截短型人睫狀神經營養因子活性片段及其融合蛋白的製作方法

2023-05-31 01:05:41 5

專利名稱：：截短型人睫狀神經營養因子活性片段及其融合蛋白的製作方法
技術領域：
：本發明涉及重組融合蛋白與其製備方法，具體涉及蛋白轉導肽融合截短型人睫狀神經營養因子活性片段編碼核酸，以及蛋白的原核表達製備方法。本發明還涉及所述轉導肽融合截短型人睫狀神經營養因子活性片段的蛋白或核酸分子各自及其藥物組合物，可以用於治療神經退行性疾病、視網膜退行性疾病、肥胖症或與肥胖症相關的疾病，及神經損傷相關疾病中的用途。技術背景睫狀神經營養因子(Ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)最初由Helfand等在1976年發現，1984年Barbin等從雞睫狀神經元提取獲得，因可維持雞副交感神經節的存活而得名。CNTF能促使多種神經細胞的存活，是笫一個被發現的能維持在體和離體脊髓運動神經元的存活及突起生長的神經營養因子。人CNTF基因位於人第11號染色體長臂近端11ql2，為單拷貝基因。沒有信號肽，沒有糖基化的通用序列，只在第17位有一個非活性必需的半胱氨酸殘基。與白血病抑制因子(LIF)、IL-6、0SM及粒細胞集落剌激因子(G-CSF)等的分子結構有一定的相似性，屬於神經性細胞因子家族。CNTF的經典信號傳導途徑是CNTF與其受體oc亞基結合後再與細胞膜上亞基gpl30和LIFRP聚合，形成受體複合物，激活膜內側的JAK激酶，使STAT磷酸化，進入核內，與特定的DNA序列結合，調控細胞核內基因轉錄和蛋白合成。CNTF在體內具有多種生物學功能，主要作用對象是神經系統，對睫狀神經節細胞、交感神經元、脊神經節的感覺神經元、脊髄運動神經元、膽鹼能神經元、多巴胺神經元等多種神經細胞都有作用，可促進這些神經細胞的分化、生長，支持其生存，促進神經損傷後的再生和修復。1.CNTF與疾病1.1CNTF與神經退行性病變阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是一種進4亍性致命性的中樞神經系統退行性疾病。主要破壞腦細胞，引起漸進性記憶力和認知力減退、語言障礙，思考和行為能力下降，精神行為異常，影響工作、生活及社交活動，病情呈進行性加重，逐漸喪失獨立生活能力，發病後多因併發症而死亡。目前全世界患阿爾茨海默病的人數已超1800萬，患病人數仍在不斷地增加。我國阿爾茨海默病患病人數已超過500萬，而且隨著我國人口老齡化進程的加快，這個數字將更為龐大。隨著年齡的增長，痴呆的發病率和患病率均呈逐漸增高的趨勢。在60歲以上的老年人群中，年齡每增加5歲，阿爾茨海默病的患病危險就可增加1.85倍，阿爾茨海默病已經成為21世紀威脅人類的最嚴重疾病之一。儘管病人數目在增加，目前尚沒有治癒措施，全世界都加快腳步尋找更好的治療方法，延緩發病或者阻止疾病進展。阿爾茨海默病人大腦中特定區域的某些類型神經細胞呈進行性變性死亡，易感區包括杏仁核、海馬及海馬周圍區，受染細胞群體包括兒茶酚胺能、5羥色胺能及膽鹼能神經細胞。CNTF可阻止體內這些神經元的退行性喪失，能促進遭受神經病學損傷或神經變性疾病損傷的中樞神經元存活，CNTF還對亨延頓(Huntington)舞蹈症、肌萎縮性側索硬化症(ALS)、帕金森綜合症、黑質退行性病變、多系統委縮症和脊髄性肌萎縮(SMA)等有治療作用。1.2CNTF與視網膜退行性疾病CNTF對視網膜神經節細胞具有保護作用。在眾多的神經營養因子中，CNTF是唯一能有效促進視網膜神經節細胞再生的營養因子，CNTF可誘導視網膜神經細胞分化，減少神經細胞凋亡，促進細胞再生.體內外實驗研究均已證明，CNTF是感光細胞(視錐細胞和視杆細胞)發育過程中所必需的營養因子。玻璃體內注射CNTF可以對感光細胞產生明顯的保護作用。CNTF也可治療青光眼.肥胖是一種嚴重危害人體健康的慢性疾病，肥胖可以大大提高患糖尿病、心臟病、高血壓、中風和癌症等疾病的風險。實驗發現CNTF降低小鼠的體脂，從而使小鼠體重下降。CNTF與位於丘腦部位的受體結合，通過STAT3信號傳導途徑，能使缺乏leptin的肥胖小鼠(ob/obmice)脂肪減少，體重降低；對於飲食誘導的肥胖模型小鼠(DIOmice)，CNTF也能使之體重下降，這種小鼠模型更能代表人類肥胖症的實際情況。CNTF可能使丘腦的體重調節點下調，從而抑制食物攝入，與通過嚴格控制飲食減肥及其他的治療方法相比，CNTF不會發生停藥後過量攝入食物而引起體重反彈，因此，CNTF有望開發成為一種新型、高效的減肥藥品，具有廣闊的臨床應用開發前景。1.4CNTF與神經損傷相關疾病外周神經雪旺細胞中存在大量的CNTF，當外周神經受損時，CNTF得以釋放進入細胞間隙，這些CNTF可通過軸突逆向轉運到胞體獨自發揮作用，也可和肌肉中存在的可溶性CNTFRA形成複合物而發揮促進神經損傷修復的作用。外周神經切斷可引起相應脊髓皮質運動神經元死亡，應用CNTF能支持部分脊髓皮質運動神經元存活。CNTF促進運動神經元軸突在正常肌肉中分支發芽。CNTF能防止初生大鼠因軸突切斷導致的運動神經元的死亡，切斷面神經的實驗顯示，CNTF能有效的防止面神經核大部分神經細胞的退變。2.重組人CNTF的研究現狀CNTF目前主要應用於治療運動神經元疾病如肌萎縮側索硬化(ALS)。但臨床應用的效果卻並不令人滿意。將裝有能分泌CNTF的活細胞的半透膜微囊植入病變局部，可提高局部CNTF濃度，降低血藥濃度、減輕副作用.包被細胞輸送CNTF療法的一期實驗顯示出CNTF對治療色素性視網膜炎有效。CNTF治療其他CNS疾病的研究較少，CNTF在CNS大部分區域的水平均較低，人體內自然產量極低，基因工程是獲得大量高純度CNTF的可靠手段。3.CNTF與血腦屏障血腦屏障是存在於血液和腦組織之間的屏障系統，毛細血管內皮細胞與神經細胞間的緊密連接是血腦屏障的基本構成成分。在正常生理情況下只允許氣體分子及相對質量小於0.6kD的脂溶性小分子通過。從神經生長因子發現以來，神經營養因子(NTFs)已有20餘種。但半個世紀以來，由於血腦屏障的作用，NTFs的臨床應用仍很有限。目前臨床上仍缺乏一條合理有效的中樞給藥途徑。已報導的給藥途徑主要包括外周系統給藥、大腦實質直接注射、側腦室給藥、鞘內注射及經鼻給藥幾種。外周給藥，創傷性小，但受到血腦屏障的嚴重影響，進入大腦實質的量非常有限。大腦實質直接注射、側腦室給藥、鞘內注射給藥量容易控制，作用部位直接，但創傷性給藥風險大，應用困難。CNTF是蛋白質大分子，很難透過血腦屏障，從而限制了其在中樞的治療應用，目前開展的一些細胞移植和基因治療方面的研究雖然在動物實驗中取得了一些進展，由於這些治療方案都採取手術和腦室注射等創傷性手段，離臨床應用尚有很大的距離。本發明選擇蛋白轉導肽為CNTF運載體，採用基因工程技術將CNTF基因進行改構，使克隆表達的CNTF蛋白N端缺失14個胺基酸，以增高其活性，並去掉C端15個胺基酸，以增加穩定性和可溶性。通過活性檢測，證明截短的CNTF蛋白活性片段比市售rhCNTF顯示出更高的生物活性。
發明內容本發明的一個方面提供了一種具有跨膜轉導功能並且具有更高生物活性的截短型人睫狀神經營養因子活性片段，所述蛋白特徵為人睫狀神經營養因子n端缺失14個胺基酸同時融合了蛋白轉導肽，並去掉了C端15個胺基酸。所述蛋白轉導肽融合截短型人睫狀神經營養因子活性片段(下文縮寫成CNTFt)，其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示，其中截短型活性片段的胺基酸序列如sbqidN0,2所示，本發明的另一個方面提供了編碼所述蛋白的核酸序列，其中蛋白轉導肽融合截短型人睫狀神經營養因子活性片段的核酸序列如SEQIDN0.3所示，而截短型活性片段的核酸序列如SEQIDN0.4所示。本發明進一步提供製備CNTFt蛋白的方法，所述方法包括通過對CNTF分子及其與受體結合的關鍵部位的分析，同時綜合比較分析CNTF蛋白的溶解性、穩定性及免疫原性，設計並獲得CNTF截短型活性片段的cDNA;結合蛋白轉導肽的強大透膜優勢，將TAT蛋白轉導肽與CNTF截短型活性片段融合，獲得本發明的CNTFt的基因序列，構建了原核表達栽體，轉化大腸桿菌，進行誘導表達，包涵體經洗滌稀釋復性後，獲得高純度的CNTFt活性蛋白。因而提供了含有CNTFt的核酸分子的重組表達載體，包含被任何所迷載體轉化的宿主細胞，以及由其衍生的新的林系或細胞系。本發明還展示了CNTFt的透膜能力和生物活性。CNTFt能透過細胞膜進入SH-SY5Y細胞，並能通過血腦屏障進入腦實質，可用於穿越皮膚、黏膜、角膜、漿膜、肌膜、血管及淋巴膜、脈絡膜、神經膜、血腦屏障等一切細胞膜及生物膜的治療用途；能促進TF-1細胞的生長與存活，促進各種神經元的生長及存活，包括海馬神經元，皮層神經元等，並促進神經修復和再生，減少神經元的正常死亡以及學習記憶能力的下降。本發明提供CNTFt多種疾病的治療用途。CNTFt能用於阿爾茨海默病、帕金森綜合症、黑質退行性病變、多發性硬化症、亨延頓舞蹈症、脊髓性肌萎縮和肌萎縮性側索硬化症等運動神經元疾病，及神經損傷相關疾病等；CNTFt能降低體重，可用於肥胖症或與肥胖症相關的疾病；CNTFt能用於治療視網膜退行性疾病和青光眼。本發明進一步提供含有CNTFt及其核酸分子作為活性成分的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥學上可接受的載體，對患者沒有危險，不偉有效成分失活或者不幹擾有效成分的作用。含CNTFt蛋白的藥物組合物可以配製成通過包括靜脈內、皮下、肌肉、鞘內、鼻腔黏膜、口腔黏膜、舌下含服或者直腸黏膜等方式給藥，優選本發明藥物組合物藉助胃腸外製劑施用，其施用的有效方法包括吸入霧劑、皮膚塗抹劑、滴眼液劑、注射劑或其緩控釋製劑。圖l.SOE-PCR擴增出目的CNTF基因的1.2%瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道l:DNAmarker;泳道2:CNTFt。圖2.雙酶切鑑定pBV220-CNTFt質粒。泳道l、2和3:pBV220-CNTFt酶切後；泳道4:DNAMarker。圖3.CNTFt的表達。1:蛋白Marker;2:全菌；3:上清；4:沉澱；5:包涵體洗滌液I洗後沉澱；6:包涵體洗滌液I洗後上清；7:包涵體洗滌液n洗後上清；8:包涵體洗滌液n洗後沉澱。圖4.包涵體經稀釋透析復性後的SDS-PAGE電泳圖。泳道l:蛋白Marker;泳道2-4:CNTFt。圖5.Westernblot分析CNTFt的結果。圖6.CNTFt對TF-1細胞的活性測定。圖7螢光免疫組化顯示CNTFt透過SH-SY5Y細胞膜。A:CNTFt;B:rhCNTF對照品。圖8.螢光免疫組化顯示CNTFt透過小鼠血腦屏障。A:CNTFt給藥組的海馬齒狀回；B:rhCNTF對照品組的海馬部位。圖9.Morris水迷宮檢測CNTFt對Ap誘導的阿爾茨海默病模型小鼠的治療作用。*，p<0.01。具體實施例方式本發明將通過下列實施例得到更清楚的說明，這些實施例只是說明性的，不應當理解成限制本發明的範圍。實施例一CNTFt的構建以健康成人白細胞基因組DNA為模板，重疊延伸PCR(S0E-PCR)擴增目的基因。以引物P1和P4擴增出全長CNTF基因，反應條件為951C預變性5分鐘；941C變性1分鐘，551C退火1分鐘，72"C延伸4分鐘，進行30個循環；最後於721C延伸10分鐘結束反應。1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，得到CNTF帶內含子的全片段；回收；以所得CNTF為模板，P1與P2組成一對引物擴增外顯子1，P3與P4擴增外顯子2。其中各引物序列為PI(CGGGTACCATGGACCTCTGTAGCCGCTCTATCTG);P2(GCCCTGATGCTTCACATAGGATTCCGTAAGAGCAG);P3(CTCTTACGGAATCCTATGTGAAGCATCAGGGCCTG);P4(CGCGTCGACTTACCCAGTCTGATGAGAAG)EXONl的PCR條件為95n預變性5分鐘；94'C變性l分鐘，55'C退火l分鐘，72'C延伸15秒，進行30個循環；最後於72°C延伸10分鐘結束反應。2°/。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，切膠回收；EXON2的PCR條件為95X:預變性5分鐘；94C變性l分鐘，60'C退火l分鐘，72X:延伸30秒，進行30個循環；最後於72。C延伸10分鐘結束反應。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，切膠回收。分別回收純化上述外顯子1和外顯子2的擴增產物，各取ljiL作為模板，Pl和P4作為引物各取ljiL,採用2xpfu-MasterMix10pL，加水6jiL使反應體系為2(VL，行PCR擴增出所需目的基因。PCR條件為95。C預變性5分鐘；94X:變性1分鐘，48'C退火1分鐘，72X:延伸80秒，進行5個循環；94匸變性1分鐘，58匸退火1分鐘，72。C延伸80秒，進行25個循環；最後於72X:延伸10分鐘結束反應。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，在60Qbp處可見一條明顯的擴增帶(圖1)，與所需目的片段大小符合。回收試劑盒回收。回收片段後，與pBV220載體同時雙酶切，回收後連接，構建pBV220-CNTFt，轉化入大腸桿菌中。酶切鑑定獲得pBV220-CNTFt質粒(圖2)。核普酸序列測定證明與理論值一致。實施例二CNTFt的表達與復性1.重組基因在大腸桿菌中的誘導表達經鑑定構建正確的PBV220-CNTFt重組質粒轉化大腸桿菌BL21/pLysS(DE3)感受態的細胞，挑取轉化的陽性菌落置3mL含氨,青黴素IOOmg/L的LB培養液中，30*0搖床培養過夜，取活化菌液10%接種於lOmLLB培養液(含氛苄青黴素100mg/L)中，培養至OD55。為0.6時，將溫度調至37-47lC誘導表達。收集誘導表達4-8小時的菌體，10OOOg離心IO分鐘收集表達菌體，超聲破碎，離心分離上清與沉澱，進行SDS-PAGE分析(圖3)。2.包涵體處理液包涵體洗滌液I:2mol/L尿素，50mmol/LNaCl，50mmol/LTris-HCl，5mmol/LEDTA，pH7.0-9.0;包涵體洗滌液II:4mol/L尿素，50mmol/LNaCl,50mmol/LTris-HCl，5mmol/LEDTA，pH7.0-9.0;包涵體溶解液10mol/L尿素，10mmol/L檸檬酸緩沖液pH3.0-5.0;包涵體復性液10mmol/LTris-HCl，0.2mol/LL-精氨酸，0.1mmol/L還原型穀胱甘肽，0.01mmol/L氧化型穀胱甘肽pH8.0-9.0;3.包涵體的稀釋透析復性超聲破碎後的沉澱包涵體分別用包涵體洗滌液i和n洗滌，4r過夜。將洗滌後的包涵體溶於包涵體溶解液中，10000g離心10分鐘，將上清以1:20的體積比緩慢加入復性液中，於4匸孵育一周。10000g離心15分鐘，取上清液緩慢透析，並經濾膜除菌後儲存。稀釋復性沉澱的大部分是雜蛋白，離心後的上清能回收絕大部分的目的蛋白(圖4)，所以稀釋復性在復性的同時去除了雜蛋白，是一種方便、簡單而且易行的適合放大生產的好方法。稀釋復性的方法大大增加了樣品處理量，因此更省時，更利於放大且回收率高，適合進行產業化研究的需要。4.CNTFt分子量的測定按照2000年版《中國生物製品規程》附錄方法進行SDS-PAGE電泳。CNTFt電泳的表觀分子量為22kD，理論分子量為21.4kD，符合要求。5.CNTFt免疫印跡檢測表達的蛋白進行蛋白免疫印跡檢測，結果顯示抗CNTF單克隆抗體能與所表達蛋白特異性結合(圖5)，說明構建、表達和純化是成功的。實施例三CNTFt的生物學活性檢測人紅白血病細胞TF-1細胞培養於含10%新生牛血清和10ng/mlGM-CSF的16"培養基中，使用前，先用無血清培養基DMEM洗細胞4次，用DMEM培養基稀釋至濃度為4x105/ml，以每孔100ji1細胞加入上述96孔板，CNTFt樣品用無血清培養基DMEM倍比稀釋，每孔加樣lOOyl，使終濃度為O.10，0.50，1，5，10，50，100，500，1000，2000ng/ml，於37。C、5%0)2條件下培養48小時左右，每孔加20p1MTT，再培養5小時後，加入20°/。SDS80pl，充分溶解結晶顆粒後在酶聯儀上測D570。同樣條件測定參照品rhCNTF的活性作對照。實施例四CNTFt越過細胞膜，穿越血腦屏障入腦為確證CNTFt是否通透細胞膜，在對數生長期的SH-SY5Y細胞中分別加入CNTFt和市售rhCNTF作用l小時後，進行螢光免疫組化鑑定，同時設PBS對照。結果顯示，CNTFt處理細胞中出現明亮的綠色螢光，而rhCNTF處理的細胞綠色螢光較弱(圖7)，說明CNTFt能跨越細胞膜進入胞質。為確證CNTFt是否通過血腦屏障，將CNTFt腹腔注入小鼠後1小時處死取腦組織行冰凍切片，以抗CNTF為一抗做螢光免疫組織化學檢測。CNTFt組的大腦皮層及海馬切片顯示有綠色螢光發布，而rhCNTF組在大腦實質中未見到螢光(圖8)，結果表明CNTFt可透過血腦屏障進入腦內。實施例五CNTFt對阿爾茨海默疾病模型小鼠的療效阿爾茨海默疾病動物模型的製作將Ap(25-35)溶於lml滅菌生理鹽水中，濃度為1.0mg/ml。密封后於37。C培養箱中96小時，使其成為有毒性的凝聚態後。進行小鼠側腦室內Ap注射，注射劑量為每隻小鼠3W，假手術組注射相同體積的生理鹽水。注射第ll天對小鼠進行Morris水迷宮檢測，連續5天，水迷宮實驗潛伏期大於120秒的小鼠，為造模成功小鼠。將造模成功的小鼠用於實驗。Morris水迷宮水迷宮自動控制儀裝置為由中國醫學科學院藥物研究所研製，水池直徑100cm，水深35cm，水溫控制在(23±2)。C'將安全平臺置於Morris水迷宮的第三象限，作為小鼠入水後搜索的目標，以第一、二象限為小鼠入水點，水面高出安全平臺約lcm。水池上空通過攝像機與計算機相連，計算機自動採集數據。實驗每天訓練2次，每次訓練3分鐘。每次入水前將小鼠置於安全平臺上15秒，訓練結束，再次停留15秒，以加強記憶效果。如果小鼠在入水120秒以內未能找到水池中的安全平臺，可將其放置於安全平臺上休息30秒後，再進行下一次訓練，共訓練5天。水迷宮實驗環境要求安靜，避免一切外界幹擾。將小鼠從入水至找到安全平臺的時間(即潛伏期)為定量標準來衡量其空間記憶能力。模型小鼠被隨機分為AD模型生理鹽水對照組、rhCNTF腹腔治療組及直腸治療組和CNTFt腹腔治療組及直腸治療組。每組1隻小鼠。給藥量100jig/kg/day，連續給藥10天。Morris水迷宮行為學實驗實驗結果表明AD模型小鼠無論是腹腔注射還是直腸給予CNTFt均能顯著縮短其潛伏期，與AD模型生理鹽水組比較差異極為顯著(p0.05)(圖9)。實施例六CNTFt的抗肥胖作用取若干只小鼠(斷乳KM小鼠，雌雄各半，10-15克)，隨機選擇15隻作為正常對照組，給予普通飼料，其餘餵以高能飼料(膽固醇1%、蛋黃粉10%、豬油10%、基礎飼料79%)，造成DIO模型(飲食誘導型肥胖模型)，第1周每天每隻給予8克營養飼料，以後每周增加2克，自由飲水，共造模8周。造模期間，每周用電子天平測體重1次以觀察小鼠的造模情況。第8周末，以模型組小鼠體重超過正常組小鼠體重的20%為DIO模型成功，從造模成功的小鼠中選出50隻，隨機分成5組，分別為模型對照組、腹腔給藥高低劑量組和直腸給藥高低劑量組，從正常小鼠中選出10隻作為正常對照。低劑量CNTFt給藥為100fig/kg/day，高劑量給藥1000ng/kg/day，共10天。對照組給予同等量的生理鹽水。實驗期間隨時注意動物行為變化，觀察小鼠每天的飲食情況，精神活動及糞便幹稀程度。末次給藥並禁食24小時後，稱取動物體重，並按(終末體重-初始體重)/初始體重xlOW，計算體重增加率，將小鼠用乙醚麻醉後，準確測量小鼠從鼻尖到肛門處的距離即體長，並根據下式計算Lee，s指數Lee，s指數公式-(體重g)1/3x1000/體長cm。實驗中發現實驗期間，動物各項行為包括飲水，精神活動正常，糞便無異常，實驗結束處死動物，檢查各臟器，動物的心、肝、脾、肺、腎等均正常，肝臟色澤鮮紅，光滑。小鼠體重變化見表l。表1.不同劑量CNTFt在不同給藥途徑下對小鼠體重的影響組別(n)初始體重(g)終末體重(g)體重變化(g)Lee，s指數OO正常對照24.0±1.427.6±1.43.6±1.2304.40±8.92DI0-對照57.3±2.766.2±2.68.9±2.1343.87±15.16腹腔低劑量58.6±3.056.9±2.3-1.7±1.3"332.07±15.61直腸低劑量56.9±2.955.8±3.0-1.1±1.7"332.16±11.76腹腔高劑量57.0±3.050.9±1.3-6.1±2.5"319.92±13.63*直腸高劑量57.2±2.251.6±2.2-5.6±1.3"313.73±15.08*"，p<0.01,*，p<0.05vsDI0-對照。實施例七製備以CNTFt為活性組分的注射劑配方:tableseeoriginaldocumentpage14無菌過濾後分裝lml/支，冷凍保存，或凍幹，製成凍乾粉針。實施例八製備治療視網膜變性疾病、視神經損傷及青光眼的滴眼劑配方:tableseeoriginaldocumentpage15無菌過濾後分裝10ml/支，4C保存。序列表截短型人睫狀神經營養因子活性片段及其融合蛋白〈120〉中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所IDC0800367〈170>Patentlnversion3.2<210〉1188<212〉PRT人工序列1MetTyrGlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgGlyGlyGlyThr151015MetAspLeuCysSerArgSerlieTrpLeuAlaArgLyslieArgSer202530AspLeuThrAlaLeuThrGluSerTyrValLysHisGinGlyLeuAsn354045LysAsnlieAsnLeuAspSerAlaAspGlyMetProValAlaSerThr505560AspGinTrpSerGluLeuThrGluAlaGluArgLeuGinGluAsnLeu65707580GinAlaTyrArgThrPheHisValLeuLeuAlaArgLeuLeuGluAsp859095GinGinValHisPheThrProThrGluGlyAspPheHisGinAlalie100105110HisThrLeuLeuLeuGinValAlaAlaPheAlaTyrGinlieGluGlu115120125LeuMetlieLeuLeuGluTyrLyslieProArgAsnGluAlaAspGly130135140MetProlieAsnValGlyAspGlyGlyLeuPheGluLysLysLeuTrp145150155160GlyLeuLysValLeuGinGluLeuSerGinTrpThrValArgSerlie165170175HisAspLeuArgPhelieSerSerHisGinThrGly1801852<211〉172PRT人工序列2MetAspLeuCysSerArgSerlieTrpLeuAlaArgLyslieArgSer151015AspLeuThrAlaLeuThrGluSerTyrValLysHisGinGlyLeuAsn202530LysAsnlieAsnLeuAspSerAlaAspGlyMetProValAlaSerThr354045AspGinTrpSerGluLeuThrGluAlaGluArgLeuGinGluAsnUu505560200810088976.3AlaArgLeuLeuGluAsp65707580GinGinValHisPheThrProThrGluGlyAspPheHisGinAlalie859095HisThrLeuLeuLeuGinValAlaAlaPheAlaTyrGinlieGluGlu100105110LeuMetlieLeuLeuGluTyrLyslieProArgAsnGluAlaAspGly115120125MetProlieAsnValGlyAspGlyGlyLeuPheGluLysLysLeuTrp130135140GlyLeuLysValLeuGinGluLeuSerGinTrpThrValArgSerlie145150155160HisAspLeuArgPhelieSerSerHisGinThrGly1651703<211〉564<212〉腿人工序列<400〉3tatggtcgtaaa卿cgacgccaacgtagacgtggtggtggtaccatggacctctgtagc60cgctctatctggctagcaaggaagattcgttcagacctgactgctcttacggaatcctat120gtgaagcatcagggcctgaacaagaacatcaacctggactctgcggatgggatgccagtg180gcaagcactgatcagtggagtgagctgaccgaggcagagcgactcca柳gaaccttcaa240gcttatcgtaccttccatgtaccccaaccgaaggtgactttttgcataccagatagaggagctgatgggatgcctattaacta犯ggtgctgcaggagctatttcttctcatcagactgg519〈212>腿〈213>人工序列〈400〉4atggacctctgtagccgctccttacggaatcctatgtgaagatgggatgccagtggcaagcaagagaaccttcaagcttacagcaggtgcattttaccccctccaagtcgctgcctttgcatcccccgcaatgaggctgaa犯aagctgtggggcct犯acatgaccttcgtttcatttc511<212〉PRT人工序列<400〉5tttgttggccaggctcttagaagaccagcaggtgcatttt300ccatcaagctatacatacccttcttctccaagtcgctgcc360gttaatgatactcctggaatacaagatcccccgcaatgag420tgttggagatggtggtctctttgagaaaaagctgtggggc480ttcacagtggacagtaaggtccatccatgaccttcgtttc540gtaa564tatctggctagcaaggaagattcgttcagacctgactgct60gcatcagggcctgaacaagaacatcaacctggactctgcg120cactgatcagtggagtgagctgaccgaggc卿gcgactc180tcgtaccttccatgttttgttggccaggctcttagaagac240aaccgaaggtgacttccatcaagctatacatacccttctt300ataccagatagaggagttaatgatactcctggaatac卿360tgggatgcctattaatgttggagatggtggtctctttgag錫ggtgctgcaggagctttcacagtggacagtaaggtccatc■ttctcatcagactgggtaa519TyrGlyArgLysLysArgArgGinArgArgArg1510〈210〉616PRT人工序列6ArgGinlieLyslie.TrpPheGinAsnArgArgMetLysTrpLysLys151015〈210>736<212〉PRT<213〉人工序列7AspAlaAlaThrAlaThrArgGlyArgSerAlaAlaSerArgProThr151015GluArgProArgAlaProAlaArgSerAlaSerArgProArgProArg202530ArgProValGlu3權利要求1.蛋白轉導肽融合截短型人睫狀神經營養因子活性片段，其特徵在於該蛋白包含SEQIDNO.1所示的胺基酸序列。2.截短型人睫狀神經營養因子活性片段，其特徵在於該片段包含SEQIDN0.2所示的胺基酸序列。3.編碼權利要求1所示蛋白的SEQIDNO.3所示的核酸序列。4.編碼權利要求2所示蛋白的SEQIDNO.4所示的核酸序列。5.權利要求l的蛋白序列，其中所述蛋白轉導肽序列由以下幾種的任何一種胺基酸序列組成或其功能性片段組成。(A)含選自HIV-1反式'激活蛋白(trans-activatortranscription,TAT)中的蛋白轉導區，其胺基酸序列包含SEQIDNO.5所示的序列。(B)果蠅觸角蛋白同源結構域(ANTP)，其胺基酸序列包含SEQIDNO.6所示的序列。(C)單純皰療病毒(HSV)VP22的蛋白轉導序列，其胺基酸序列包含SEQIDNO.7所示的序列。6.—種含有編碼權利要求1所述蛋白的核酸序列的核酸分子及表達載體。7.含有權利要求2所述截短型活性片段的核酸序列的核酸分子及重組表達栽體。8.製備權利要求包括對截短型人睫狀神經營養因子活性片段的設計；獲得蛋白轉導肽融合截短型人睫狀神經營養因子活性片段基因的cDNA;構建重組質粒，轉化大腸桿菌，進行誘導表達；以稀釋復性方法進行復性。9.權利要求1-4任一項所述的蛋白或核酸分子在製備用於治療神經退行性疾病的藥物的用途，所迷疾病包括並不限於阿爾茨海默病、帕金森綜合症、黑質退行性病變、多發性硬化症、亨延頓舞蹈症、脊髄性肌萎縮和肌萎縮性側索硬化症等運動神經元疾病，以及神經損傷相關疾病等。10.權利要求1-4任一項所述的蛋白或核酸分子在製備用於治療肥胖症或與肥胖症相關疾病的藥物中的用途。11.權利要求1-4任一項所述的蛋白或核酸分子在製備用於治療視網膜退行性疾病及青光眼的藥物中的用途。12.—種藥物組合物，其含有權利要求l-4任一項所述的蛋白或核酸分子作為活性成分、和藥學上可接受的載體或賦性劑。13.根據權利要求12的藥物組合物，所述藥物組合物的給藥方式選自靜脈給藥、皮下給藥、肌肉給藥、鞘內給藥或黏膜給藥。14.根據權利要求13的藥物組合物，所述的黏膜給藥選自鼻腔黏膜給藥、口腔黏膜給藥或直腸黏膜給藥。15.根據權利要求12的藥物組合物，所述藥物組合物的製劑形式選自口服製劑或胃腸外製劑或其相應的緩控釋製劑。16.根據權利要求15的藥物組合物，所述藥物組合物的胃腸外製劑形式選自注射劑、凍幹製劑、吸入霧劑、皮膚塗抹劑、滴眼液劑或其緩控釋製劑。全文摘要本發明涉及一種蛋白轉導肽融合截短型人睫狀神經營養因子活性片段的蛋白以及含有編碼所述截短型活性片段的核苷酸序列的核酸分子。本發明涉及含有上述核酸分子的表達載體。本發明還涉及所述蛋白或核酸分子用於製備治療神經退行性疾病(包括阿爾茨海默病、帕金森綜合症、黑質退行性病變、多發性硬化症、亨延頓舞蹈症、脊髓性肌萎縮和肌萎縮性側索硬化症等運動神經元疾病等)的藥物的用途、用於製備視網膜退行性疾病、青光眼、肥胖症或與肥胖症相關的疾病及神經損傷相關疾病的藥物的用途。本發明特別涉及含有所述蛋白或核酸分子的藥物組合物，及其經注射、舌下含服、肺吸入、鼻腔黏膜及肛栓或皮膚吸收、滴眼液吸收等多種方式施用。文檔編號A61K9/19GK101555284SQ20081008897公開日2009年10月14日申請日期2008年4月10日優先權日2008年4月10日發明者周建平,孫曼霽,曲恆燕,前李申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所