冷凍食品的製作方法

2023-05-31 01:07:56 1

專利名稱：冷凍食品的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗凍蛋白(AFP)和含AFP的冷凍食品。
背景技術：
已經提出抗凍蛋白(AFP)用於改善食料的耐凍性。
對於本發明的目的，術語AFP的含義是本領域眾所周知的，即這些蛋白顯示抑制冰晶生長的活性。參見例如US5，118，792。
WO90/13571公開了化學生產或用重組DNA技術生產的抗凍肽。所述AFP適用於食品。
WO92/22581公開了可用於控制冰淇淋中的冰晶形狀的得自植物的AFP。該文獻也描述了通過用提取介質浸潤葉子而不需要破裂所述植物從植物細胞外間隙提取多肽組合物的方法。
WO94/03617公開了從酵母生產AFP及其在冰淇淋方面的可能應用。WO96/11586描述了微生物生產的魚AFP。
數個文獻也講述了分離和/或應用植物蛋白用於冷凍保護。冷凍保護蛋白的功能是保護植物膜抵抗霜害。然而，這些蛋白不具有重結晶抑制特性，因此不包含在所述術語AFP中。
Hincha在《植物生理學雜誌》(Journal of Plant Physiology)，1992，140，236-240中描述了從甘藍分離冷凍保護蛋白。Volger在Biochimicaet Biophysica Acta，412(1975)，335-349中描述了從菠菜分離冷凍保護的葉蛋白。Boothe在《植物生理學》(Plant Physiol)(1995)，108759-803中描述了從歐洲油菜(Brassica napus)分離蛋白。此外，認為這些蛋白是冷凍保護蛋白而不是AFP。Neven在《植物分子生物學》(Plant Molecular Biology)21291-305，1993中描述了菠菜冷凍保護蛋白的DNA特徵鑑定。Salzman在Am.J.Eno1.Vitic.，第44卷，第4期，1993中的ASEV/東部地區的第18屆年會的摘要和綜述中描述了在葡萄屬(Vitis)的芽中存在煮沸穩定的多肽。儘管所述蛋白類似於魚抗凍肽，但是它們是冷凍保護蛋白而不是AFP。Lin在《生物化學生物物理研究通訊》(Biochemical and Biophysical ResearchCommunication)，第183卷，第3期，1992，第1103-1108和Lin在《植物生理學》(Plant Physiology)(1992)，99519-525中描述了得自擬南芥屬(Arabidopsis Hakaira)的15kDa冷凍保護多肽。Houde在《植物雜誌》(The Plant Journal)(1995)8(4)，583-593中講述了得自小麥的冷凍保護蛋白。然而，直到現在仍然未將AFP應用到市售食品。其原因之一是成本高和獲得AFP的方法複雜。另一個原因是至今已經提出用於冷凍食品的AFP不能摻入標準配方混合料中，因為它們往往在加工過程中尤其是在巴氏消毒法步驟中變得不穩定。認為這種不穩定是由所述AFP變性引起的；這是在肽和蛋白質普遍觀察到的眾所周知的效應。
在我們非預公開的專利申請WO98/4148中，已經描述了特別好的AFP可以從天然來源例如地衣屬(Lichen)分離。
申請人現在已經能確定來自地衣屬特別有效的AFP的部分胺基酸序列。
因此本發明涉及可以得自地衣屬的AFP，所述AFP的表觀分子量約為24kDa，而N末端的胺基酸序列為A-P-A-W-M-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L具有與上述序列高度相似的序列的蛋白也包括在我們的發明範圍內。對於本發明的目的，其胺基酸序列與上述序列至少80％重疊的所有RI活性蛋白也包括在本發明範圍內。更優選重疊至少90％最優選重疊高於95％，例如與上述序列相同或僅有一個或二個胺基酸不同的胺基酸序列。
對於本發明的目的，兩種(部分)胺基酸序列的重疊程度可以如下計算(a)對所述兩種胺基酸序列進行序列對比並對相同並以相同順序出現的胺基酸數(X)進行計數(b)胺基酸的每個變化、缺失或添加變化記為1點，而總變化、缺失和添加記為(Y)。
(c)現在可以按X*100％/(X+Y)計算重疊度。
例如，N末端的(部分)胺基酸序列A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-T-A-H-G-G-L可以如下與對照進行序列對比A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-LA-P-A-W -M- D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L這產生相同位次相同胺基酸的總數17個。變化數為1個(在第四位W變成V)；添加數為2(第五位的V，第七位的G)，無缺失。因此總的變化、添加和缺失為3。這導致重疊度為17*100％/(17+3)=85％。
具有N末端(部分)胺基酸序列A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L的蛋白也因此包括在本發明中。
修飾型的上述蛋白也包括在本發明範圍內，因此所述修飾實際上不影響冰重結晶抑制特性，例如其糖基化型。
對於本發明目的，術語約24kDa的分子量是指用標準參比標記在SDS-PAGE上測定的20-28kDa範圍內的任何分子量，更優選該分子量為22-26kDa。
本發明的優勢AFP可以得自地衣屬，尤其是Umbilicaria antarctica物種。
儘管抗凍蛋白開始得自於地衣屬，但是用其它方法(例如用基因修飾技術)生產的抗凍蛋白也包括在本發明範圍內，因此例如對微生物或植物進行基因修飾以產生上述蛋白。這些蛋白也包括在所述術語「可得自地衣屬」。
能夠編碼上述AFP的核酸序列也包括在本發明範圍內。
含能夠編碼本發明AFP的核酸序列的載體也包括在本發明範圍內。
根據以上信息，還可能的是基因修飾其它天然來源，使得它們產生上文鑑定的有益的AFP。
申請人也已經發現，以上序列的AFP改善了冰重結晶抑制特性。測定冰重結晶抑制特性的合適的試驗描述於實施例，包括快速冷凍至至少40℃(例如-80℃)，然後於-6℃保藏一小時。按照本發明的AFP最好在冰重結晶抑制測定(如實施例中所述)後提供的冰顆粒大小為15μm或15μm以下，更優選5-15μm。
本發明的AFP可以方便地用於食品，優選用於冷凍食品或計劃冷凍的食品。在例如冷凍前通過巴氏消毒法或滅菌加熱的製品中特別優選使用AFP。在冷凍糖食製品中尤其優選使用。
這類食品的實例為諸如冰淇淋混合料的冷凍糖食混合料和冷凍前預定進行巴氏消毒的糖水冰糕混合料。這類混合料通常貯藏於室溫。合適的製品形式例如包裝於例如袋或小袋中的粉型混合料。所述混合料在例如加入水和任選的其它成分以及可任選充氣後能夠形成所述冷凍食品的基礎。
合適混合料的另一實例可以是必要時在加入其它組分和任選的其它充氣後可以冷凍的液體混合料(任選充氣)。
上述混合料的明顯優點是，所述AFP成分的存在使得所述混合料可以在靜止的條件下冷凍，例如在商店或家用冰箱中冷凍而不會形成不可接受的冰晶形狀，因而具有不同於通常通過靜止冷凍獲得的製品的結構。
非常方便的是，這些混合料可以包裝於密封容器中(例如紙盒、袋、盒、塑料容器等)。對於單個等份，所述包裝大小一般為10-1000g。對於多個等份，包裝大小高至500kg可能是合適的。所述所裝大小一般為10-5000g。
如上所述，其中使用所述AFP的優選製品是冷凍糖食，例如冰淇淋或糖水冰糕。優選AFP水平為成品重量的0.00001-0.5％。假如使用幹混合料或濃縮物，所述濃度可以較高以保證最終冷凍製品中的水平在上述範圍內。
對於本發明目的，術語冷凍糖食包括含乳冷凍糖食，例如冰淇淋、冷凍酸牛奶、冷凍果子露、清涼果子飲料、牛奶凍和冷凍蛋奶甜羹、糖水冰糕、granita和冷凍果糊。對於某些應用，不大推薦在發酵食品中使用。
在所述冷凍糖食品中的固體(例如糖、脂肪、食用香料等)水平最好高於4％(重量)，例如高於30％(重量)，更優選40-70％(重量)。
按照本發明的冷凍糖食可以用適合生產冷凍糖食的任何方法生產。然而，特別優選的是，在巴氏消毒前和所述冷凍過程開始前，充分混合所有所述配方成分。所述冷凍過程最好可以包括硬化步驟，例如至-30華氏度或更低。
將一滴3μl的所述樣品置於22mm蓋玻片上。然後在上面放置一個16mm直徑蓋玻片，在所述樣品上放置200g重量以保證均一的玻片厚度。蓋玻片的邊緣用透明指甲油密封。
將所述玻片放置在Linkham THM 600溫控顯微鏡載物臺上。將所述載物臺快速降溫(每分鐘50℃)至-40℃以產生大量小晶體。然後將所述載物臺溫度快速升高(每分鐘50℃)至-6℃並保持於該溫度。
於-6℃用Leica Aristoplan顯微鏡觀察到所述冰相。偏振光和λ片用來增強所述冰晶的對比度。用35mm顯微鏡照相術於T=0和T=1小時記錄所述冰相的狀態(冰晶的大小)。通過沿所述晶體的周邊畫線測定冰晶大小(長度)。把一批冰淇淋的每個單獨的冰晶的最大長度輸入詳細記錄表，在此表中對所述數據組進行分析以得到平均值和標準差。
測試冰重結晶抑制特性的另一方法如下用改進的「splat分析」(Knight等，1988)檢測抗凍活性。將在30％(w/w)蔗糖中的待研究的溶液2.5μl轉移到潔淨、適當標記的、16mm圓形蓋玻片上。第二張蓋玻片放置於所述溶液滴上，並在指與母指間將所述夾層結構擠壓在一起。將所述夾層結構放入在-80℃的乾冰盒中保持的己烷浴中。當所有夾層結構製備完備後，用在乾冰中預冷的鑷子將夾層結構從-80℃己烷浴轉移到保持在-6℃的含己烷的觀察室內。在轉移到-6℃後，可以看到夾層結構從透明變為不透明外觀。用攝像機記錄圖像並用20x目鏡取入圖像分析系統(LUCIA，Nikon)。在時間=0時記錄每個splat的圖像，並在30-60分鐘後再次記錄。比較兩個分析中的冰晶大小。如果與t=0時的大小相比，30-60分鐘時的大小相似或僅中度增大(即是說增大不足20％，更優選增大不足10％，最優選增大不足5％)，這表明冰晶重結晶抑制特性良好。
一般來說，這些試驗可用於任何含AFP和水的合適組合物。在這種試驗組合物中的AFP水平一般不是非常重要，而可以是例如0.0001-0.5％(重量)，更優選0.0005-0.1％(重量)，最優選0.001-0.05％(重量)，例如0.01％(重量)。
任何含AFP和水的合適組合物均可以用來進行所述試驗。然而，獲得純化型的AFP一般是不必要的。對於實際應用，通常製備天然物質的液體提取物或提取汁液，其中可以測試該提取物或汁液，這就應該足夠了。
將0.15g NH4SO4溶解於1ml上清液中，該溶液於4℃溫育30分鐘。於30，000g離心10分鐘後，將0.3g NH4SO4溶解於該步驟的上清液中，並將該溶液於4℃溫育30分鐘。將該溶液於30，000g離心10分鐘，並棄去上清液。將沉澱再懸浮於0.2ml水中，連續稀釋該溶液，在30％(w/w)蔗糖的水溶液中製備原始提取物用於半定量的splat分析。在所述原始提取物至高於200倍的稀釋液以及所述沉澱物至800倍的稀釋液中可以檢測到(用上述方法)splat活性，表明在所述NH4SO4沉澱物中已經收穫到存在於原始提取物中的總splat活性的二分之一以上。
於所述再懸浮的沉澱物中加入200μl 0.1M TrisHCl pH7.5，該溶液於10kDa截留microcon(Amicon)中濃縮至150μl。用SMART層析系統(Pharmacia)以100μl/分鐘的流速，將100μl該溶液上樣於在50mM Tris HCl pH 7.5預平衡的Q-Sepharose柱，以100μl收集流分。在50mM TrisHCl pH 7.5中洗出800μl後，將1.5ml內的0-0.5MNaCl梯度上該柱，於280nm監測所述洗出液。在30％(w/w)蔗糖中稀釋50倍後，按實施例Ⅰ中所述測試流分的splat活性。發現活性與在約0.1M NaCl洗脫、主要收集於流分14中的OD280峰有關。
採用SMART層析系統(Pharmacia)，將40μl流分14以流速40μl/分鐘上樣於在50mM TrisHCl pH 7.5中預平衡的Superdex 75凝膠滲透柱。於OD280和OD215監測洗出液，在上樣後從0.6ml開始以80μl收集流分，在1.1-1.6ml之間以50μl收集流分，在1.6-3ml之間以100μl收集流分。將1μl的每一流分在30％(w/w)蔗糖中稀釋25倍，並分析splat活性。發現活性與用流分9和10中1.2ml保留物洗脫的OD280和OD215峰有關。通過測定標準蛋白分子量標記(Sigma)的保留體積(Ve)和經藍葡聚糖上柱測定空隙容積(Vo)為0.91ml，從而校準所述Superdex柱。繪製log10Mr對Ve/Vo的標準曲線，測定與所述地衣splat活性有關的OD280峰的表觀分子量為30kDa。
合併從Superdex柱洗脫的32μl流分9和10，並在10kDa截留microcom(Amicon)中濃縮至10μl，將3.5μl 4×SDS-PAGE樣品緩衝液加至從Superdex柱洗脫的10μl流分9和10中以及從Q-sepharose柱洗脫的流分12-16中。在於95℃加熱5分鐘並於10，000g離心3分鐘後，將每種樣品10μl加樣至4％積層凝膠孔中，經12％0.75mm厚的SDS-PAGE微型凝膠(Biorad)電泳分離多肽。電泳後凝膠染色並在考馬斯亮藍中固定，在甲醇∶醋酸∶水(1∶4∶5)w/w中脫色。這顯示從Superdex柱洗脫的濃縮合併的流分9和10中的多肽的表觀分子量為24kDa。當所述凝膠用Biorad銀染色試劑盒按照廠商的說明進行銀染時，在從Q-sepharose柱洗脫流分14中和從Superdex柱洗脫的流分9和10中可檢測到相同表觀分子量的多肽。
在用基本上與上述相同的方法進一步純化蛋白後，從24kDa多肽獲得以下N末端胺基酸序列A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L。
採用與所述雙向分離的第一向凝膠組分相同、只是用Biolyte 3-5兩性物取代Biolyte 4-7兩性物組成的平板凝膠、純化地衣抗凍蛋白的單向等電聚焦，在銀染色後顯示一條等電點低於3.6的帶。
權利要求
1．可以得自地衣屬的抗凍蛋白以及該蛋白的修飾型和同種型，所述蛋白的表觀分子量為20-28kDa，其N末端胺基酸序列顯示與A-P-A-W-M-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L至少80％重疊。
2．具有以下N末端胺基酸序列的權利要求1的抗凍蛋白以及該蛋白的修飾型和同種型，所述胺基酸序列為A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L。
3．權利要求1或2的抗凍蛋白，其分子量為22-26kDa。
4．權利要求1或2的抗凍蛋白，顯示與權利要求1或2的部分序列至少90％重疊。
5．權利要求1或2的抗凍蛋白，顯示與權利要求1或2的部分序列100％重疊。
6．權利要求1的抗凍蛋白，其中所述修飾包括糖基化作用。
7．編碼一項或多項前述權利要求的抗凍蛋白的核酸序列。
8．包含按照權利要求1或2的抗凍蛋白的食品。
9．為冷凍糖食的按照權利要求8的食品。
全文摘要
可以得自地衣屬的抗凍蛋白以及該蛋白的修飾型和同種型,所述蛋白的表觀分子量為20—28kDa,其N末端胺基酸序列顯示與A－P－A－V－V－M－G－D－A－E－S－F－G－A－I－A－H－G－G－L至少80%重疊。
文檔編號A23G9/38GK1284085SQ98813206
公開日2001年2月14日 申請日期1998年12月23日 優先權日1998年1月22日
發明者C·M·賽德伯託姆, M·F·斯馬爾伍德, L·J·拜爾斯 申請人:尤尼利弗公司