活性汙泥中總dna的液氮研磨改良式提取方法及其應用的製作方法

2023-05-30 12:12:11

活性汙泥中總dna的液氮研磨改良式提取方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了種活性汙泥中總DNA的液氮研磨改良式提取方法及其應用。充分利用液氮研磨的優勢，改良SDS的DNA提取法，並應用到高鹽度採油廢水生物處理系統的活性汙泥DNA的高效提取中。該方法主要利用液氮研磨對傳統SDS法進行改良，利用液氮速凍並研磨細化的方法有效分離所需DNA片段，再應用SDS溶液對傳統的Tris-HCl緩衝液、乙酸鈉和EDTA進行改良優化，高效溶解分離樣品的核酸、蛋白質等雜質，完成高鹽度採油廢水淨化系統中活性汙泥的DNA高效提取。該方法具有分離純化程度高，運行操作過程簡單且穩定，避免了高鹽度含油廢水對提取過程的影響，同時，該方法對高鹽度含油背景下汙泥中多種不可預知雜質均有良好的分離功能。
【專利說明】活性汙泥中總DNA的液氮研磨改良式提取方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於環境科學領域，特別涉及一種活性汙泥中總DNA的液氮研磨改良式提取方法及其應用。
【背景技術】
[0002]採油廢水是採油終端在開採石油的過程中所產生的廢水，通常是石油產量的10倍，是一類高鹽、高油和高PH值的汙水，有機物組成複雜，其中有機成分多達六十幾種，其中以酚和烴類為主，同時富含無機鹽而且還含有腐殖酸、表面活性、殺菌劑、揮發酚和苯、多環芳烴，以及促使油水分離的一些化學處理藥劑。這類廢水必須要經過處理達標後才能排放。
[0003]採用傳統的生物法對採油廢水進行處理由於其運行費用低，操作簡便等特點而被廣泛的應用。採油廢水的生物處理法通常對採油廢水處理的生物處理法可分為:活性汙泥法、生物膜法、生物接觸氧化池、氧化塘等。活性汙泥法是在處理可生物降解的汙水中最常見的技術，該方法對廢水的處理可分為生物和物理兩個階段，在生物階段主要是活性汙泥中的微生物降解廢水中的有機物、銨鹽和磷酸鹽等物質。在該技術中對處理效果起關鍵性作用的就是活性汙泥中微生物的活性，而微生物的活性又由活性汙泥中微生物的群落結構和特徵所決定。活性汙泥中的微生物群落很豐富，主要由細菌、真菌、古菌、放線菌、藻類、原生動物和後生動物等構成。有研究表明，在一般工藝構築物中，主要的真菌菌群假絲酵母屬、鐮孢黴屬、 麴黴屬在不同的季節相對較穩定，在冬季和夏季都會出現；葡萄穗黴屬只出現在夏季的厭氧池中；夏季活性汙泥中細菌種群豐度比冬季高，好氧池的主要菌群是:DRC31、紅桿菌目和乳桿菌目，厭氧池的主要菌群是:根瘤菌目、熱袍菌目和放線菌目。冬季好氧池的主要菌群分別是:梭菌目、擬桿菌目和DRC31 ;假單胞菌目、乳酸桿菌目和紅螺菌目；假單胞菌目、紅螺菌目、乳酸桿菌目。冬季厭氧池的主要菌群為:紅螺菌目、放線菌目和DRC31。綠彎菌門中的DRC31為該採油廢水處理系統活性中的特徵菌。因此，細菌是活性汙泥廢水處理系統中有機物、銨鹽和磷酸鹽等物質有效去除的重要保障。然而，由於採油廢水成分複雜，水質水量變化大，特別是其高含鹽和高溫的特點，會在一定程度上抑制微生物的生長，是採油廢水生物處理的重要瓶頸。因此，對細菌的菌種鑑定、篩選和基因工程菌的合成中，DNA的高效提取為其關鍵技術。採用液氮研磨改良的十二烷基苯磺酸鈉(SDS)法開展菌種DNA提取研究，利於分析採油廢水處理系統活性汙泥中細菌、真菌在種類和數量上的變化。研究結果可為後續活性汙泥篩選高效除油菌株、構建高效除油複合菌群提供理論依據，同時對指導實際生產運行具有重要意義。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種活性汙泥中總DNA的液氮研磨改良式提取方法及其應用。
[0005]本發明的思路:充分利用液氮研磨的優勢，改良SDS的DNA提取法，並應用到高鹽度採油廢水生物處理系統的活性汙泥DNA的高效提取中。
[0006]本發明的機理:利用液氮研磨對傳統SDS法進行改良，利用液氮速凍並研磨細化的方法有效分離所需DNA片段，再應用SDS溶液對傳統的Tris-HCl緩衝液、乙酸鈉和EDTA進行改良優化，高效溶解分離樣品的核酸、蛋白質等雜質，完成高鹽度採油廢水淨化系統中活性汙泥的DNA高效提取。
[0007]具體步驟為:
(I)均勻取得目標DNA來源體活性汙泥20-30mL，該活性汙泥的汙泥沉降比為20~30%，置於IOOmL離心管中，以6000~8000r/min的轉速進行離心預處理10~15min,棄去上清液,過濾收集沉澱物質置於50-60°C環境下烘乾，製得樣品備用。
[0008](2)將步驟(1)製得的樣品等量加入到乾燥研缽中，向研缽中加入5(T100mL液氮，待液氮蒸發剩餘25-5Oml時敲碎樣品，液氮即將蒸發完時再次加入25飛Oml液氮，然後進行快速研磨預處理，製得粉末樣品，再快速分裝入2mL的離心管中備用。
[0009](3)向步驟(2)製得的粉末樣品中加入600~800 μ L預熱至65~75°C的DNA提取緩衝液，然後在65~75°C下水浴處理3(T40min後製得樣品備用；水浴處理期間每隔2~3min顛倒混勻一次；所述DNA提取緩衝液含有4(T60mmol/L的Tris_HCl、2(T30mmol/L的乙酸鈉、l(T20mmol/L的EDTA和質量百分比濃度為I~3%的SDS，並使用0.1-0.5mol/L的HCl稀溶液和0.1-0.5mol/L的NaOH稀溶液調節DNA提取緩衝液的pH值至8.0。
[0010](4)在步驟(3)獲得的樣品離心管中加入等體積的體積比為1:1的Tris飽和酹-氯仿混合液，輕輕顛倒混勻，在1000(Tl2000r/min的轉速下離心分離l(Tl5min,獲取上清液1，從上清液I中移取300-600μ L至新的離心管，並在新的離心管中重複步驟(3) —次，製得上清液2。
[0011](5)將步驟(4)製得的上清液I和上清液2混合，然後加入為上清液0.4^0.6倍體積的異丙醇，再置於_20°C冰箱冷藏2(T30min，取出後置於1000(Tl2000r/min的轉速下離心分離l(Tl5min，再用70~75%的乙醇洗滌沉澱2~3次，室溫乾燥後溶於30~40 μ L的TE緩衝液即製得目標樣品，目標樣品在_20°C下保存。
[0012]本發明方法應用於高鹽度採油廢水處理系統活性汙泥總DNA的提取。 [0013]採用本發明方法對高鹽度採油廢水處理系統活性汙泥中總DNA提取具有分離純化程度高，運行操作過程簡單且穩定，避免了高鹽度含油廢水對提取過程的影響，同時，該方法對高鹽度含油背景下汙泥中多種不可預知雜質均有良好的分離功能。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發明實施例中對SBR池活性汙泥中總DNA和ABR池活性汙泥中總DNA不同提取方法的瓊脂糖檢測圖。
[0015]圖中M為λ -DNA marker,泳道I為方法一提取SBR池活性汙泥總DNA的結果，泳道2為方法二提取SBR池活性汙泥總DNA的結果，泳道3為方法一提取ABR池活性汙泥總DNA的結果，泳道4為方法二提取ABR池活性汙泥總DNA的結果。
【具體實施方式】
[0016]實施例:(I)取中海石油(中國)有限公司湛江分公司潿洲終端處理廠SBR池汙泥20mL (汙泥沉降比為25%)和ABR池汙泥20ml (汙泥沉降比為25%)，分別加入不同IOOmL的離心管中，以8000r/min的轉速進行離心預處理IOmin,去上清液,過濾收集沉澱，並置於50°C烘箱中烘乾，取烘乾的沉澱於乾燥研缽中，向研缽中加入50mL的液氮，待液氮蒸發剩餘25mL時敲碎樣品，液氮即將蒸發完時再次加入50mL的液氮，然後進行快速研磨至粉狀，粉末樣品快速分裝入2mL的離心管中備用。
[0017](2)向步驟(1)製得的裝有研磨後粉末樣品的2mL離心管中加入600 μ L預熱至650C的DNA提取緩衝液，然後在65°C水浴30min製得樣品備用，每隔2_3min顛倒混勻一次；所述DNA提取緩衝液含有40mmol/L的Tris-HCl、20mmol/L的乙酸鈉、10mmol/L的EDTA和質量百分比濃度為1%的SDS』並使用0.3mol/L的HCl稀溶液和0.3mol/L的NaOH稀溶液調節DNA提取緩衝液的pH值至8.0。
[0018](3)在步驟⑵獲得的樣品離心管中加入等體積的體積比為1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液，輕輕顛倒混勻，置於12000r/min轉速下離心分離lOmin，獲取上清液1，從上清液I中移取400 μ L至新的離心管，並在新的離心管中重複步驟(2) 一次，製得上清液2。
[0019](4)將步驟(3)製得的上清液I和上清液2混合，然後加入為上清液0.6倍體積的異丙醇，再置於-20°C冰箱冷藏20min,取出後置於12000r/min轉速下離心分離15min,再用70%的乙醇洗滌沉澱2次，室溫乾燥後溶於30 μ L的TE緩衝液即製得目標樣品，目標樣品在-20 °C下保存。
[0020]本實施例提取的總DNA，經為期I年的實驗證明，DNA分離純化水平較常見方法優異，且提取水平較高，具體實驗數值見表1。
[0021]表1用超微量紫外分光光度計對不同方法提取的DNA的檢測結果
【權利要求】
1.一種活性汙泥中總DNA的液氮研磨改良式提取方法，其特徵在於具體步驟為: (1)均勻取得目標DNA來源體活性汙泥2(T30mL，該活性汙泥的汙泥沉降比為20~30%，置於IOOmL離心管中，以6000~8000r/min的轉速進行離心預處理10~15min,棄去上清液,過濾收集沉澱物質置於5(T60°C環境下烘乾，製得樣品備用； (2)將步驟⑴製得的樣品等量加入到乾燥研缽中，向研缽中加入5(T100mL液氮，待液氮蒸發剩餘25~50ml時敲碎樣品,液氮即將蒸發完時再次加入25~50ml液氮,然後進行快速研磨預處理，製得粉末樣品，再快速分裝入2mL的離心管中備用； (3)向步驟⑵製得的粉末樣品中加入600-800μ L預熱至65~75°C的DNA提取緩衝液，然後在65~75°C下水浴處理3(T40min後製得樣品備用；水浴處理期間每隔2~3min顛倒混勻一次；所述DNA提取緩衝液含有4(T60mmol/L的Tris_HCl、2(T30mmol/L的乙酸鈉、.l(T20mmol/L的EDTA和質量百分比濃度為I~3%的SDS，並使用0.1~θ.5mol/L的HCl稀溶液和0.1~0.5mol/L的NaOH稀溶液調節DNA提取緩衝液的pH值至8.0 ; (4)在步驟(3)獲得的樣品離心管中加入等體積的體積比為1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液，輕輕顛倒混勻，在1000(Tl2000r/min的轉速下離心分離10~15min,獲取上清液I,從上清液I中移取300-600 μ L至新的離心管，並在新的離心管中重複步驟(3) 一次，製得上清液2 ； (5)將步驟(4)製得的上清液I和上清液2混合，然後加入為上清液0.1·0.6倍體積的異丙醇，再置於_20°C冰箱冷藏2(T30min，取出後置於1000(Tl2000r/min的轉速下離心分離l(Tl5min，再用70~75%的乙醇洗滌沉澱2~3次，室溫乾燥後溶於30~40 μ L的TE緩衝液即製得目標樣品，目標樣品在_20°C下保存。
2.根據權利要求1所述的活性汙泥中總DNA的液氮研磨改良式提取方法的應用，其特徵在於該方法應用於高鹽度採油廢水處理系統活性汙泥總DNA的提取。
【文檔編號】C12N15/10GK103966203SQ201410208064
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月18日 優先權日:2014年5月18日
【發明者】解慶林, 朱宗強, 李豔紅, 曾鴻鵠, 梁延鵬, 王帥, 陳有為 申請人:桂林理工大學