一種快速分離脂肪間充質幹細胞的試劑盒及方法
2023-05-31 07:08:16 1
專利名稱：一種快速分離脂肪間充質幹細胞的試劑盒及方法
技術領域：
本發明屬於組 織工程領域，涉及一種分離脂肪間充質幹細胞的試劑盒、該試劑盒的應用以及一種分離脂肪間充質幹細胞的方法。
背景技術：
脂肪間充質幹細胞是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的幹細胞，具有來源自體，取材廣泛、易於採集、保存和運輸、無異體排斥、避免倫理爭議等諸多優點。流式細胞儀分析發現脂肪間充質幹細胞高表達間質細胞標誌(⑶44、⑶105)、整合素受體(⑶29、⑶49b、⑶49c、⑶51)，不表達造血系標誌(⑶34、⑶45)和內皮細胞標誌⑶31。脂肪間充質幹細胞在體內外可以分化為骨細胞、軟骨細胞、肝細胞以及脂肪細胞等。目前人脂肪間充質幹細胞在組織工程皮膚以及細胞治療等臨床應用研究中已逐漸深入，並已顯示出廣闊的應用前景。目前，對脂肪間充質幹細胞的分離培養、擴增還沒有統一的標準，存在純度低、原代培養時間長等缺點。各種類型的成纖維成體幹細胞擴增一般在2 3天開始進入指數式生長，相差不大，而原代細胞由於組織來源不同，出現細胞克隆時間差異較大，所以，原代細胞傳代時間是分離得到目的細胞的關鍵。
發明內容
為了解決脂肪間充質幹細胞分離的純度、數量和原代培養時間問題，本發明提供了一種分離脂肪間充質幹細胞的試劑盒。此試劑盒能有效純化哺乳動物脂肪間充質幹細胞，加快原代細胞擴增速度。獲得大量脂肪間充質幹細胞，以利於進行下一步的實驗研究。根據本發明的一個方面，本發明的分離脂肪間充質幹細胞的試劑盒包括洗滌液，細胞培養液A，細胞培養液B和細胞消化液，其中:所述細胞洗滌液為生理鹽水；所述細胞培養液A 為含 100ng/ml LIF(Sigma，L5158)與 100ng/ml bFGF (Sigma,F5392)細胞因子的 Knockout-DMEM 液體培養基(Gibco，12660012)；所述細胞培養液B為胎牛血清；所述細胞消化液為膠原酶I型酶液(Sigma，C-0130)。根據本發明的一個方面，所述脂肪間充質幹細胞源自哺乳動物。根據本發明的一個方面，所述洗滌液、培養液A、培養液B以及細胞消化液是無菌的。根據本發明的一個方面，所述洗滌液、培養液A、培養液B以及細胞消化液為獨立包裝。根據本發明的一個方面，用於脂肪間充質幹細胞的培養的細胞培養液是將細胞培養液A與細胞培養液B按照4:I體積比配製的細胞培養混合液。根據本發明的一個方面，所述的細胞洗滌液含0.9%的氯化鈉的，所述細胞消化液可為質量/體積百分比濃度為0.2 %。本發明的另一目的 在於提供了一種分離脂肪間充質幹細胞的方法。該方法用試劑盒內細胞消化液處理脂肪組織，經細胞培養液A和B的原代培養，最終獲得分離的脂肪間充質幹細胞。根據本發明的一個方面，所述分離脂肪間充質幹細胞的方法可通過下述步驟實現的:本發明的方法採用膠原酶I型酶有效處理脂肪蛋白膠質，利用細胞因子(LIF、bFGF)組合對脂肪間充質幹細胞的促進作用，從而確保了原代細胞分離數量和減少原代培養時間。根據本發明的一個方面，所述分離脂肪間充質幹細胞的方法可包括:1、脂肪預處理:無菌收集脂肪，浸沒於含1%雙抗(青鏈黴素)的細胞培養液(A和B)中，玻璃容器密封運輸至實驗室；生物安全櫃中剪取約Ig脂肪，用生理鹽水清洗脂肪中的血汙。用剪刀剪碎脂肪組織成糜狀。2、分離細胞:將剩餘脂肪組織剪碎成肉糜狀，轉移到離心管中，加入20ml細胞消化液，混勻37°C過夜消化約6小時。離心，用細胞培養液重懸細胞，接種原代細胞於0.2%明膠包被的培養瓶中，置37°C、5% C02培養箱中培養。72小時候，可見貼壁成纖維狀細胞，呈漩渦式生長(見圖1)。
圖1.分離得到的脂肪間充質幹細胞
具體實施例方式下面結合實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但是並不以此來限制本發明。實施例1、用於分離脂肪間充質幹細胞的試劑盒的配製1、洗滌液:取9g NaCl以去離子水定容至1000ml，高壓滅菌製得0.9%的氯化鈉洗滌液，放置在4V冰箱內備用。2、細胞培養液:含 100ng/ml LIF 與 100ng/ml bFGF 細胞因子的 Knockout-DMEM 液體培養基和無菌胎牛血清培養液按照4:I的體積比混合配製細胞培養中所用細胞培養混合液。3、細胞消化液:配製質量/體積百分比濃度為0.2%的膠原酶I型酶溶液。實施例2、用於分離脂肪間充質幹細胞的試劑盒的分裝試劑盒的規格為I次/盒，每盒中各組分的量:洗滌液I瓶(IOOml/瓶)，細胞培養液Al瓶(80ml/瓶)，細胞培養液BI瓶(20ml/瓶)，細胞消化液I瓶(IOOml/瓶)。接上述劑量對試劑盒中各組分進行獨立包裝，得到分離脂肪間充質幹細胞的試劑盒。
實施例3、脂肪間充質幹細胞的分離與擴增培養無菌收 集脂肪，浸沒於含1%雙抗(青鏈黴素)的細胞培養液(A和B)中，玻璃容器密封運輸至實驗室；生物安全櫃中剪取約Ig的脂肪，用生理鹽水清洗脂肪中血管中的血汙。將脂肪組織剪碎成肉糜狀，轉移到離心管中，加入20ml細胞消化液，混勻37°C過夜消化約6小時。離心，用細胞培養液重懸細胞，接種原代細胞於0.2%明膠包被的培養瓶中，置37°C>5% C02培養箱中培養。
權利要求
1.一種分離脂肪間充質幹細胞的試劑盒，包括: 洗滌液，其為含0.9%的氯化鈉的生理鹽水； 培養液A，其為含100ng/ml LIF與100ng/ml bFGF細胞因子的Knockout-DMEM液體培養基; 培養液B，其為胎牛血清； 細胞消化液，其為膠原酶I型酶液。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於:所述洗滌液、培養液A、培養液B以及細胞消化液是無菌的。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於:所述洗滌液、培養液A、培養液B以及細胞消化液是獨立包裝。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述脂肪間充質幹細胞源自哺乳動物。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於:所述培養液B的技術指標如下:pH(7.0-7.5)、總蛋白含量(3-3.5/100ml)、血紅蛋白(彡 20mg/100ml)。
6.權利要求1所述的試劑盒 ，其特徵在於:所述培養液A與培養液B以4:1的體積比來提供。
7.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於:所述生理鹽水為含0.9%的氯化鈉溶液，所述細胞消化液為質量/體積百分比濃度0.2%的膠原酶I型酶液。
8.一種分離脂肪間充質幹細胞的力法，包括: (1)利用洗滌液衝洗脂肪中中的血汙，用解剖刀在脂肪一端(離頂端Icm處)圓周劃開外表皮，用夾子固定脂肪此端，用兩把鑷子用力撕下脂肪外表皮，再分離兩根動脈，最後將靜脈內皮剔除； (2)將剩餘脂肪組織剪碎成肉糜狀，轉移到離心管中，隨後用細胞消化液消化(37°C消化6小時); (3)吸出離心管中消化後的液體。除去其他組織及雜質。
(4)吸出的液體經離心機離心(2500rpm，5分鐘)。離心後，倒出培養基，用細胞培養液重懸細胞。
(5)接種的原代細胞於0.2%明膠包被的培養瓶中，置37°C、5% C02培養箱中培養。
其中洗滌液為生理鹽水； 細胞培養混合液為按照9:1體積比來配製的培養液A與培養液B，其中培養液A為Knockout-DMEM液體培養基，培養液B為胎牛血清； 以及細胞消化液膠原酶I型酶液。
(6)每天觀察細胞貼壁生長情況。細胞多數貼壁後全量換液，除去未貼壁細胞和雜質，以後每3 4天半量換細胞培養液。
9.根據權利要求8所述的方法，其中在步驟(5)中，採用每106個細胞接種到25m2培養瓶中。
10.根據權利要求8所述的方法，其中在步驟￠)中，24小時細胞多數貼壁後全量換液，除去未貼壁細胞和雜質，。
全文摘要
本發明提供了一種分離脂肪間充質幹細胞的試劑盒及方法。該試劑盒包括洗滌液，細胞培養液A，細胞培養液B，細胞消化液，其中洗滌液為生理鹽水(含0.9％的氯化鈉)；細胞培養液A為含100ng/ml LIF與100ng/ml bFGF細胞因子的Knockout-DMEM液體培養基；細胞培養液B為胎牛血清；細胞消化液為質量/體積百分比濃度為0.2％的膠原酶I型酶液。與傳統分離培養方法相比，採用此試劑盒得到的細胞純度高，增殖更快，一般7天即可完成原代細胞培養。將原代細胞傳代，利用培養液進行培養，一般2-3天細胞密度即可達到90％，為利用脂肪間充質幹細胞進行進一步實驗研究提供了豐富的來源。
文檔編號C12N5/0775GK103087982SQ201110330948
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月27日 優先權日2011年10月27日
發明者田傑 申請人:北京清美聯創幹細胞科技有限公司