變為具有催化活性的開放構象，酶的催化位點暴露出來與 底物結合。採用常規的均相篩選方法時，當體系中存在具有表面活性的物質時，這些物質覆蓋在底物表面，妨礙了胰騰肪醉吸附到脂-水界 面，最終導致底物水解的減少。這類具有表面活性的物質在中藥提取 物中廣泛存在，如皂苷、長鏈脂肪酸等，會造成假陽性的篩選結果， 同時也可減少樣品對酶反應幹擾造成的假陽性。具體講，中藥樣品的 特點是成分、濃度都不明確。在常規的均相篩選體系中樣品中存在的 多種物質可能通過非特異吸附、自身螢光對檢測結果的幹擾等因素導 致陽性結果.採用固相包被方法，將樣品與固定化的酶孵育一定時間 後洗滌，可以除去不與酶結合或與酶結合力弱的物質，從而減少對酶 反應的影響，減少假陽性。進一步講，本發明除了可以應用在胰脂肪酶抑制刑的篩選之外， 對脂蛋白脂酶、磷脂酶等作用於非水相底物的脂水解酶，由於它們普 遍存在界面活化的催化特性，因此本發明對建立這類酶抑制刑篩選模 型具有指導意義。
圖1 胰脂肪酶SDS-PAGE電泳圖謙(箭頭處為純化樣品)圖2 均相反應體系中胰脂肪酶的標準曲線圖3 不同酶包被濃度下的反應結果圖4 TT對酶反應的影響圖5 陽性對照賽尼可在酶的活化與非活化狀態下對酶反應的抑制圖6 均相反應體系的篩選結果圖7 固相包被體系的篩選結果具體實施方式
實施例1從中藥中篩選胰蛋白酶抑制劑 實驗材料胰脂肪酶本實驗室克隆、表達及純化。純度達95%， SDS-PAGE電泳 圖謙見圖1。
標準品購自sigma反應底物試由靈甘油酯(人W/c"o-J-^7i/"r/c sc/(/ re5"on//7/7 e"er)， 購自sigma陽性對照賽尼可(/e/ /ca/) Roche公司產品固相栽體Costar96孔酶標板實驗儀器酶標儀Perkin-Elmer HTS7000 plus 洗板機Biorad 1575 恆溫培養箱上海精宏DNP-9082 全自動加速溶劑萃取儀Dionex ASE-300 真空冷凍離心乾燥儀Thermo Savant SVC 100H 高速中藥粉碎機浙江大鵬LD-02實施步驟酶反應的檢測方法底物試面靈甘油酯(簡稱RES)以二氧六環溶解，lmg/ml凍存於 -20t;。在檢測胰脂肪酶活性時，將RES母液以TN緩沖液(50mMTris， 150mMNaCl， pH8. 5 )配製為終濃度4 m g/ml，加入不同的酶量，最終 反應體積50nl/孔，37C反應45分鐘。在酶標儀上測定焚光強度， EX=570nm， EM=590nm。圖2為在該反應條件下均相反應體系中檢測的狹脂肪酶的標準曲 線。由曲線可見，當胰脂肪酶濃度在10nmol/l範圍內，它與產物螢光 強度之間有良好的線性關係(R-O. 999 )。在該線性範圍內，螢光強度 正比於酶濃度，可根據樣品孔的螢光強度計算樣品對酶反應的抑制率。篩選模型的建立 包被條件包被濃度的選擇依據是保證包被在酶標板上的酶量達到 一 定程 度，能滿足酶反應生成的產物的螢光強度值達到必要的靈敏度；同時 包被的酶量應在標準曲線的線性範圍內。以TN緩衝液為包被液，在25X:以不同濃度的狹脂肪酶包被lhr，將酶標板置於洗板機以TN緩沖 液洗滌，加入底物反應檢測螢光強度.採用不同濃度的睞進行包被， 測定的包被曲線見圖3,可見，當酶濃度為8Mmol/l時，包被巳近飽 和。選擇以4jamo1/1為包被濃度，根據圖2胰脂肪酶的標準曲線，根 據檢測的螢光強度可換算得到包被在酶標板上的具有活性的酶為 6.56nmo1/1。 活化條件在均相反應體系中，胰脂肪酶首先通過與底物脂-水界面的作用實 現活化，即完成向活性構象的轉變，然後對底物進行催化.在固相包 被法中，由於酶與樣品的孵育獨立於酶催化底物水解的反應過程，因 此在酶與樣品孵育過程中必須先實現酶的活化，這樣才能保證樣品與 具有活性構象的酶作用。選擇以三油酸甘油酯(簡稱TT )為活化劑研究.其對酶反應的影響， 將不同濃度的TT加入到經過洗滌的已包被胰脂肪醃的醉標板中，25 x:孵育io分鐘，洗滌後加入底物反應，檢測螢光強度，結果見圖4。 可見在低濃度時，TT對RES的水解具有促進作用，該作用是由於TT 形成的脂-水界面對胰脂肪酶的活化；在高濃度時TT對酶反應表現出 抑制作用，這是由於TT作為胰脂肪酶的底物，對RES的水解具有竟爭 性抑制作用。在固相包被板上，以5.5nmo1/1 TT或TN緩沖液為活化 劑對酶進行活化，洗滌後加入陽性對照賽尼克在251C孵育20分鐘， 研究其對酶反應的抑制，結果見圖5。可見當採用TT為活化劑時，胰 脂肪酶轉變為活性構象，催化位點處的絲氨酸被奉露出來，因此賽尼 可能夠與之結合[21，從而抑制酶反應。[2] Kyeong K K， Hyun K S， Dong H S et al The crystal stru cture of a tricylglycerol lipase from Pseudomonas cepacia reveals a highly open conformation in the absence of a bound inhibitor [ J ] . 57ri/"z/re， 1997， 5(2): 173-185中藥樣品的製備U)取5g中藥材，置於中藥粉碎機中粉碎15秒；(2) 將粉碎中藥與10g聚耽胺、10g硅藻土混勻，加入到加速溶刑萃 取儀提取罐中，用80W乙醉在81C、 1500psi提取13分鐘；(3) 將提取液分裝於5ml離心管中，置於真空冷凍離心乾燥儀中濃縮 至幹，稱重；(4) 將樣品以2.5mg/ml溶於含2%DMS0的TN緩衝液中，離心收集上 清，500nl/管分裝；(5 )取上清液500^1至15ml試管中，加入10ml石油鍵(沸程30-60 X:)，強烈振搖後靜置20分鐘，取下相重複上述操作3次；(6)將下相轉移至lml離心管中，在40C水浴中加熱20分鐘，樣品 於-20iC保存備用。中藥樣品的篩選 實驗步驟(1) 包被酶濃度4Mmo1/1，包被緩沖液TN，包被量50pl/孔，25"C 包被l小時，TN洗板；(2) 在包被板上50|a 1/孔加入5.5nmo1/1 TT， 25X:活化10分鐘， TN洗板；(3) 在包被板上50y 1/孔加入待測樣品，每個樣品3個復孔，25X: 孵育20分鐘，TN洗滌；同時每板均設定陰性對照(2%DMS0的TN緩沖 液)和陽性對照賽尼可(0. Olmg/ml,溶於2%DMS0的TN緩衝液)。(4 )在包被板上50 u 1/孔加入底物RES 4 m g/ml， 37tl反應45分鐘， 分別測定O分鐘和45分鐘的螢光強度FI，計算抑制率，抑制率^50% 為陽性。t 樣品孔45分鐘-樣品孔O分鐘、抑制率=1---^^;;;-;;^^——X J 。 ％對照孔45分鐘-W對照孔O分鐘篩選結果製備5 0種中藥樣品，按上述中藥樣品篩選所述步壤測定狹脂肪酶 抑制率；同時，採用相當於實際包被在酶標板上的胰脂肪酶濃度 (6.56nmo1/1)，採用固相包被篩選方法同樣的反應條件，但在均相
反應體系中，測定同樣樣品的胰脂肪酶抑制率，結果見困6和困7, 由圖6和圖7可見，在均相體系中樣品的陽性率非常高(抑制率250% 樣品18個)，大大髙於在固相包被體系中的陽性率(抑制率)250% 樣品2個)。由此可見，在胰脂肪酶這類需要界面活化的酶的抑制刑篩選中， 以中藥提取物為篩選對象時，採用固相包被方法可以減少陽性率。根 據我們的分析，這些陽性結果中包括表面活性物質、非特異性物質等 造成的假陽性結果，實施例1樣品葉下珠，採用上述篩選模型，在提取物濃度為2.5mg/ml時檢 測其抑制率為84%。復篩檢測其IC50為1. 5mg/ml。採用糞便總脂重量法在動物水平檢驗樣品對胰脂肪醉的抑制活 性。選擇體重為200 ± 20g的SD大鼠分為3組，每組8隻。禁食3h 灌胃2ml高脂乳劑後，陰性對照、陽性對照和樣品組分別灌胃2ml生 理鹽水、塞尼可和樣品，收集48h內的所有糞便。將糞便在60t:烘乾 研磨後，取500mg加入10ml30yt酸在沸水浴中處理15min，冷卻後加 入乙醚萃取，取上層乙醚萃取液在60X:揮幹並稱重，換算得到糞便中 含有的未吸收總脂含量。通過測定陰性對照和樣品組糞便中的總脂含 量，計算各自糞便中未吸收總脂佔給入總脂的百分含量1%，評價樣品 對胰脂肪酶的抑制活性。在10mg/kg劑量條件下，賽尼可和葉下珠提 取物的1%分別為36. 5%和16. 3%。這證明採用上迷基於固相包被的篩選模型，從中藥中篩選胰脂酶 抑制劑是有效和可靠的。該篩選模型為開發減肥藥物提供了一個很好 的技術平臺。
權利要求
1.一種從中藥中篩選胰脂肪酶抑制劑的篩選方法，其包括a.將胰脂肪酶採用固相包被方法包被在酶標板上；b.洗滌後加入活化劑對酶進行活化；c.洗滌後加入中藥提取物樣品進行孵育；d.洗滌後加入底物孵育；e.測定反應一定時間後的螢光強度變化，計算樣品的抑制率。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於採用一定濃度的三油 酸甘油酯對固相包被的狹脂肪酶進行活化.
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於對酶進行活化後，經 洗滌後再加入樣品孵育。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於加入中藥提取物樣品 孵育一定時間後，經洗滌後再加入底物反應。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於以試囟靈甘油醋為底 物，以572nm波長光激發，在590nm波長處檢測螢光。用酶標儀測定 反應一定時間後樣品孔和對照孔的螢光強度變化，計算中藥樣品對胰 脂肪酶的抑制率。
全文摘要
本發明公開了從中藥中篩選胰脂肪酶抑制劑的篩選方法。該方法採用固相包被方法，將胰脂肪酶包被在微孔酶標板上；通過加入活化劑，確保胰脂肪酶轉化為具有活性的開放構象；洗滌後加入中藥提取物樣品孵育，洗滌除去不結合或結合力弱的物質；洗滌後加入底物在一定條件下反應，測定生成產物的螢光強度，計算樣品的抑制率。本方法可用於中藥提取物樣品的篩選，可以減少樣品中表面活性物質、非特異性物質等造成的假陽性結果，提高篩選命中率。
文檔編號C12Q1/25GK101131389SQ20061011169
公開日2008年2月27日 申請日期2006年8月22日 優先權日2006年8月22日
發明者於軍平, 餘琴芳, 芳 馮, 周天浩, 廖玉華, 柴嬰蕾, 殷秀飛, 汪家權, 洪孟學, 柳 胡, 蓮 薛, 趙民軍 申請人:浙江養生堂天然藥物研究所有限公司