用偶聯疫苗激活主動免疫的方法

2023-05-30 18:19:11

專利名稱：用偶聯疫苗激活主動免疫的方法
技術領域：
本發明與給受試者施用偶聯疫苗(vaccine conjugate)來激活抗細菌或原蟲的主動免疫的方法有關，該偶聯疫苗包括活細菌或者原蟲以及中和抗體或其片斷。
背景技術：
Whitfill等人的美國專利號5,397,568和5,397,569描述了通過施用偶聯疫苗激活抗病毒疾病的主動免疫的方法，該偶聯疫苗包括活病毒和病毒中和抗體。這些參考文獻僅與病毒疾病有關。
治療球蟲病，一種由各種艾美球蟲所致的禽類和哺乳動物的原蟲疾病，的方法見於Baffundo等人的美國專利號4,935,007和McDonald等人的美國專利號5,055,292。卵內抗球蟲病的接種見於已出版的PCT專利申請WO96/40233和96/40234。
發明概述本發明提供了在受試者中激活抗細菌性或者原蟲性疾病的主動免疫的方法，該方法包括給受試者施用含有活細菌或原蟲以及結合於活細菌或者原蟲的中和因子的偶聯疫苗。該中和因子選自抗體和抗體片斷。抗體或抗體片斷是能夠中和活細菌或原蟲的因子。該偶聯疫苗以能夠使受試者對活細菌或者原蟲產生免疫反應的有效劑量來使用。
本發明的另一方面是可以在受試者中激活抗細菌性或原蟲性疾病的主動免疫的疫苗製劑。該疫苗製劑是製藥上可接受的包含偶聯疫苗的製劑。該偶聯疫苗包含活細菌或原蟲以及結合於活細菌或原蟲的中和因子。該中和因子選自抗體和抗體片斷。抗體或抗體片斷能夠中和活細菌或原蟲。該偶聯疫苗以在受試者中激活對活細菌或原蟲的免疫反應的有效量而包含於製藥上可接受的製劑中。
本發明的另一方面是製造的產品，該產品包括密閉的、病原菌不可滲透的容器以及包裝在容器中的上述無菌疫苗製劑。
附圖簡述

圖1表示用包含500個與2.5、25或150μl多克隆抗體混合的堆形艾美球蟲卵囊的偶聯疫苗所接種的禽的卵囊排出量(output)，該量與未用疫苗接種的對照組(cntrl)和無抗體的卵囊所接種的對照組進行比較。卵囊排出量被用作感染程度的指標。
圖2表示用包含500個與25或150μl多克隆抗體混合的堆形艾美球蟲卵囊的偶聯疫苗所接種的禽的卵囊排出量，該量與未用疫苗接種的對照組(cntrl)和無抗體的卵囊所接種的對照組進行比較。卵囊排出量被用作感染程度的指標。
圖3表示疫苗接種和低劑量堆形艾美球蟲免疫攻擊之後的卵囊排出量。疫苗接種使用含500個與2.5、25或150μl多克隆抗體混合的堆形艾美球蟲卵囊的偶聯疫苗；對照組是未用疫苗接種的對照組(cntrl)和用無抗體的卵囊接種的對照組(0)。
圖4表示疫苗接種和高劑量堆形艾美球蟲免疫攻擊之後禽的體重增加量(以克表示)。疫苗使用包含500個與25或150μl多克隆抗體混合的堆形艾美球蟲卵囊的偶聯疫苗；對照組是未用疫苗接種的對照組(cntrl)以及用無抗體的卵囊所接種的對照組(0)。
圖5表示疫苗接種和高劑量堆形艾美球蟲免疫攻擊之後禽中的損害量。疫苗接種使用包含500個與25或150μl多克隆抗體混合的堆形艾美球蟲卵囊的偶聯疫苗；對照組是未用疫苗接種的對照組(cntrl)以及用無抗體的卵囊接種的對照組。
發明詳述本發明提供了包含與所述生物特異的中和抗體混合的活生物(細菌或原蟲)的疫苗製劑。中和抗體的量是使該生物保持誘發主動免疫反應的能力，並同時提供某種程度的抗病原體損害效應的保護作用。儘管申請人不希望受限於任一單一的理論，但是目前相信本發明的疫苗複合物導致病原生物某種形式的延遲釋放。
本發明的疫苗複合物被認為能夠延遲或者從開始便保護疫苗接種的受試者免於疫苗生物體的致病效應。然而，該延遲或最初的保護僅僅是暫時性的(與採用死亡或滅活疫苗生物體所預期的結果相比)。複合物中的疫苗生物體最終感染受試者，誘導主動免疫。延遲的程度將依賴於所用的抗體量、特定的疫苗生物體，以及被接種的受試者。當接種年輕的受試者，尤其是當大量受試者被接種時，這種感染的延遲是重要的。例如，與接種新孵出的小雞相比較，接種卵內的小雞是更容易和更經濟的。
在本發明的優選實施方案中，以延遲出現與受試者感染活疫苗生物體有關的病理改變的劑量提供中和因子。該延遲是相比較而言，與沒有混合中和因子而施用活疫苗生物體時所產生的病理改變相比，該病理改變被延遲了。
使用本發明的偶聯疫苗比使用非偶聯的但能夠誘導保護性主動免疫反應的生物體更安全。此處使用術語「安全」表明在疫苗接種的大部分個體中疫苗接種的利大於弊。
在實施本發明時所用的抗體是細菌或原蟲的中和抗體。如果細菌或原蟲與抗體允許在一起反應足夠的時間，那麼細菌或原蟲的中和抗體是那些體內對抗細菌或原蟲感染力的成分。細菌或原蟲中和抗體的來源不是至關重要的。它們可來源於任何動物，包括禽類(如，雞、火雞)和哺乳動物(如，大鼠、家兔、羊、馬)。在來源上，細菌或原蟲的中和抗體可以是多克隆的也可以是單克隆的。參見，如，D.Yelton和M.Scharff,68《美國科學家》(American Scientist)510(1980)。該抗體也可以是嵌合抗體。參見，如，M.Walker等，26《分子免疫學》(Molecular Immunology)403(1989)。
實施本發明時所採用的細菌或原蟲的中和抗體可為任何同種型的免疫球卵白，包括IgM、IgG、IgA、IgD，和IgE免疫球卵白。IgG和IgM更優選，並且IgG免疫球卵白(如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)最優選。
實施本發明中所用的抗體片斷是保持了其可變區結合位點的細菌或原蟲的中和抗體的片斷。例如F(ab′)2片斷，F(ab′)片斷，以及Fab片斷。見《免疫學》(Immunology)基本進展(Basic Processes),95-97(J.Bellanti編，第2版，1985)。
實施本發明中所用的抗體或抗體片斷可能有與之相結合的其它成分。例如，小球體或微粒可以結合到抗體或抗體片斷上，如Platt的美國專利4,493,825所述，其公開的內容在此引入作為參考。
如果不是為了偶聯於中和因子，本發明尤其有利地運用了在被治療的受試者中將是致病的(能夠導致疾病)的細菌或原蟲。細菌或原蟲的致病性可能在於細菌或原蟲本身或是因為被治療的受試者(如，卵中的禽)的易感性。總之，許多病原細菌或原蟲在受其感染的受試者中有激起主動免疫的正效應，並且許多細菌或原蟲的減毒疫苗株有能力在受試者中導致至少某些疾病。因此，術語「病原性」，此處用於描述細菌或原蟲，意思是指由施用細菌或原蟲對受試者所致的損害超過使用它們所致的任何益處。「活性」或「活」生物體是指未被滅活者。「疫苗生物體」是指用於誘導保護性免疫反應者，即使也發生相反的副效應(在這種情況下主動免疫的益處大於任何相反的副效應)。優選細菌或原蟲是能夠在被治療的受試者中誘導主動免疫反應的活生物體。
偶聯疫苗以在被治療的受試者中每單位足以激活抗細菌或原蟲的主動免疫反應的劑量而包含於疫苗製劑中。術語「免疫反應」，如此處所用，意思是在受試者群體中有某種益處的任何水平的保護而免於隨後暴露於細菌或原蟲中，這種保護不論是降低死亡率、降低損害量、改善餵養轉變比率(feed conversion ratios)的形式，還是降低疾病任何其它的有害效果的形式，並且該保護不論是部分性的還是全身性的，均在此列。
關於中和因子所提供的保護程度，在疫苗中中和因子與細菌或原蟲組合所使用的量不必足以提供對細菌或原蟲的完全保護，只要細菌或原蟲導致的有害反應降低到所誘導的免疫反應的益處超過感染所致的損害即可。
術語「受試者」，如此處所用，包括哺乳動物和禽類等。哺乳動物實例包括小鼠、大鼠、豬、家兔、羊、雪貂、狗、貓、牛、馬和包括人在內的靈長類。術語「禽」是指包括任何種雄性或雌性禽，但是主要包括商業上飼養用以產卵或產肉的家禽。因此，術語「禽」主要是包括母雞、公雞和小雄鴨，火雞、鴨、鵝、鵪鶉和雉。
實施本發明中可能採用的細菌包括，但不限於，利尼耶爾放線桿菌，牛放線菌，產氣氣桿菌，邊緣無形體，炭疽桿菌，鵝疏螺旋體，犬布魯氏菌，雞疽梭狀芽胞桿菌，溶血梭狀芽胞桿菌，諾維氏梭狀芽胞桿菌，產氣莢膜梭狀芽胞桿菌，敗血梭狀芽胞桿菌，破傷風梭狀芽胞桿菌，馬棒狀桿菌，化膿棒狀桿菌，腎棒狀桿菌，反芻動物考德裡體，剛果嗜皮菌，詭譎丹毒絲菌，大腸桿菌，屍體梭菌，犬血巴爾通體，嗜血桿菌屬細菌，豬嗜血桿菌，鉤端螺旋體屬的種類，牛莫拉菌，支原體屬的種類，豬肺炎支原體，鮭隱孔吸蟲，鴨瘟巴斯德菌，溶血性巴斯德菌，出血敗血性巴斯德菌，羊流產沙門氏菌，馬腎志賀氏菌，金黃色葡萄球菌，豬葡萄球菌，S.hyos，無乳鏈球菌，停乳鏈球菌，馬鏈球菌，乳房鏈球菌，和胎兒弧菌(對於相應的疾病，見《獸醫藥理學和治療學》(VeterinaryPharmacology and Therapeutics)第5版，746頁表50.2(N.Booth和L.McDonald編，1982)(Iowa State University出版社)；以及類白喉棒狀桿菌，牛分支桿菌，麻風分支桿菌，結核分支桿菌，星形諾卡菌，炭疽桿菌，肉毒梭狀芽胞桿菌，艱難梭狀芽胞桿菌，產氣莢膜梭狀芽胞桿菌，破傷風梭狀芽胞桿菌，金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌，釀膿鏈球菌，百日咳博代氏菌，綠膿桿菌，空腸彎曲桿菌，布魯氏菌屬細菌，土拉弗朗亞斯菌，侵肺軍團菌，鸚鵡熱衣原體，沙眼衣原體，大腸桿菌，肺炎桿菌，傷寒沙門氏菌，鼠傷寒沙門氏菌，小腸結腸耶爾森氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，霍亂弧菌，流感嗜血桿菌，肺炎支原體，淋病奈瑟球菌，腦膜炎奈瑟球菌，伯納特柯克斯體，莫塞爾立克次體，普氏立克次體，立氏立克次體，恙蟲熱立克次體，疏螺旋體屬的種類，問號鉤端螺旋體，梅毒螺旋體，和單核細胞增多性李斯特氏菌(對於相應的疾病，見R.Stanier等，《微生物世界》(The Microbial World)637-38頁，表32.3，(第5版，1986)。
實施本發明中可能採用的原蟲包括，但不限於，導致球蟲病的艾美球蟲(禽艾美球蟲，奈氏艾美球蟲，波氏艾美球蟲，堆型艾美球蟲，E.mivati，和百型艾美球蟲)，邊緣無形體，賈第蟲(如，蘭伯賈第蟲)，巴貝蟲(如犬巴貝蟲，吉氏巴貝蟲，馬巴貝蟲，駑巴貝蟲，二聯巴貝蟲，阿根廷巴貝蟲，分歧巴貝蟲，和牛巴貝蟲)，牛毛滴蟲，溶組織內阿米巴，和結腸腸袋蟲；瘧原蟲(如，惡性瘧原蟲，三日瘧原蟲，間日瘧原蟲，和卵形瘧原蟲)，利什曼原蟲(如，杜利什曼原蟲，巴西利什曼原蟲，熱帶利什曼原蟲，和墨西哥利什曼原蟲)，錐蟲(如，布氏錐蟲和克氏錐蟲)，溶組織內阿米巴，陰道毛滴蟲，鼠弓形體，和卡氏肺囊蟲。如此處所用，「禽的原蟲」是已知能感染禽的原蟲。
生物體可以任何合適的形式進行使用，包括孢子或其孢囊。例如，使用感染性球蟲可以採用形成孢子的卵囊，子孢子，和孢子囊的形式。
以偶聯物形式使用的生物體的確切量不是至關重要的，只要該量能夠有效引起動物的免疫反應。總之，根據所使用的生物體，施用的部位和方式，受試者的年齡和狀態等，生物體的量將為1,10或100個到1,000,10,000,100,000或一百萬個。當作為偶聯物將生物體施用於卵內的禽(卵內)時，劑量可能從50,100，或500到2,000,10,000,20,000,30,000,50,000或100,000個，甚至更多。
可採用任何適當的方式對受試者施用本發明的疫苗。實例是口服、肌肉內注射、皮下注射、靜脈內注射、腹腔內注射、滴眼或鼻腔噴霧。當被治療的受試者是禽類時，該動物可為孵出的，包括剛孵出的(如，大約孵出後前3天)，幼禽，以及成年禽。禽類可在卵內施用疫苗，如Sharma的美國專利No.4,458,630所述(此處引用的該公開內容和所有其它的專利文獻均在此處引用作為參考)。
疫苗的卵內施用涉及疫苗對卵的施用。施用本發明疫苗的卵是受精卵，優選處在4/4孵化期。在孵化大約第十五到十九天時對雞卵進行處理，並最優選在孵化期大約第十八天(胚胎發育的第十八天)時進行處理。對火雞卵是優選在孵化期的大約21天到26天時進行處理，並最優選在孵化期大約25天時進行處理。
可採用任何種能將疫苗複合物通過卵殼轉輸的方式對卵施用本發明的疫苗。然而，施用的優選方法是注射。注射的部位優選位於羊膜所限定的區域，包括羊水和胚胎本身，它位於卵黃囊內，或在空氣室內。最優選注射於羊膜所限定的區域。在4/4孵化期開始時，羊膜被足夠地擴張以致於當從卵的大頭端的中央沿縱軸進行注射時，幾乎在所有的時間都能保證羊膜的穿透。
卵注射的機理不是至關重要的，但是優選不過度損傷組織和胚胎的器官或包繞它的胚胎外膜的方法，以便該處理不會降低孵化率。安裝了18～22號注射針的皮下注射器適合用於該目的。為了注射進空氣室，注射針只需插進卵大約2毫米。當長1英寸的注射針從卵大頭端的中央完全插入時，將穿透卵殼，包繞空氣室的外和內殼膜，以及羊膜。依發育的精確時期和胚胎位置而定，該長度的注射針將插在小雞上部的羊水中或在小雞本身。在注射針插入之前可以在卵殼上打洞或鑽成引導孔以免損壞或使注射針變鈍。如果需要，可以用基本上不透菌的石蠟等密封材料密封以免隨後進入不需要的細菌。
可以看出用於禽胚胎的高速自動卵注射器將特別適合實施本發明。許多這樣的裝置可以利用，其實例公開於Hebrank的美國專利No.4,681,063和Miller的美國專利No.4,040,388,4,469,047和4,593,646。所有這些裝置，適合實施本發明的裝置，均包括含有此處所述疫苗的注射器，同時該注射器安放在適當位置以用疫苗注射被裝置所固定的卵。裝置的其它特徵見以上所述。另外，如果需要，可以提供操作上與注射裝置相關的密封裝置以密封注射之後卵上的注射孔。
優選用於實施本發明的卵注射裝置是公開於Hebrank的美國專利No.4,681,063和4,903,635的裝置，其公開內容在此引入作為參考。該裝置包括將液體傳輸到許多卵中的注射裝置以及抽取裝置，該裝置同時固定和從卵面向上的部位提取許多單個卵並在卵被抽取裝置固定時與注射卵的注射裝置相協作。該裝置的特徵可以結合上述用於實施本發明的裝置的特徵。實施本發明的優選受試者是禽。
本發明的方法優選在卵內的禽中進行。
本發明偶聯疫苗的製備方法將中和因子與活細菌或原蟲在製藥上接受的載體中混和足夠的時間以形成活細菌或原蟲-中和因子的偶聯物(例如，在給受試者施用之前，將中和因子和細菌或原蟲混合於常用液體載體中，直至偶聯物形成)。簡單地將含中和抗體的超免疫血清加到含活細菌或原蟲的水溶液中可以方便地進行上述操作。本發明的疫苗製劑優選包含凍幹形式的偶聯疫苗或者在製藥上可接受的載體中的偶聯疫苗。製藥上接受的載體優選液體，特別是水溶液，載體。為了達到製備這種疫苗製劑的目的，中和因子和細菌或者原蟲可以混合於磷酸鈉緩衝鹽溶液(pH7.4)，常規培養基如MEM，或細菌生長培養基中。疫苗製劑可以貯存於用橡膠塞密封的無菌玻璃容器中，通過其橡膠塞可以用注射器注入液體並吸出製劑。
本發明的偶聯疫苗或複合物是抗體和活疫苗生物體的複合物或偶聯物；抗體和疫苗生物體之間的鍵是可打開的鍵(releasable bond)而不是共價鍵。採用本領域中可利用的技術，易於測定適合已知疫苗生物體和已知受試者的中和抗體的量。使用太少量的抗體將導致疫苗生物體產生不希望有的早期或嚴重的致病效果；使用太多量的抗體可完全滅活疫苗生物體或使其不能誘導保護性免疫反應。
本發明的疫苗製劑可以選擇性含有一種或多種佐劑。可以使用任何適合的佐劑，包括能增強免疫系統對抗原發生反應的化學製劑和多肽免疫刺激物。優選，諸如氫氧化鋁，磷酸鋁，植物和動物油等佐劑以足以增強受試者對偶聯疫苗產生免疫反應的量與偶聯疫苗一起使用。加入到偶聯疫苗中佐劑的量將依佐劑的性質而定，一般是細菌或原蟲重量的大約0.1～大約100倍的量，優選細菌或原蟲重量的大約1～大約10倍。
本發明的疫苗製劑選擇性含有一種或多種穩定劑。可以使用任何適合的穩定劑，包括諸如山梨醇、甘露醇、澱粉、蔗糖、糊精或葡萄糖等碳水化合物；諸如白卵白或酪卵白等卵白質；如鹼金屬磷酸鹽等緩衝液。當疫苗製劑為凍幹製劑時，使用穩定劑是尤其有益的。
在以下非限制性的實施例中更加詳細地闡述本發明。實施例1細菌出血敗血巴斯德菌在許多種禽中導致急性的高傳染性疾病。家禽霍亂常發生導致高發率和死亡率的敗血症。對家禽霍亂有幾種可應用於雞和火雞的活疫苗。
體外將出血敗血性巴斯德菌與抗該菌的抗體混合以形成細菌-抗體複合物。檢測細菌對抗體的不同比例以決定既不完全滅活細菌又仍能發生主動免疫反應的比例。這些複合物被用作雞或火雞的疫苗。隨後觀察疫苗接種的反應並與未混合抗體的同劑量出血敗血性巴斯德菌接種的家禽的反應相比較。在整個實驗中監測疫苗接種後的損害，隨時間而變的抗體反應和總的家禽治癒情況。
對其它細菌以同樣的方法進行檢測。這些細菌包括，但不限於，雞或火雞中的雞敗血支原體，火雞中的禽博代桿菌，雞或火雞中的沙門氏菌，以及齧齒動物中的沙門氏菌和李斯特菌。
偶聯疫苗被施用於如上所述的卵中的家禽或孵出後的家禽。
實施例2原蟲體外將堆型艾美球蟲(特別是，它的孢子囊和/或卵囊)與抗該原蟲的抗體混合以形成原蟲-抗體複合物。這些複合物被用作雞的疫苗。隨後觀察原蟲-抗體複合物疫苗接種的反應並與未混合抗體的同劑量堆形艾美球蟲接種的家禽的反應相比較。檢測原蟲對抗體的不同比例以測定既不完全滅活原蟲又仍能發生主動免疫反應的比例。疫苗接種後測定被接種者糞便中的卵囊排出量，腸道吸收能力(以cartenoid的吸收來評定)和體重。接種後10-21天，每個接種組的家禽均用堆形艾美球蟲進行有害免疫攻擊。對疫苗接種組和非疫苗接種的對照組均測定接種家禽糞便中的卵囊排出量，免疫攻擊期間體重的增加量以及腸道吸收能力(以cartenoid吸收來評定)。
在雞，火雞或齧齒動物中也檢測其它球蟲，以及在雞或火雞中檢測隱孢子蟲和在雞或火雞中檢測火雞組織滴蟲。
偶聯疫苗被施用於如上所述的卵中的家禽或孵出後的家禽。
實施例3疫苗接種後艾美球蟲卵囊的排出量疫苗接種雞並加以研究以測定堆形艾美球蟲卵囊疫苗與抗體混合的效果。
研究四種疫苗接種策略。用混有0,2.5,25或150單位的堆形艾美球蟲特異的多克隆抗體的500個堆形艾美球蟲形成孢子的卵囊接種(口腔管飼法)處理組。每種處理組包括每小組有5隻Leghorn雞的3個小組(每種處理組中有15隻家禽，整個實驗有60隻受治療家禽)。15隻家禽的對照組(5隻家禽分別在3個重複組中)未接受卵囊和抗體，但是在孵出當日口腔管飼法給予0.1ml PBS進行處理並隨後進行免疫攻擊。
根據體積決定抗體的單位，1μl=1單位。採用酶聯免疫吸附實驗以測定在本實施例中所用的抗體製品的滴度單位；然而，該實驗一直未被批准。通過酶聯免疫吸附實驗，堆形艾美球蟲抗體製品的滴度為90,782單位/ml。此處所用的劑量提供相對的比較。與給定生物體混合的抗體適合量將依生物體，抗體製品和預期的受試者而定。應用本領域中的技術，本領域中的技術人員將能夠決定某已知用途的合適生物體抗體比例。
疫苗接種前將卵囊和抗體於室溫下在PBS中一起混合至少1小時。然後將疫苗複合物貯存在4℃直至被使用。雞在孵出當日進行疫苗接種。
疫苗接種後4～8天收集糞便來測定疫苗接種後的卵囊排出量，並計數糞便中的卵囊量。測定每小組的卵囊排出量平均值和標準差。如表1所示，使用與500個卵囊混合的150μl抗體能顯著降低卵囊的排出量。
表1感染力--每隻家禽的卵囊排出量
1．a,b:LSD檢驗在0.15水平有差異，因為是小樣本所以顯著性設在0.20水平。未將對照組包括在統計模型中。
2．N=每小組5隻家禽的3個小組。
實施例4免疫攻擊後艾美球蟲卵囊的排出量實施例1中所述的處理組家禽於孵出後13天口腔管飼法給予250個混於PBS中的堆形艾美球蟲卵囊來進行免疫攻擊。免疫攻擊後4～8天收集糞便，並且測定以對照組卵囊排出量的百分數表示的平均卵囊排出量(統計模型包括對照組)。結果見於表2。免疫攻擊後有更大的卵囊排出量表明對病原攻擊的更弱保護。
表2--免疫攻擊的保護
1．A,B,C:SNK檢驗在0.05水平有差異。
2．對照=無疫苗接種，而免疫攻擊的家禽。
實施例5免疫攻擊後的保護表2所提供的數據在統計模型中未包括對照組而再次分析。結果由表3所示提供。
表3
1．A,B,C:SNK檢驗在.05水平有差異。
2．對照組無疫苗接種而免疫攻擊的家禽。
實施例1-3所提供的結果表明使用150μl抗體結合500個堆形艾美球蟲卵囊的疫苗接種量可使疫苗接種的致病效果減輕(與使用較少量抗體，或無抗體的相同疫苗接種相比；由疫苗接種後降低的卵囊排出量表示)，或可能使疫苗接種的致病效果延遲。如表1所示，150μl抗體與疫苗卵囊混合導致比無抗體或使用較少量抗體的疫苗接種有更弱的感染力(p≤0.15)。
如表2所示，用250個堆形艾美球蟲卵囊免疫攻擊之後，與未接種的家禽相比，用抗體-卵囊疫苗接種的家禽降低了卵囊的排出量。這些結果表明抗體-卵囊疫苗製劑在誘導抗免疫攻擊病原的保護性免疫反應方面是有效的。在用卵囊但未用任何抗體進行疫苗接種的處理組中保護是最強的，有0.05的顯著水平。如表3所示，在用抗體-卵囊疫苗處理的家禽中，最強的保護再次見於用卵囊但未用抗體進行處理的小組中。
上述結果表明使用抗體和卵囊的疫苗複合物會減輕疫苗卵囊的致病效果，或者延遲疫苗卵囊的致病效果，然而仍能誘導產生保護性免疫反應。通過允許疫苗施用於對疫苗生物體的致病效果更易感的受試者，或者允許施用於更低齡的受試者(如施用於卵中的禽)，預期兩種效果均可以增加疫苗的安全性。
前面所述是本發明的舉例說明，不能看作對本發明的限制。本發明由後附權利要求限定，同時等價權利要求也被包括於其中。實施例6在低劑量的免疫攻擊模型中使用抗體-卵囊(Eimeria acervulina)偶聯疫苗該研究檢測混有不同量抗體(2.5～150μl)的含500個Eimeriaacervulina卵囊的疫苗。處理組與非疫苗接種的對照組以及未用抗體接種的對照組比較。所有的處理組均在孵出當日進行接種。疫苗接種後4～8天對所有的處理組測定卵囊的排出量。低劑量免疫攻擊後13天也測定卵囊的排出量。
材料和方法用Hyvac SPF,leghorns來排除親本抗體的任何效應。多克隆抗體製備於用堆形艾美球蟲卵囊免疫的雞。將兩種抗體製品混合起來以製備最終滴度90,782的堆形艾美球蟲抗體。處理組和實驗設計如表4所示。
表4
在適當體積中混合卵囊(USDA # 12Lot28-131-36)與抗體來製備疫苗複合物。使用前該複合物於室溫下孵育1小時。在孵出當日管飼法給家禽施用200μl的每種處理液。從第4到第8天收集糞便。處理糞樣本並用McMaster′s池計數以確定每隻家禽的卵囊排出量。
將家禽移到孵卵器中並於孵出後13天以低劑量進行免疫攻擊(250個堆形艾美球蟲卵囊)。免疫攻擊後4～8天收集糞便並如上所述計數。
疫苗接種的對照組表現出每隻家禽大約12×106的卵囊排出量。2.5μl和25μl抗體的處理組表現出相似的結果，然而，150μl抗體的處理組表現出對卵囊排出量的抑制效果，與對照組相比僅有其排出量的46％。見圖1。
低劑量免疫攻擊之後，在所有的抗體接種的處理小組中均見相似的結果。圖3。3個抗體處理小組平均在對照組排出量的大約40％。疫苗接種的對照組表現出僅為對照組23％的排出量。實施例7在高劑量免疫攻擊模型中使用抗體-卵囊(Eimeria acervulina)偶聯疫苗在高劑量免疫攻擊模型中檢測兩種抗體-卵囊偶聯疫苗製劑。通過卵囊排出量測定感染力並且通過體重增加量和損害量來測定對免疫攻擊的反應。偶聯疫苗包括與25或150μl抗體混合的500個堆形艾美球蟲卵囊(如實施例6中所述)，見表5。使用與上述實施例6相同的家禽品系，抗體，和卵囊。
表5
如上所述製備疫苗並於孵出當日以200μl的體積使用。4～8天收集糞便並計數。
在本實驗中所測定的免疫攻擊後的參數不同於實施例6。在13天對所有的處理組實施高劑量的免疫攻擊並記錄每隻家禽的體重。8天後(第21天)測家禽的體重並計數損害量。
與實施例6相比，在本實驗中疫苗接種的對照組有更低的卵囊排出量，兩抗體處理組也是這樣；疫苗接種的對照組(無抗體)在卵囊排出量上表現出20倍的降低(見圖2)。該降低的原因尚不清楚。
對所有的處理組施用高劑量的免疫攻擊(500個卵囊的免疫攻擊)並測體重和損害量。在處理組之間，包括疫苗接種的和未用疫苗接種的對照組，體重增加量的數據(圖4)未表現出差異。損害量的數據(圖5)表明了所有疫苗接種組的保護優於非疫苗接種對照組。實施例8出血敗血巴斯德菌製備抗出血敗血巴斯德菌的抗血清10隻SPF雞自孵出起便被放入清潔間中；在四周齡時每隻家禽被給予(頸部皮下注射)0.5ml的Soloay′s「Pabac」，它是含血清型1,3和4的滅活出血敗血巴斯德菌的乳懸油劑疫苗商品；在八周齡時，另外的0.5ml皮下注射到頸部並且在右胸肌肉內注射再另外的0.5ml。在10周齡時通過心臟穿刺術從每隻家禽中抽取大約20ml血。從血中收集抗血清，集中起來，並用0.45μm的濾膜過濾。在多次無菌檢測均為陰性結果之後，將抗血清裝入不同大小的藥瓶中並放入-20℃的冰櫃中直至使用為止。分離和滴定Cu和M9出血敗血巴斯德菌株Cu和M9出血敗血巴斯德菌株均來自活疫苗，分別是Choleramune Cu和Multimune M，均為Biomune製備。實驗確定這些出血敗血巴斯德菌株在-70℃於90％培養基和10％甘油的混合液中冷凍的效果最好。實施例9在第18天用出血敗血巴斯德菌接種的卵的孵化能力設計該實驗以確定隨著於孵化期第18天進行的卵內注射，Cu和M9出血敗血巴斯德菌株的不同菌落形成單位(CFUs)是否影響SPF卵的孵化能力。在磷酸緩衝鹽溶液(PBS)中稀釋每株出血敗血巴斯德菌以製備三種稀釋液每0.1ml1000CFUs；每0.1ml100CFUs；以及每0.1ml10CFUs。在孵化期第18天，將每株菌的每種稀釋液0.1ml接種入14個SPF卵中。13個卵用0.1ml的腦心浸液(BHI),PBS和甘油(載體對照)的混合液接種，13個卵未給予接種。
表6中的結果表明在2～7組中SPF卵的孵化能力嚴重地降低。
表6第18天用出血敗血巴斯德苗接種後SPF卵的孵化能力
每個接種的卵用0.1ml合適當CFUs數的培養基/PBS混合液接種。對每株菌均滴定含1×10(2)CFUs/ml的稀釋液並且滴度與靶數目有某種差異。實際上組4含10.5CFUs/卵，組3含105CFUs/卵，組2含1050CFUs/卵。組7含12.5CFUs/卵，組6含125CFUs/卵，組5含1250CFUs/卵。組1的卵用0.1ml BHI/PBS/甘油混合液接種。實施例10與雞抗血清混合後出血敗血巴斯德菌的菌落生長從-20℃取出1ml雞源出血敗血巴斯德菌的抗血清(見實施例8)並於室溫融化。該血清在PBS中2倍稀釋。每種血清稀釋液0.5ml與0.5ml含100CFUs/0.5ml的Cu出血敗血巴斯德菌株混合。室溫下該混合液反應1小時。1小時之後，0.5ml每種稀釋液的混合液以雙份塗布TSA培養板並且200CFUs/ml Cu出血敗血巴斯德菌株貯備液以三份塗布培養板中。培養板於37℃孵育48小時。孵育24小時和48小時之後分別計數菌落的數目。結果見表7和8。
表7
*這是在表8滴度下，1ml混合物中預期的CFUs的數目。
表8Cu出血敗血巴斯德菌株2×10(2)貯備液的滴度
所有的混合物準備妥後，塗布表8中的貯備液樣品。該液不能置放另外的1小時。0.5ml該貯備液與0.5ml抗血清的混合液產生每ml混合液預期的152CFUs。
結果表現出從最低稀釋的抗血清到最高稀釋的抗血清細菌CFUs的數目降低(表7)。這可能是由於反應時間所致。最高稀釋的抗血清比最低稀釋的抗血清與活菌反應更長的時間(20～30分鐘更長)。增加反應時間可能導致更多的菌落死亡。反覆混旋貯備液(3-4CFUs/ml)也可能有助於所觀察到的菌落數的降低。下一實施例進一步研究該趨勢。實施例11該實驗研究表6中所示的Cu出血敗血巴斯德菌株的菌株與出血敗血巴斯德菌株抗血清的相同稀釋液之間的反應。不是象前面的實驗中持續混旋Cu出血敗血巴斯德菌株的「2×10(2)」貯備液，而是通過抽吸輕輕混勻該液。為了形成每種抗體-細菌的混合物，1ml抗血清稀釋液與1ml貯備培養物稀釋液混合。允許該混合液反應4小時。貯備液以3個重複塗布TSA培養板，其含186CUFs/ml(表9)。該液的剩餘部分也允許在室溫放置4小時。
4小時的反應時間之後，0.5ml每種抗體-細菌混合物混勻並以兩個重複塗布TSA培養板。186CFU/ml貯備液混勻並以三次重複塗布TSA培養板(0.5ml/培養板)。於37℃孵育24小時後計數菌落數，96小時後再次計數。結果由表9和10所提供。
表9預計的Cu出血敗血巴斯德菌株2×10(2)CFU/ml最終貯備液的滴度
表10<
>表10中的數據表明了隨著抗血清稀釋度的增加菌落數不斷降低，正如前述實驗中所見，只是稍微更加明顯而已。在稀釋混合物1∶16～1∶4096中均表現出比預期更多的CFUs/ml。表7中也表現了相似的結果。表9中所見的菌落數說明在缺乏血清的情況下，CFUs隨著時間的推移在PBS中死亡。這可以解釋兩次研究中在稀釋液1∶8192～1∶32768中有比預期值更低的菌落數。可以證實抗血清在較高的稀釋度具有某種生長抑制作用，而在較低的稀釋混合液中則表現出生長促進作用。下一個實驗研究這些觀察結果的可能原因。實施例12體外比較出血敗血巴斯德菌抗血清和陰性血清(不含抗出血敗血巴斯德菌抗體的雞血清)對M9出血敗血巴斯德菌株生長的影響。如實施例11中所述製備血清稀釋液和出血敗血巴斯德菌培養物的稀釋液。每ml含139CFUs/ml的培養物(表6)與1ml稀釋血清混合。製備陰性血清的三種稀釋液(1∶16,1∶512，和1∶32768)並與適量的細菌培養物混合。細菌培養物/血清稀釋混合物於室溫下反應1小時。
反應1小時後，以兩次重複將血清抗體-細菌混合物塗布TSA培養板(0.5ml)並且將陰性血清細菌混合物以三次重複塗布培養板。對所有的抗血清和陰性血清稀釋液加入1.0ml M9出血敗血巴斯德菌株貯備液後，將其以三次重複塗布培養板，並且於室溫下放置1小時後再次塗布。37℃孵育24小時之後計數菌落並且孵育48小時後可以注意到數目上的改變。菌落數的結果見表11和12。
表11M9出血敗血巴斯德菌株2×10(2)CFU/ml的最終貯備液的預計滴度
表12
*表11的滴度下1ml混合物中預期的CFUs數目。37℃孵育48小時後未見菌落數的改變。
實施例10-12中的數據表明隨著出血敗血巴斯德菌的抗血清逐漸變得更稀，CFUs的數目最初有增加，然後是逐漸的降低。結合幾個實施例的數據，結果表明實際上兩株出血敗血巴斯德菌均以血清作為生長基。當血清濃度降低時，出血敗血巴斯德菌的生長亦減慢。部分數據表明當稀釋於PBS中並且在室溫放置2～4小時時出血敗血巴斯德菌便死亡。這可以解釋1∶8192～1∶32768稀釋液中所觀察到的比預期值更低的CFUs。當血清濃度降低時，PBS的濃度增加。儘管等待1小時之前和之後，本實施例中的貯備液菌落數並沒有大的差別，然而在高稀釋度中仍存在低菌落數目。
當不含出血敗血巴斯德菌抗體的血清混合物的菌落數目與含出血敗血巴斯德菌抗體的對應混合物的菌落數目以及與貯備液數目相比較時，它可以表現出含出血敗血巴斯德抗體的抗血清有某種生長抑制能力。1小時之後，不含出血敗血巴斯德菌抗血清的樣品中，CFU的數目與貯備液CFU的數目相比，先是高然後降低，但不低於預期值。在三個含出血敗血巴斯德菌抗體的樣品中，有兩個樣品的CFU數目低於不含該抗體的陰性血清樣品的數目。出血敗血巴斯德菌抗血清的生長抑制作用可被存在的其它因子封閉。實施例13在孵化期第18天用出血敗血巴斯德菌抗血清-出血敗血巴斯德菌CFUs注射的卵的孵化能力設計該研究以檢測卵內施用於SPF卵時血清抗體-細菌混合物的作用。M9出血敗血巴斯德菌株以相同的CFUs數(5個作為指標)與不同量的出血敗血巴斯德菌抗血清混合，然後將每種混合物0.1ml接種入7組中每組的15個SPF卵中。用M9出血敗血巴斯德菌株的培養物製備100CFUs/ml的貯備液。為了確保每個卵注入相同數目的CFUs，對每組以5分鐘的間隔將適量血清與適量貯備液混合。這些混合液在室溫下放置30分鐘，此後，在孵化期第18天將0.1ml接種入15個卵中。每組的最終混合液製備之後將100CFUs/ml貯備液以三個重複塗布於培養板中並於每組的最終混合液反應30分鐘之後再次塗布(表13)。培養板均於37℃孵育24小時，此後，計數菌落。表14提供了每組孵化能力的數據。
表13
表14在孵化期18天用1ml含出血敗血巴斯德菌的抗血清及M9出血敗血巴斯德菌株CFU的混合物注射的SPF卵的孵化能力
該研究最初是為了接種每個將被注射與適量出血敗血巴斯德菌抗血清混合的5.0CFUs細菌的卵。表13中所見的滴度數據表明卵接受了更接近於3.2而不是5的CFUs數並且由於30分鐘的反應期而發生少量菌落的損失。表14的結果表明當在孵化期第18天接種時即使小量CFUs的M9出血敗血巴斯德菌對SPF卵來說也是破壞性的。組7中的對照卵100％孵出。在其它的組中卵孵化受到嚴重影響。在這些組中，5和6具有所有已孵出的家禽的第二高的百分數。組6中的卵以抗血清比出血敗血巴斯德菌的最高比值(50μl+3.2CFUs)進行接種並獲得60％的總孵出，其中有27％的正常孵出。該趨勢提示當抗出血敗血巴斯德菌的抗血清與活細菌混合時，它通過減輕或延遲細菌的致病效果對雞胚可提供某種程度的保護。
分別與含和不含出血敗血巴斯德菌抗體的血清以及含不同血清抗體量的血清相比，表12和14中的數據表現出出血敗血巴斯德菌的血清抗體對細菌生長，和可能對其致病效果的可能抑制效果。表14中數據表明兩個最高抗體量的組(組5和6)與單獨細菌的組(組1)相比，它具有更多的孵出。實施例14雞敗血支原體的生長；製備超免疫血清細菌F雞敗血支原體的培養物獲自North Carolina State University,支原體實驗室，獸醫學院。F雞敗血支原體作為活疫苗被用於商業雞飼養業。40微升已補充了15％豬血清的Frey′s培養基(FMS)裡接種入1.33mls的細菌培養物。然後將該混合物於37℃孵育大約18小時並且已生長的培養物以80/20的比例與無菌甘油混合以進行-70℃下的凍存。該混合物的無菌性於胰腖豆腖瓊脂(TSA)上進行檢測，沒有其它菌生長。-70℃凍存24小時之後測定F雞敗血支原體貯備培養物的滴度是5.8×10(8)CFUs/ml。
R雞敗血支原體的抗血清購自NCSU支原體實驗室。用混有佐劑的滅活R雞敗血支原體超免疫紐西蘭大白兔來製備抗血清。採血之前肌肉內和皮內注射三次來免疫兔。該抗血清稱為MGA。實施例15MGA對F雞敗血支原體的生長抑制效果該實驗研究F雞敗血支原體與不同量MGA混合後，已知量F雞敗血支原體隨時間的生長情況。最初MGA的樣品以1∶10稀釋於磷酸緩衝鹽溶液(PBS)。然後，將0.5ml的前一稀釋液加入到0.5ml PBS中製備10個1∶2的倍比稀釋液(稀釋度1∶20～1∶10240)來進一步稀釋抗血清。室溫下融化1小瓶F雞敗血支原體貯備培養物並1∶100稀釋。該100(-2)貯備液含5.8×10(6)CFUs/ml。將0.4ml5.8×10(6)的貯備液加入到0.4ml的11個MGA稀釋液的每種稀釋液中以製備細菌-抗體複合物。這些複合物於室溫下反應30分鐘。處理液12包括已加入到0.4ml相同細菌貯備液中的0.4ml PBS。
30分鐘反應時間之後，12種處理液的每種均從10(-1)到10(-8)倍比稀釋於FMS中。這些試管孵育14天並在41小時，47.5小時，和14天時測定其生長。(通過顏色改變測定雞敗血支原體在FMS中的生長。隨著細菌生長的不斷進行，培養基的pH降低，導致pH指示劑酚紅的顏色改變。隨著生長，顏色逐漸地從深紅色變化到桔黃色並最終到黃色。根據培養基的顏色可以測定生長程度)。結果由表15所提供。
表1512種抗血清稀釋液每種0.4ml，含.039μl～40.0μl抗血清，與0.4ml MgF貯備液混合後的MgF的生長
>MgF*=.4ml中的MgF抗血清.4ml MgF**=.4ml MgF2.32×10(-6)MgF滴度***=稀釋管中MgF的滴度(孵育14天之後)
-(無生長，深紅色)+/-(剛開始生長；比對照管淺的紅色)+(輕度生長；淺紅色)++(中度生長；深桔黃色)+++(中到重度生長；淺桔黃色)++++(重度生長；黃色)第14天測定所有12個處理中的生長(表1)。組1-4中的生長被延遲，這些組含有最高量的MGA。在含較低量MGA的組中有生長時，這些組中的生長是不明顯的。這些結果提示高量MGA對細菌有生長抑制作用。實施例16MGA對雞敗血支原體的生長抑制作用融化1小瓶F雞敗血支原體貯備液並1∶100稀釋於FMS中。該10(-2)稀釋液含大約5×10(6)CFUs/ml。1ml10(-2)的貯備稀釋液徹底混勻後，加入到8個稀釋管的每管中。將一定量的MGA加入到每管中(見表16)並且混勻細菌/抗血清混合物。室溫下孵育15分鐘，然後37℃孵育。用FMS生長培養基的顏色改變作為指示來測定13天的培養過程中支原體的生長。結果由表16提供。
表16
輕度生長；淺紅色)++(中度生長；深桔黃色)+++(中到重度生長；淺桔黃色)++++(重度生長；黃色)在不含抗血清的試管中，雞敗血支原體的中度生長見於孵育的最初27小時之內並且在37℃下到46小時時在該試管中的生長是重度的(表16)。在含多於或等於1.5μls MGA的試管中不能於孵育的27小時之內檢測到細菌生長。孵育46小時之後，在含12,24，和48μls MGA的試管中仍不能檢測到生長。37℃下孵育13天後所有試管均表現出雞敗血支原體的重度生長。這些結果表明細菌存在於所有的試管中，含更高量抗血清的試管比含更低量抗血清的試管能延遲生長更長的時間。能檢測到生長所需要的時間似乎與細菌-抗血清複合物中的MGA量成正比。實施例17雞敗血支原體-MGA複合物對孵化的影響在孵化期的第18天接種9組卵。7組分別用7種不同雞敗血支原體F-MGA複合物之一進行接種。1組僅用細菌進行接種而另一組用FMS在PBS中1∶4的稀釋液進行接種。
融化1小瓶F雞敗血支原體並在10％FMS和90％PBS的稀釋劑中進行1∶5和1∶10稀釋。用適當量的這些稀釋液來製備細菌-MGA複合物。除組1之外，每個特定組的每個卵均收到0.1ml的含有相同數目雞敗血支原體CFUs以及適當量的抗血清的注射液。組1中的卵給予0.1ml的FMS/PBS稀釋劑。接種之前複合物允許反應10分鐘。然後將卵孵育直至孵出。
測定細菌貯備物1∶10稀釋液的滴度包括製備3個倍比稀釋液至10(-9)以及塗布10(-6)稀釋液的兩個TSA系列稀釋液並在37℃孵育。3個倍比稀釋液中的所有試管均表現出雞敗血支原體的生長。滴度為8×10(8)CFUs/ml。孵化能力的結果由表17提供。
表17
MGA-雞敗血支原體複合物影響孵化的百分率和小雞的健康。孵化在90％以上的小組是那些含有最高比例MGA∶CFUs的小組(組4除外)。組2和3中的健康小雞百分數高於其它接受製劑中含更少量抗血清的MGA-細菌複合物的小組。這些結果表明某種MGA細菌比例通過延遲和/或降低細菌的致病效果而具有保護正發育的小雞胚胎的能力。實施例18F雞敗血支原體/抗體複合物疫苗在孵化期第18天接種每組有16個可存活卵的6個小組。陰性對照組(組6)中的16個卵在第18天時接種0.1ml的稀釋劑(1份FMS加到9份PBS中)，並在沒有其卵的大孵化器中進行孵化。
室溫下融化1小瓶F雞敗血支原體貯備液並1∶5稀釋(貯備液2)。貯備液2的滴定表明其包含7×10(7)CFUs/ml。然後將貯備液2分成0.9ml的小份並分別與0,5,10,20或40μl的MGA進行混合。一旦混合，將細菌-MGA製品在室溫孵育15分鐘。這些細菌-MGA複合物以0.1ml的量施用於每組中的卵。組1的卵接受只含細菌的接種。然後將每組的16個卵分別放入小孵化器中直至孵出。MGA-雞敗血支原體製品所測定的CFUs見表18所示。
剩餘的貯備液2稀釋液用FMS進行3個單獨的10倍倍比稀釋至10(-9)，然後進行滴度測定。在每組倍比稀釋中的10(-4),10(-5)和10(-6)稀釋管中的液體以一式四份加到FMS瓊脂上並在37℃孵育9天。
孵出當日，對組1-5進行處理。對正常，健康的小雞進行抽樣，用無菌拭子擦拭鼻後孔裂隙並接種入含1.8mls FMS的試管中，以此測定雞敗血支原體的滴度。小雞被處理之後，將每組中抽樣的小雞放入P2室中。每組小雞放在分開的孵化箱中，每個孵化箱均互不接觸。
對照組6中的小雞表現出延遲的孵化並在組1-5孵化後的那一天被處理。10隻對照小雞用拭子擦拭以測定雞敗血支原體的滴度，然後將其放到分開的P2室中的孵化箱中。在21天齡時，對所有存活的小雞進行採血並收集血清以通過血清培養板凝集(SPA)和ELISA來測定抗雞敗血支原體的抗體。結果由表18提供。
表18
*由於計算錯誤，組1中的卵接種了1.4×10(6)CFUs。
**在0～4的範圍之內所有陽性的SPA反應均計數為3或更高，4為最強的反應。
無抗血清的細菌所接種的卵(組1)和兩個較低量MGA+雞敗血支原體接種的卵(組2和3)有最低的孵出百分數並且沒有正常小雞孵出。對照組(組6)表現出延遲孵出並有比預期值更差的孵化情況。這可能是由於卵在一個打算孵化2000個卵的大孵化器中孵育的緣故。儘管存在該孵化問題，但10隻小雞是健康的並雞敗血支原體分離和兩個血清抗體試驗是陰性的。組4和5表現出比組1,2,3有更大改善的孵出百分數和正常孵出百分數。這兩個組中的卵接種了更高量的MGA並且組5(3.5×10(6)CFU+40μl MGA)在所有的組中表現出最佳的孵出。採集血清時所有剩餘的存活小雞均是健康的。SPA試驗和ELISA所測定的對雞敗血支原體的抗體反應表明F雞敗血支原體複合物疫苗對組3,4和5中的小雞是有效的。
我們有趣地注意到組5中的一隻小雞對孵出時的雞敗血支原體再分離，SPA試驗和ELISA均為陰性的。從組3,4和5中抽樣的所有其它小雞在每一種測定下均為陽性。似乎是組5中的1隻小雞從未感染過。
設計實施例14-18是為檢測細菌抗體疫苗複合物的有效性。數據支持該想法通過減輕或延遲細菌致病效應，同時在雛雞中能激起有效的免疫反應，以適當比例加入抗活細菌的特異抗血清(對疫苗細菌是特異的)能對小雞胚胎提供保護，這可被體液免疫反應所證實。
權利要求
1．在受試者體內激活抗細菌性疾病的主動免疫的方法，該方法包括給受試者施用包含活細菌和與活細菌結合的中和因子的偶聯疫苗；中和因子選自抗體和抗體片斷；抗體或抗體片斷能夠中和活細菌；以在受試者中激活抗活細菌的免疫反應的有效量施用該偶聯疫苗。
2．根據權利要求1的方法，其中活細菌是能在受試者中致病的。
3．根據權利要求1的方法，其中中和因子選自IgG免疫球卵白和IgG免疫球卵白片斷。
4．根據權利要求1的方法，其中受試者是禽並且所述的施用步驟是在卵內進行。
5．用於激活受試者抗細菌性疾病的主動免疫的疫苗製劑，所述的疫苗製劑包括包含偶聯疫苗的製藥上可接受的製劑；所述偶聯疫苗包括活細菌和與該活菌結合的中和因子；所述中和因子選自抗體和抗體片斷；所述抗體或抗體片段能夠中和上述活細菌；以及包含於上述製藥上可接受的製劑中的偶聯疫苗，其量足以在受試者中激活抗活細菌的免疫反應。
6．權利要求5的疫苗製劑，其中所述的活細菌能夠在上述受試者中致病。
7．權利要求5的疫苗製劑，其中該製藥上可接受的製劑是凍幹的。
8．在受試者中激活抗原蟲疾病的主動免疫的方法，該方法包括給受試者施用包含活原蟲和與活原蟲結合的中和因子的偶聯疫苗；中和因子選自抗體和抗體片斷；抗體或抗體片斷能夠中和活原蟲；以在受試者中激活抗活原蟲的免疫反應的有效量使用偶聯疫苗。
9．根據權利要求8的方法，其中活原蟲能夠在受試者中致病。
10．根據權利要求8的方法，其中活原蟲是禽的原蟲並且受試者是禽。
11．根據權利要求10的方法，其中活原蟲是艾美球蟲。
12．根據權利要求10的方法，其中活原蟲是禽艾美球蟲或堆型艾美球蟲。
13．根據權利要求8的方法，其中中和因子選自IgG免疫球卵白和IgG免疫球卵白片斷。
14．根據權利要求8的方法，其中中和因子是多克隆源的。
15．根據權利要求8的方法，其中中和因子是單克隆源的。
16．根據權利要求8的方法，其中給受試者施用偶聯疫苗的方法選自皮下給藥，腹腔內給藥，和肌肉內給藥。
17．根據權利要求8的方法，其中受試者是禽並且所述的施用步驟是在卵內進行。
18．用於在受試者體內激活抗原蟲疾病的主動免疫的疫苗製劑，該疫苗製劑包括含偶聯疫苗的製藥上可接受的製劑；所述偶聯疫苗包含活原蟲和與該活原蟲結合的中和因子；所述中和因子選自抗體和抗體片斷；所述抗體或抗體片段能夠中和上述原蟲；以及包含於上述製藥上可接受的製劑中的偶聯疫苗，其量足以在受試者中激活抗所述活原蟲的免疫反應。
19．權利要求22的疫苗製劑，其中所述的活原蟲能夠在受試者中致病。
20．權利要求22的疫苗製劑，其中該製藥上可接受的製劑是凍幹的。
21．權利要求22的疫苗製劑，其中所述的活原蟲是禽的原蟲。
22．權利要求22的疫苗製劑，其中所述的活原蟲是艾美球蟲。
23．權利要求22的疫苗製劑，其中該活原蟲是禽艾美球蟲或堆型艾美球蟲。
24．在受試者中激活抗支原體的主動免疫的方法，包括給受試者施用包含活支原體和與該支原體結合的中和因子的偶聯疫苗，其中中和因子選自抗體和抗體片斷，該抗體或抗體片斷能夠中和該活支原體；以在受試者激活抗活支原體的免疫反應的有效量使用偶聯疫苗。
25．根據權利要求24的方法，其中該支原體是雞敗血支原體。
26．根據權利要求24的方法，其中中和因子選自IgG免疫球卵白和IgG免疫球卵白片斷。
27．根據權利要求24的方法，其中受試者是禽並且所述的施用是在卵中進行。
全文摘要
在受試者體內激活抗細菌性或原蟲性疾病主動免疫的方法,包括給受試者施用包含活細菌或原蟲以及與活細菌或原蟲結合的中和因子的偶聯疫苗(vaccine conjugate)。該中和因子選自抗體和抗體片斷。活細菌或原蟲是能夠在受試者中致病的生物,而抗體或抗體片斷是能夠中和活細菌或者原蟲的因子。
文檔編號A61P31/04GK1231614SQ97198351
公開日1999年10月13日 申請日期1997年9月26日 優先權日1996年9月30日
發明者J·A·託馬, E·E·哈達德, C·E·惠特菲爾, A·P·阿瓦基安 申請人:恩布裡克斯公司