一種應用懸浮晶片技術檢測致病性志賀氏菌方法

2023-06-30 04:34:11

專利名稱：：一種應用懸浮晶片技術檢測致病性志賀氏菌方法
技術領域：
：本發明屬分子生物學檢測領域，具體的是一種應用懸浮晶片技術對致病性志賀氏菌進行檢測。技術背景懸浮晶片技術是將基因晶片技術與流式細胞儀技術結合產生的一種新技術，是一種多重數據獲取和分析平臺，全名為"多功能多指標同步分析體系"(FlexibleMultipleAnalyteProfiling,xMap)，也稱為Multi-AnalyteSuspensionArray,有機整合了螢光編碼微球、雷射技術、微流體技術、快速信號處理和數據分析系統,即保證了信號質量,又提供高通量的新一代分子檢測技術平臺。懸浮晶片與傳統的基因晶片最大不同之處在於，傳統的基因晶片點樣在玻片或尼龍膜上，依靠坐標定位進行尋址，而懸浮晶片將檢測探針共價交聯到不同的色標微球上，根據色標微球上所帶的螢光素進行區分。懸浮晶片系統主要由三部分組成1、微球直徑5.6iim左右，由聚苯乙烯構成的，表面帶有約108個羧基位點，可與寡核苷酸探針和蛋白以肽鍵耦聯；2、螢光素微球中標記了紅色和橙色螢光素，每種分成10個濃度梯度，將微球分成可被識別的100種微球，當微球被635nm雷射激發後，能發射658nm和712nm的螢光；3、檢測儀因微球直徑5.6um，並被螢光標記，採用流式細胞儀技術原理進行檢測。原理每一種色標微球可通過羧基，與特定的分析物質(寡核苷酸探針、抗原、抗體等)共價結合。將標記生物探針的微球與待測物進行特異性的結合，再和帶有第三種螢光素的報告分子反應，在一個反應孔內可同時對一個樣本中的IOO種不同目的分子進行檢測。反應後，採用96孔板進行進樣。檢測儀自動將反應液吸起加入蠕動泵，泵入一個微細管中，在鞘液的作用下，單排分布的微球單個通過檢測通道。檢測通道中設有兩個雷射探頭，一個探頭可發射635nm波長的雷射，可激發標記微球的兩種螢光素，從而識別不同的色標微球，進行定性檢測；另一雷射探頭可激發報告分子的螢光素，通過測定微球所帶報告分子螢光信號的強度，可進行定量檢測。因此，懸浮晶片可進行定性定量檢測目標分子。當樣本中含有目的分子，目的分子與特定的微球所帶的探針吸附在一起時,兩道雷射所激發的螢光均可被檢測到;若樣本中不含目的分子，則僅能檢測到微球所帶的螢光。通過數位訊號處理器與計算機自動統計軟體，分析兩道雷射所激發螢光的波長和信號強度，從而判斷待檢樣本中幾種至數十種檢測目標物，並通過檢測螢光信號強度，對檢測物進行定量分析。自動加樣器依次將不同樣本加入蠕動泵中，樣本之間用一小段氣柱分隔開，這樣在連續分析過程中不但可以區分不同樣本，可還以防止樣本間的汙染。與其它蛋白質和核酸檢測方法相比較，懸浮晶片具獨特優點1)應用範圍廣微球表面的羧基可與核酸探針和蛋白分子耦聯，能對目的核酸和蛋白分子進行定性定量研究；2)敏感性高以微球作為反應載體，增加了反應物接觸面積；每個微球表面帶有約108個羧基位點，以共價鍵方式耦聯寡核苷酸探針、抗體或抗原，探針密度高，產生的信號強；使用螢光檢測，放大了反應信號，敏感性大大提高。3)重複性好所進行的生物反應是在液相環境中進行的，利於保持核酸、蛋白等生物分子天然構象，克服了傳統晶片空間效應的影響，也更利於探針和被檢物質的反應，提高了檢測的準確性；4)信噪比低在微細管中對單個微球進行檢測，不存在本底影響檢測的問題，無需洗脫去除本底；5)高通量可以同時對同一樣本中的多重不同目的分子進行定性定量分析，即提高了檢測信息通量，又節約了樣本用量；6)快速高效大大提高了反應速度和檢測速度。由於所進行的生物反應是在液相環境中進行的，雜交僅需15分鐘即可完成，提高了反應速度；在35—60分鐘內，可對96個不同樣本分別同時進行多達100種指標的檢測；利用96孔板和自動進樣系統，可連續進行nX96個樣品的檢測。7)成本低製備過程無需特殊設備，只進行羧基與氨基間的脫水成肽反應即可，簡單易行；由於是液體儲存方式，一次製備可多次使用，平均每個指標檢測成本僅需2.5—5.0元；8)易於標準化基於上述特點，使得該技術能夠做到標準化，易於試劑盒的研製和推廣。目前，懸浮晶片是美國FDA唯一批准用於臨床診斷(自身免疫病檢測和人類白細胞抗原分型)的生物晶片。人類對志賀氏菌高度敏感，只需少於十個菌即可引起人的感染，因此其傳染性強，危害性大。志賀氏菌可通過水、食物傳播，引起人類腹瀉及痢疾等。據國內相關資料顯示，志賀氏菌在我國感染性腹瀉病原菌中居首位；WHO年度報告指出，在亞非拉各國細菌性腹瀉病例多達1.5-2.5億人，死亡65萬。國家質量監督檢驗檢疫總局2002年第25號、26號令中規定志賀氏菌為食品中必檢項目。志賀氏菌中70%菌群具致病性，而志賀氏菌的主要檢測方法平板培養、免疫學方法，只能對志賀氏菌進行檢測，不能鑑定出是否具有致病性。有關文獻報到(PhantouamathB,2003)，致病性志賀氏菌均具有侵襲相關位點基因(invasionassociatedlocus,Ial)，在分子水平上實現對Ial基因的鑑定，可有效鑑定致病性志賀氏菌，為臨床、食品生產、環境健康提供參考信息。
發明內容本發明目的旨在提供一種檢測致病性志賀氏菌的懸浮晶片。本發明的懸浮晶片包括診斷微球和與此微球耦聯的特異性寡聚核苷酸探針，其中該寡核苷酸探針序列為侵襲相關位點基因(invasionassociatedlocus,Ial)的一段序列。本發明還公開了一段寡核苷酸探針序列，該序列為5'-NH2-(CH2)12-AATGTCCATCAAACCCCACTC-3'，如序列表3所示，並在5'進行NH2-(CH2),2修飾。此發明的懸浮晶片還包括一對特異性的引物，其上遊引物為B-Ial-F:5'-Biotin-CTGGATGGTATGGTGAGGTTT-3'(見序列表l，進行5'Biotin標記)；下遊引物為IpaH-R:5'-AGGAGGCCAACAATTATTTCC-3'(見序列表2)。上述引物可擴增包含上述探針序列的一段Ial基因的序列。應用本發明懸浮晶片檢測致病性志賀氏菌是通過以下方法進行的。根據致病性志賀氏菌Ial基因設計併合成用於PCR擴增的特異性引物，如序列表中序列1和2所示，並對其中一條引物進行Biotin修飾；按常規方法製備待檢樣本基因組DNA作為模板，使用上述特異性引物進行PCR擴增，同時使PCR產物帶上Biotin修飾；將PCR產物與製備的懸浮晶片雜交，也就是與耦聯在微球上的探針進行雜交，對雜交懸浮晶片進行鏈黴親和素化藻紅蛋白標記，然後通過流式細胞儀檢測螢光信號。本發明的另一目的在於提出一種製備上述懸浮晶片的方法。本發明所提供的製備懸浮晶片的方法，具體包括以下步驟1)製備寡聚核苷酸探針；2)用純水稀釋氨基修飾的探針；3)將儲備的微球振蕩，然後轉移到棕色EP管中；4)離心收集微球，加入MES液進行振蕩；5)向懸浮微球中加入上述探針，並振蕩；6)在微球溶液中加入新配製的10mg/mlEDC，振蕩；然後進行溫育；7)再次向微球溶液中加入新配置的10mg/mlEDC，振蕩，然後進行溫育；8)向微球溶液中加0.02。/。Tween-20，離心收集微球；9)用0."/oSDS重懸微球，離心收集微球；用TE懸浮微球；10)用血球計數板計算微球的個數，2—8。C，避光保存。本發明的另一目的提供一種克服PCR假陽性的方法。本發明採用的UNG一Taq酶體系，有效的控制了PCR假陰性產生。具體方法是PCR反應體系中，將dTTP量減半，由dUTP替代，並加入0.05U的UNG(尿嘧啶DNA糖苷酶)。PCR產物中被摻入一定量的dUTP,UNG通過打斷核酸鏈上dUTP上的糖苷鍵，使含dUTP的核酸不能作為模板被識別。在運行PCR程序之前先37'C溫育5min，使UNG充分消化PCR產物，94"C模板變性時，UNG失活，進行正常PCR反應。圖1特異性試驗結果；圖2靈敏度試驗結果；具體實施例方式為進一步說明本發明在致病性志賀氏菌檢測中的應用，特舉以下較佳實施例進行說明，但本發明的應用並不限於實施例。實施例一引物的設計和合成1)序列獲得通過對致病性志賀氏菌進行全基因組分析，選取其特異性基因Ial作為靶序列，並從GenBank公共資料庫中獲得此基因序列，編號為AY206439;2)設計引物採用PrimerPremier5.0軟體設計引物，相關參數為Tm值55.0°C—59.0°C，GC值40.0%—60.0%，PCR產物大小為lOObp—500bp，引物大小22±3bp;3)引物選擇將軟體輸出的引物進行適當的手動調節，增加或減少幾個鹼基，然後在GenBank進行在線Blast比對，選取特異性高的引物，並將其中的一條進行5'末端Biotin標記。上遊引物序列為B-Ial-F:5'誦Biotin-CTGGATGGTATGGTGAGGTTT-3'，下遊引物為IpaH國R:5'-AGGAGGCCAACAATTATTTCC-3'，擴增片段大小為320bp;4)引物合成上海生工合成下遊引物Ial-R，大連TakaRa合成Biotin標記的上遊引物B-Ial-F。實施例二探針的設計和合成1)序列獲得在上述擴增片段非引物區設計探針；2)設計探針採用PrimerPremier5.0軟體設計探針，選定HybridizationProbes命令，在Anti-sense鏈上設計探針，參數同實施例一；3)探針選擇將軟體輸出的探針進行適當的手動調節，增加或減少幾個鹼基，然後在GenBank進行在線Blast比對，選取特異性高的探針，在5'末端進行NH2-(CH2)12修飾，選定的探針序列為Ial-Probe:5'-NHr(CH2)12-AATGTCCATCAAACCCCACTC-3，；4)探針合成大連TakaRa合成上述探針。實施例三懸浮晶片的製備方法一、材料二、方法結果1.用純水稀釋氨基修飾的探針到lmM(lnanomole/Vl);2.將儲備的微球振蕩20sec;3.取20(^1微球轉移到棕色EP管中；4.收集微球，8000g,離心l-2min;5.棄上清，加入50^10.1MMES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonicacid，2-(N-嗎啉代)乙磺酸)液pH4.5，振蕩20sec;6.向懸浮微球中加入2pllmM的探針，振蕩20sec;7.準備新鮮的10mg/mlEDC(l-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride,l-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺)，用dH20;8.向微球溶液中加入2.5!al新配置的10mg/mlEDC,振蕩；9.在室溫黑暗條件下溫育30min;10.再次準備新鮮的10mg/mlEDC，用dH20;11.向微球溶液中加入2.5^1新配置的10mg/mlEDC，振蕩；12.在室溫黑暗條件下溫育30min;13.向微球溶液中加1.0mL0.02%Tween-20;14.8000Xg離心1—2min，收集微球；15.棄上清，用1.0mL0.1。/。SDS重懸微球；16.8000Xg離心1—2min，收集微球；17.用100plTE，pH=8.0，懸浮微球，18.用血球計數板計算微球的個數19.將微球2—8℃,避光保存備用。實施例四懸浮晶片快速檢測致病性志賀氏菌1)TIANampBacteriaDNAkit試劑盒提取待檢樣本基因組DNA。2)PCR擴增目的片段，反應條件如下表格1PCR反應體系tableseeoriginaldocumentpage11PCR反應程序為94℃變性3min;運行35個循環94℃30sec,53℃30sec:72℃40sec;最後，72℃延伸3min。3)雜交雜交液組成33.3ul1.5XTMAC(tetramethylammoniumchloride，氯化四甲銨)，5ul上述PCR產物，加入5000個與探針耦聯的微球，1XTE將體積補充到50ul。將雜交液在95℃變性4min，52℃雜交15min以上。4)檢測將上述雜交後的溶液全部轉移到96孔濾板中，真空過濾收集微球，用2pg/mlS-R-PE(Streptavidin-R-phycoerythrin，鏈黴親和素化藻紅蛋白)重懸微球，置52℃:10min，Luminex檢測。實施例五懸浮晶片的特異性鑑定和靈敏度驗證特異性試驗用本發明的懸浮晶片對不同菌株進行特異性驗證，其檢測範圍包括以下三類菌株a)屬於前述的4株致病性志賀氏菌和一株非致病性志賀氏菌；b)與志賀氏菌親緣關係較近的大腸桿菌、沙門氏菌；C)其它有關菌株。菌株具體信息如下_表格2_試驗編號il來源與編號試驗編號來源與編號^_枸櫞酸桿菌_CMCC48017_^_PCRBlank針對上述菌株，按實施例四中的方法進行檢測，檢測結果顯示5株志賀氏菌4株呈陽性結果，可有效鑑定致病性志賀氏菌；非志賀氏菌均呈陰性結果，特異性達100%。靈敏度試驗按實施例四中的方法進行靈敏度試驗，以痢疾志賀CMCC51197研究對象，將提取的模板進行定量，所提模板的量為11.8ng/ml，依次進行IO倍稀釋，1213141516171819202122埃希氏大腸桿菌埃希氏大腸桿菌埃希氏大腸桿菌埃希氏大腸桿菌埃希氏大腸桿菌埃希氏大腸桿菌副溶血霍亂弧菌副溶血霍亂弧菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌甲型溶血性鏈球菌乙型溶血性鏈球菌丙型溶血性鏈球菌肺炎克雷伯氏菌陰溝腸桿菌產氣腸桿菌ATCC25922ATCC8739國家CDC分離株國家CDC分離株國家CDC分離株國家CDC分離株ATCC濯8s國家CDC分離株國家CDC分離株國家CDC分離株國家CDC分離株ATCC33847ATCC11802ATCC6538CMCC26003CMCC26069CMCC32213CMCC32210CMCC32206CMCC46117CMCC45301CMCC4510324臘樣芽孢桿菌CMCC6330125甲型副傷寒沙門氏菌CMCC5000126乙型副傷寒沙門氏菌CMCC5009427丙型副傷寒沙門氏菌CMCC5001728痢疾志賀氏菌CMCC5119729痢疾志賀氏菌本室保30福氏志賀氏菌CMCC5106231鮑氏志賀氏菌CMCC5126532宋內志賀氏菌CMCC5133433霍亂弧菌Ol86008434霍亂弧菌0139贈35嗜肺軍團桿菌廣東CDC贈36嗜肺軍團桿菌廣東CDC贈37A型肉毒梭菌62A株38B型肉毒梭菌621株39E型肉毒梭菌619株40A型產氣莢膜本室保41B型產氣莢膜本室保42D型產氣莢膜本室保43綠膿桿菌ATCC卯2744單增李斯特菌本室保45小腸結腸炎耶爾森氏CMCC52203菌靈敏度試驗中加入的模板量分別為L18fg、11.8fg、118fg、U8pg、11.8pg、118pg,以純水做陰性對照。結果顯示，靈敏度達1.18fg(相當於2—3個細菌數)，可滿足臨床樣本及環境樣本檢測需要。序列表中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所—種應用懸浮晶片技術檢測致病性志賀氏菌方法3121DNA人工序列1CTGGATGGTATGGTGAGGTTT21221DNA人工序列2AGGAGGCCAACAATTATTTCC21321DNA人工序列3AATGTCCATCAAACCCCACTC2權利要求1.一種用於致病性志賀氏菌檢測的懸浮晶片，包括診斷微球和固定在該診斷微球上的寡聚核苷酸探針，其特徵是該寡聚核苷酸探針是致病性志賀氏菌侵襲相關位點基因(invasionassociatedlocus，Ial)上的一段序列。2.根據權利要求1所述用於致病性志賀氏菌檢測的懸浮晶片，其中寡聚核苷酸探針序列如序列表中序列3所示，在其5'進行NH2-(CH2;h2修飾3.根據權利要求1或2所述用於致病性志賀氏菌檢測的懸浮晶片，該晶片可鑑定和檢測致病性志賀氏菌。4.根據權利要求1或2所述志賀氏菌檢測的懸浮晶片，其特徵在於包括一對特異性引物，引物序列如序列表中序列1和2所示，並對序列1進行5'Biotin修飾。5.權利要求1或2所述用於志賀氏菌檢測的懸浮晶片的製備方法，包括如下步驟製備寡聚核苷酸探針；用純水稀釋氨基修飾的探針；將儲備的微球振蕩，然後轉移到棕色EP管中；離心收集微球，加入MES液進行振蕩；向懸浮微球中加入上述探針，並振蕩；在微球溶液中加入新配製的EDC溶液，振蕩；然後進行溫育；再次向微球溶液中加入新配置的10mg/mlEDC，振蕩，然後進行溫育；向微球溶液中加0.02n/。Tween-20，離心收集微球；用0.P/。SDS重懸微球，離心收集微球；用TE懸浮微球；用血球計數板計算微球的個數，2—8'C，避光保存。6.權利要求1或2所述用於致病性志賀氏菌檢測的懸浮晶片使用方法，包括以下步驟a)根據致病性志賀氏菌Ial基因設計併合成用於PCR擴增的特異性引物，並對其中一條引物進行Biotin修飾；b)按常規方法製備的待檢樣本基因組DNA，並使用步驟a)中的引物對待檢樣本基因組DNA進行PCR擴增，同時使PCR產物帶上Biotin修飾；c)將步驟b)中的PCR產物與權利要求1中所述懸浮晶片雜交；d)對步驟c)中雜交懸浮晶片進行鏈黴親和素化藻紅蛋白標記，並對其檢測螢光信號。7.根據權利要求6所述的一種檢測致病性志賀氏菌的方法，其特徵是上述步驟b)所建立的PCR反應體系如下PCR反應體系組份加入體積10xPCRBuffer(含MgCl2)2pldGTP、dCTP、dATP(2.5mmo1)各1.6^dTTP、dUTP(2.5mmo1)各O単B-Ial-F(1|xmol/L)1|LllIal誦R(1pmol/L)1pira《DNAPolymerase(5U/|til)0.1|LllUracil國DNAGlycosylase(1U/|li1)0.05|il所提樣本基因組DNA1piddH208,45julTotal20(ilPCR反應程序為37°C溫育5min;94°C變性3min;運行35個循環94°C30sec，53。C30sec，72°C40sec;最後，72°C延伸3min。8.根據權利要求6所述使用方法，其中雜交溫度為52°C，雜交時間為大於15min。全文摘要本發明涉及一種用於致病性志賀氏菌檢測的懸浮晶片及其檢測方法，該懸浮晶片包括微球載體和固定在載體上的寡聚核苷酸探針，其中該寡聚核苷酸探針是從致病性志賀氏菌篩選的特異性基因侵襲相關位點(invasionassociatedlocus，Ial)基因中的一段DNA序列。利用設計的引物將待檢樣品基因組DNA擴增並標記後，利用上述懸浮晶片進行雜交，根據雜交螢光強度，可判斷待檢樣品中是否含有致病性志賀氏菌。懸浮晶片檢測靈敏度高，可達到fg級基因組DNA水平，可滿足臨床樣本和環境樣本檢測需要，並具特異性高、操作簡單、成本低等特點，易於推廣。並採用UNG-Taq酶PCR反應體系，大大降低了PCR假陽性結果。文檔編號C12Q1/04GK101403000SQ20081018050公開日2009年4月8日申請日期2008年11月27日優先權日2008年11月27日發明者劉豔華,琳康,王景林,趙金銀,姍高申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所