集蛋白質收集和酶解於一體的樣品預處理裝置及其製備的製作方法

2023-05-30 16:47:06 1

專利名稱：：集蛋白質收集和酶解於一體的樣品預處理裝置及其製備的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種樣品預處理裝置，來提高蛋白質分析速度，即集蛋白質收集和酶解於一體的樣品預處理裝置及其製備。本發明通過在離心管內合成固定化酶的整體材料，實現蛋白質收集同時的快速酶解。同時，該裝置還可以作為樣品瓶，用於貯存酶解產物。
背景技術：
：在複雜蛋白質樣品的分析過程中，通常包含蛋白質混合物預分級、餾分收集、自由溶液酶解、肽段分離和蛋白質鑑定等步驟。其中餾分收集和酶解均屬於樣品預處理過程。然而，自由溶液酶解具有許多缺點，如酶解時間長(需要十幾個小時)、蛋白酶不能被重複利用、且易自降解等缺陷。近年來，為了克服上述缺點，人們在自由溶液酶解的基礎上發展了幾種蛋白質快速酶解的方法。其中微波輔助酶解(LoCY等，Journalofproteomeresearch,2007,6,887-893，Kweon等，AnalChem,2006,78，1743-1749)和表面活性齊U輔助酶角率(MariahC.Ruth等，Journalofproteomeresearch,2006,5,709-719)可將酶解時間縮短至幾小時。然而，這兩種技術仍然不能夠滿足高通量蛋白質分離分析的要求。近期人們將蛋白酶固載在基質上，製得固定化酶反應器，進一步縮短了蛋白質的酶解時間。目前常用的固定化酶反應器均以色譜柱的形式存在。蛋白質直接進樣到酶柱上進行快速酶解，並通過與之相連的色譜柱進行肽段分離和蛋白質的質譜鑑定(JichengDuan等，JournalofchromatographyA，2006,1106，165-174.)。然而這種方法只適於簡單樣品的分析。對於更複雜的樣品，必須對蛋白預分離後再進行酶解、肽段分離和蛋白質鑑定。在此過程中，以酶柱形式進行酶解受到諸多因素的制約。(1)蛋白質酶解條件通常比較苛刻，難以與蛋白質分離的最佳條件兼容，特別是流量難以匹配；(2)酶柱在處理一定量樣品後活性會下降，而且難以再生；(3)目前的酶柱反應器只適合於處理微升或納升級樣品。要想提高蛋白質分離鑑定的通量，必須發展具有樣品處理量大、蛋白質酶解速度快、製作方法簡單、成本低等優點的蛋白質酶解反應器。此外，為節省操作步驟，最好能將蛋白質的收集和酶解同時進行。
發明內容本發明的目的在於提供一種集蛋白質收集和酶解於一體的樣品預處理裝置及其製備，通過在離心管內合成固定化酶的整體材料，實現蛋白質收集同時的快速酶解。同時，該裝置還可以作為樣品瓶，用於貯存酶解產物。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種集蛋白質收集和酶解於一體的樣品預處理裝置，包括一帶有上蓋的離心管，離心管的上蓋中部開設有一個孔，在離心管的內壁上貼敷有環狀的中空多孔剛性整體基質層，基質層材料的表面通過修飾基質的活性基團固定有酶。所述環狀的基質層厚度常為為0.5-lmm;所述預處理裝置的製備方法為通過原位光引發聚合的方式，在離心管內形成中空多孔剛性整體基質；再通過修飾基質的活性基團將酶固定在材料表面，實現蛋白質的收集和快速酶解(可同時用於蛋白質的收集和快速酶解)；具體為1)先在離心管蓋上打一孔，然後按比例將的單體、交聯劑和致孔劑的混合溶液加入離心管中，超聲混均；混合溶液中單體的質量含量為10%-40%、交聯劑10%-40%、致孔劑(二元高級醇)50%;加入光引發劑後，將一截面與上蓋上的孔相當的柱體插入混合溶液中，柱體上端處於混合溶液上表面上方，密封離心管後，通過紫外光照射引發反應5-15min;2)反應結束後取出柱體，即可獲得一種帶有活性基團的中空多孔的剛性整體材料；3)通過進一步修飾材料的活性基團，將酶固定在整體材料表面，製備集蛋白質收集和快速酶解於一體的樣品預處理裝置。採用酶液浸泡整體材料的方式將酶固定f材料表面，所述酶為蛋白酶(如Trypsin,EndoproteinaseGluC)，酶液濃度為l-10mg/mL;所述單體為甲基丙烯酸縮水甘油酯和/或丙烯醯琥珀醯亞胺；交聯劑為乙叉二甲基丙烯酸酯和/或N,N-甲叉雙丙烯醯胺；致孔劑為環己醇和十二醇的混合液，其中環己醇佔致孔劑總質量的20%-95%，十二醇佔致孔劑總質量的5%-80%;光引發劑為DMPA或AIBN，其用量為單體質量的0.5-1.5%;紫外光波長為200-400nm;所述進一步修飾的過程為加入質量濃度為5-15%修飾試劑浸泡整體材料，室溫反應6-12h,採用的修飾材料為戊二醛。本發明的有益效果為1.通過原位光引發聚合的方式，在離心管內形成中空多孔剛性整體基質。再通過修飾基質的活性基團將酶固定在材料表面，實現蛋白質的收集同時的快速酶解。同時，該裝置還可以作為樣品瓶，用於忙存酶解產物。2.利用該裝置可以處理不同容量的蛋白樣品，能快速得到蛋白的酶解產物，以供蛋白質鑑定。3.通過改變實心管管徑和離心管體積，可製得不同容量的裝置。4.該裝置具有樣品處理量大、蛋白質酶解速度快、製作方法簡單、成本低等優點，可用作蛋白質樣品收集後的快速酶解。在高通量蛋白質研究方面具有很好的實用價值。圖l為裝置的製作示意圖，a為實心管，b為離心管，c為反應溶液；圖2為製備的樣品預處理裝置；圖3為細胞色素C採用該裝置酶解10分鐘產物的色譜/質譜譜圖。具體實施例方式實施例l集蛋白質收集和快速酶解於一體的樣品預處理裝置的製作1)反應裝置的製作在離心管(C)管蓋上鑿一個孔，孔徑與實心管a的管徑相當。2)基質的製備以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體，以乙叉二甲基丙烯酸酯為交聯劑，製備多孔整體基質。稱取甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)0.6g,乙叉二甲基丙烯酸酯(EDMA)0.4g，溶於lg環己醇/十二醇(質量比50/50)混合溶劑中，超聲10min,用鋁箔將裝有反應溶液的離心管包裹起來。快速稱取lmg光引發劑DMPA，震蕩30s。如圖1所示，取0.8mL反應液c於反應器b中，插入實心管a後，放入紫外交聯儀中光聚10min。3)取出實心管a後，加甲醇於反應裝置中浸泡4小時，然後加入29%氨水4(TC反應4小時；4)加入質量濃度5%的戊二醛室溫反應2小時，然後加入2mg/mL蛋白酶溶液室溫反應過夜。5)加入25mMNaCNBH3室溫反應6小時。6)製作示意圖如圖l所示，實物圖如圖2所示。實施例21)反應裝置的製作在離心管(C)管蓋上鑿一個孔，孔徑與實心管a的管徑相當。2)基質的製備以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體，以乙叉二甲基丙烯酸酯為交聯劑，製備多孔整體基質。稱取甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)0.6g，乙叉二甲基丙烯酸酯(EDMA)0.4g,溶於lg環己醇/十二醇(質量比50/50)混合溶劑中，超聲10min,用鋁箔將裝有反應溶液的離心管包裹起來。快速稱取lmg光引發劑DMPA，震蕩30s。如圖1所示，取0.8mL反應液c於反應器b中，插入實心管a後，放入紫外交聯儀中光聚10min。3)取出實心管a後，加甲醇於反應裝置中浸泡4小時，然後加入29%氨水40"C反應4小時。4)加入質量濃度5%的戊二醛室溫反應2小時，然後加入2mg/mL蛋白酶溶液室溫反應過夜。5)加入25mMNaCNBH3室溫反應6小時。6)將製備的集蛋白質收集和快速酶解為一體的樣品預處理裝置用於lmg/mL細胞色素C酶解，經37°C10min反應，取出酶解產物，採用(iRPLC/MS/MS分析。色譜圖如圖3所示，經質譜檢索，如表1所示，可鑑定出以下七條肽段KTGQAPGFSYTDANKNK(電荷為+3)TGQAPGFSYTDANKNK(電荷為+2)，KTGQAPGFSYTDANK(電荷為+2)，TGQAPGFSYTDANK(電荷為+2)，MIFAGIKK(電荷為+1)，TGPNLHGLFGR(電荷為+2)KGEREDLIAYLK(電荷為+2)，序列覆蓋率為46.15%。表ltableseeoriginaldocumentpage6formulaseeoriginaldocumentpage7色素CThrGlvGinAlaProGlyPheSerTvrThrAspAlaAsnLvsAsnLvs1,5'10'15'〈210〉3〈211〉15PRT〈213>細胞色素C<220〉〈221〉SIMILAR〈222〉(1)..(15)3LvsThrGlyGinAlaProGlvPheSerTvrThrAspAlaAsnLvs15lb〈210〉4〈211〉14<212〉PRT細胞色素C<220〉<221〉SIMILAR〈222〉(1)..(14)4ThrGlyGinAlaProGlvPheSerTyrThrAspAlaAsnLys15108PRT(1)..(8)〈223>formulaseeoriginaldocumentpage9權利要求1.一種集蛋白質收集和酶解於一體的樣品預處理裝置，包括一帶有上蓋的離心管，其特徵在於離心管的上蓋中部開設有一個孔，在離心管的內壁上貼敷有環狀的中空多孔剛性整體基質層，基質層材料的表面通過修飾基質的活性基團固定有酶。2.按照權利要求1所述預處理裝置，其特徵在於所述環狀的基質層厚度為0.5-lmm。3.—種權利要求1所述預處理裝置的製備方法，其特徵在於通過原位光引發聚合的方式，在離心管內形成中空多孔剛性整體基質；再通過修飾基質的活性基團將酶固定在材料表面，實現蛋白質的收集和快速酶解；具體為1)先在離心管蓋上打一孔，然後按比例將的單體、交聯劑和致孔劑的混合溶液加入離心管中，超聲混均；混合溶液中單體的質量含量為10%-40%、交聯劑10%-40%、致孔劑50%;加入光引發劑後，將一截面與上蓋上的孔相當的柱體插入混合溶液中，柱體上端處於混合溶液上表面上方，密封離心管後，通過紫外光照射引發反應5-15min;2)反應結束後取出柱體，即可獲得一種帶有活性基團的中空多孔的剛性整體材料；3)通過進一步修飾材料的活性基團，將酶固定在整體材料表面，製備集蛋白質收集和快速酶解於一體的樣品預處理裝置。4.按照權利要求3所述製備方法，其特徵在於採用酶液浸泡整體材料的方式將酶固定於材料表面，所述酶為蛋白酶，酶液濃度為l-10mg/mL。5.按照權利要求2所述製備方法，其特徵在於所述單體為甲基丙烯酸縮水甘油酯和/或丙烯醯琥珀醯亞胺。6.按照權利要求3所述製備方法，其特徵在於所述交聯劑為乙叉二甲基丙烯酸酯和/或N,N-甲叉雙丙烯醯胺。7.按照權利要求3所述製備方法，其特徵在於所述致孔劑為環己醇和十二醇的混合液，其中環己醇佔致孔劑總質量的20%-95%，十二醇佔致孔劑總質量的5%-80%。8.按照權利要求3所述製備方法，其特徵在於所述光引發劑為DMPA或AIBN，其用量為單體質量的0.5-1.5%;紫外光波長為200-400nm。9.按照權利要求3所述製備方法，其特徵在於所述進一步修飾^過程為加入質量濃度為5-15%修飾試劑浸泡整體材料，室溫反應6-12h,採用的修飾材料為戊二醛。全文摘要本發明涉及一種樣品預處理裝置，來提高蛋白質分析速度，即集蛋白質收集和酶解於一體的樣品預處理裝置及其製備，包括一帶有上蓋的離心管，其特徵在於離心管的上蓋中部開設有一個孔，在離心管的內壁上貼敷有環狀的中空多孔剛性整體基質層，基質層材料的表面通過修飾基質的活性基團固定有酶。該裝置具有樣品處理量大、蛋白質酶解速度快、製作方法簡單、成本低等優點，可用作蛋白質樣品收集後的快速酶解。在高通量蛋白質研究方面具有很好的實用價值。文檔編號G01N1/28GK101470052SQ20071015929公開日2009年7月1日申請日期2007年12月28日優先權日2007年12月28日發明者吳帥賓,張麗華,張玉奎,振梁,袁輝明申請人:中國科學院大連化學物理研究所