一種膨潤土單層剝離納米片組裝酶及其製備方法
2023-06-30 14:27:46 1
一種膨潤土單層剝離納米片組裝酶及其製備方法
【專利摘要】本發明屬於生物工程【技術領域】，公開了一種膨潤土單層剝離納米片組裝酶及其製備方法，利用超聲和攪拌將層狀膨潤土剝離成單片的納米膠體溶液，通過調節酶和膨潤土薄片端面的表面電荷，使酶分子吸附在帶負電的膨潤土納米片層表面，同時利用膨潤土帶負電的片層表面和帶正電的端面之間的靜電吸引，組裝成「卡片屋」型的固定化酶。本發明利用酶分子與膨潤土納米片層表面的陽離子之間的離子交換，使酶分子分散的固定在原有的陽離子點位上，有效避免了酶固定化過程中的聚集問題，大大提高了酶分子的負載量，本方法得到的固定化酶的催化活性得到顯著提高，克服了一般固定化酶在水相中的催化活性要低於游離酶的缺點，同時實現了生物酶的多批次穩定化操作。
【專利說明】一種膨潤土單層剝離納米片組裝酶及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物工程【技術領域】，尤其涉及了一種膨潤土單層剝離納米片組裝酶及其製備方法。
【背景技術】 [0002]生物酶是一種高效專一的催化劑，具有反應條件溫和、能耗低、副產物少等優點，廣泛應用於化學產品(中間體)的製備、紡織印染、環境修復等領域。但是由於酶容易失活、穩定性差、難以回收利用等致命弱點，再加上酶製劑高昂的價格，極大的限制了其在工業化生產中的應用。酶的固定化是一種提高催化穩定性、實現酶循環利用行之有效的方法。但生物酶在固定化過程中，由於載體對酶空間構象產生影響，以及包括空間位阻和傳質阻力等影響，其催化活性往往會有所下降。近年來研究發現，在合適的條件下，以水滑石、磷酸鋯等層狀無機材料為載體負載生物酶蛋白分子可以製備得到高效穩定、具有層狀結構的固定化酶。如An等先將層間插入乳酸分子的水滑石剝離，然後將脂肪酶結合到剝離的水滑石片層上，利用水滑石的「記憶功能」，組裝成具有層狀結構的固定化脂肪酶(AICHE J.2010，56:2677-2686)。中國專利CN1884515A公開了一種納米片狀氧化鈦組裝酶的方法，該方法利用有機胺剝離層狀鈦酸鹽，得到的納米片吸附血紅蛋白，然後自組裝成具有層狀結構的固定化酶。另外，氧化還原酶、肌紅蛋白等也能通過類似的方法插入到磷酸鋯等層狀結構中，製備得到催化活性較高、具有層狀結構的固定化酶(J.Am.Chem.Soc.2000，122:830-837;J.Am.Chem.Soc.2004，126:14346-14347;Langmuir, 2004，20:10231-10237; J.Mater.Chem.2005，15:3838-3843)。但是上述製備過程中，都加入了諸如有機胺、乳酸、氨丙基三乙氧基矽烷等有機化合物，有些還加入強酸強鹼，這些對酶蛋白和環境都會產生不利影響。
[0003]膨潤土作為一種無機層狀礦物材料，具有儲量豐富、價格低廉、機械強度高、比表面積大、生物相容性好、結構和功能可調等特點，其層狀結構由長、寬和高分別約為lOOnm、IOOnm和Inm的納米薄片堆積排列而成，片層之間的層間距約為1.2nm左右。中國專利CN1286719C、CN101823722A和CN101049941A等公開了幾種將膨潤土層狀結構剝離製備無機凝膠的方法，這些方法大都分為離心分離、製漿、改性和膠化等步驟，製備工藝相對比較複雜，主要用於製備應用在石油化工、塗料、造紙和紡織等行業，具有高純度、高粘度的膨潤土無機凝膠。迄今為止，將膨潤土剝離用於負載生物酶大分子還未有報導。
[0004]目前，膨潤土負載生物酶的方法主要有層間插入和外表面吸附兩種。Lin等利用聚氧丙烯二胺(POP)等高分子化合物插入到鈉基膨潤土將其層間距撐開，然後將牛血清白蛋白、a -糜蛋白酶等生物大分子插入層間製備固定化酶(Langmuir，2007, 23:1995-1999; J.Phys.Chem.B, 2007, 111:10275-10280;Bioconjugate Chem.2008，19:138-144)。由於該方法加入了大量的聚合物，對酶蛋白在負載過程中容易產生擠壓、幹擾以及空間位阻，從而導致酶催化活性的下降。而且，該方法由於無法實現酶分子在載體層間和外表面的可控結合，部分結合在膨潤土外表面的酶蛋白很容易脫落，影響酶的催化穩定性。其他已報導的以膨潤土為載體製備固定化酶的方法主要是將酶分子直接吸附在膨潤土外表面(如圖1所不)(Process Biochem.2005，40:2155_2159;Appl.Clay Sc1.2008, 43:289-295;Appl.Clay Sc1.2008,43:308-316;Mater.Sc1.Eng.B-Adv.2009, 165:173-177;Bioresour.Technol.2010, 101:1587-1594)。在此過程中，有部分生物酶的胺基酸殘基通過靜電吸引、疏水和氫鍵作用力進入了膨潤土層間，但是整個酶分子由於體積太大，無論是鈉基膨潤土還是有機改性膨潤土的層間都無法容納酶分子進入層間。利用這些方法製備得到的固定化酶，其酶分子大部分吸附在膨潤土外表面，直接暴露在反應介質中，而且生物酶與載體之間的疏水、氫鍵等作用力相對較弱，酶分子之間容易發生聚集和重疊吸附，因此固定化酶催化性能的提高也非常有限。此外，由於生物酶基本沒有接觸到表面積更大的膨潤土片層表面，因此載體對酶的負載量也比較低，造成載體使用效率的低下。本發明人也曾對膨潤土及改性膨潤土外表面吸附脂肪酶進行了研究，發現該固定化酶的載酶量不高(最大負載量約為80mg/g載體)，在水相中的催化活性也遠低於游離酶，而且隨著負載量的增加固定化酶的催化活性也急劇下 降。
【發明內容】
[0005]本發明針對現有技術存在的缺陷，提供了一種載酶量和穩定性高，同時也能保持高催化活性的膨潤土單層剝離納米片組裝酶及其製備方法。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明通過下述技術方案得以解決:
[0007]—種膨潤土單層剝離納米片組裝酶的製備方法，包括以下步驟:
[0008]步驟(1):在pH4_6的緩衝液中加入電解質，然後加入膨潤土製成膨潤土懸浮液，室溫下，將膨潤土懸浮液置於超聲儀中超聲處理，同時攪拌l_5h，製得膨潤土單層納米薄片膠體溶液；
[0009]步驟(2):取步驟(1)製得的膠體溶液，加入生物酶與膠體溶液進行混合，在25°C下振蕩10-24h，反應結束後進行離心得到沉澱，該沉澱用去離子水潤洗至中性，冷凍乾燥後得到產物固定化酶。本發明方法通過超聲和攪拌將膨潤土層狀材料剝離成比表面積大的單層納米薄片，分散在含有一定量的電解質的緩衝體系中製成膠體溶液，通過控制納米片層的表面和端面電荷、酶分子的表面電荷，使酶分子通過離子交換吸附在帶負電的單層納米片表面，憑藉納米片層帶正電的端面和帶負電的表面之間的靜電吸引組裝成固定化酶。上述製備過程中沒有加入任何有機溶劑和有機化合物，條件溫和，真正實現了固定化酶的綠色製備。
[0010]作為優選，所述的步驟(1)中的電解質選取NaCl、Na2C03、Na2S04中任一種，電解質的加入能夠減弱膨潤土層間正負離子之間的吸引，使原來緻密的層間結構變得蓬鬆，從而促進膨潤土的剝離。
[0011 ] 作為優選，所述的步驟(1)中的膨潤土採用鈉基膨潤土、鈣基膨潤土中任一種。膨潤土片層較高的機械強度，以及片層端面與表面之間的靜電吸引使大部分的酶分子被保護在載體中，有效的減少了催化過程中酶分子的脫落問題，提高了固定化酶的催化穩定性。
[0012]作為優選，所述的步驟(1)超聲處理頻率為20-60KHZ，經合適頻率的超聲波衝擊和空化作用，有效破壞膨潤土的層間結合力，使膨潤土單層薄片易於剝離。
[0013]作為優選，所述的步驟(2)中生物酶的加入量為膨潤土質量的1-5倍(生物酶/膨潤土為1:1-1:5, w/w)0生物酶分子與單層薄片上的鈉離子的離子交換使酶分子能分散的固定在片層表面原來的鈉離子點位上，既實現了目標酶蛋白分子的濃縮(去除了酶製劑中電負性不同、或帶電量弱的雜蛋白)，同時又有效的避免了酶分子在催化過程中的聚集，使酶催化活性得到顯著增強。
[0014]作為優選，所述的步驟(2)中離心速率為10000-15000rpm。由於是納米型固定化酶，離心速率過低的話，離心效果較差，離心速率過高的話，對設備和能耗的要求過大。
[0015]作為優選，所述的膨潤土的濃度為0.1%-1.0%。
[0016]作為優選，所述的電解質的濃度為0.1%-1.0%。電解質濃度過大會影響材料的結構和性能，以及固定化酶的催化活性。
[0017]作為優選，所述的生物酶為蛋白酶、脂肪酶、酯酶等酶催化劑中的其中一種。不同的酶負載後，負載量和催化活性有所差別，但都有不同程度的提高。
[0018]本發明利用酶分子與膨潤土納米片層表面的陽離子(Na+、Ca2+)之間的離子交換，使酶分子分散的固定在原有的陽離子點位上，不僅有效避免了酶固定化過程中的聚集問題，而且大大提高了酶分子的負載量(可以實現每g載體3.5g酶蛋白的最高負載量)。
[0019]本發明還提供了一種利用上述方法製得的膨潤土單層剝離納米片組裝酶(如圖2所示)。
[0020]本發明由於採用了以上技術方案，具有顯著的技術效果:
[0021](1)製備過程中沒有加入任何有機溶劑和有機化合物，條件溫和，真正實現固定化酶的綠色製備。
[0022](2)剝離出來的膨潤土單層納米薄片較大的比表面積能實現Ig載體負載最高達
3.5g生物酶的載酶量，提高了載體的利用效率。
[0023](3)生物酶分子與單層薄片上的鈉離子的離子交換使酶分子能分散的固定在片層表面原來的鈉離子點位上，既實現了目標酶蛋白分子的濃縮(去除了酶製劑中電負性不同、或帶電量弱的雜蛋白)，同時又有效的避免了酶分子在催化過程中的聚集，使酶催化活性得到顯著增強。
[0024](4)膨潤土片層較高的機械強度，以及片層端面與表面之間的靜電吸引使大部分的酶分子被保護在載體中，有效的減少了催化過程中酶分子的脫落問題，提高了固定化酶的催化穩定性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1生物酶負載在膨潤土外表面的結構示意圖。
[0026]圖2生物酶負載在膨潤土納米薄片組裝酶的結構示意圖。
[0027]圖3膨潤土納米片組裝酶的製備工藝流程圖。
[0028]圖4實施例1中膨潤土未負載脂肪酶(a)的X-射線衍射圖。
[0029]圖5實施例1中負載脂肪酶後(b)的X-射線衍射圖。
[0030]圖6實施例2中固定化脂肪酶的TEM圖。
【具體實施方式】
[0031]下面結合附圖1至附 圖6與實施例對本發明作進一步詳細描述:[0032]實施例1
[0033]稱取NaC14.5g溶於500mLpH4.0的醋酸鹽緩衝溶液中，加入鈉基膨潤土 5g製成濃度為1%的膨潤土懸液。室溫下，將該懸液置於超聲儀中超聲處理(頻率為40KHz)，同時開啟攪拌機在3000rpm下攪拌,每超聲Ih後停止20min。連續處理4h後，3000rpm下離心IOmin棄去沉澱，加PH4.0醋酸鹽緩衝液稀釋得到lmg/mL的膨潤土剝離納米薄片膠體溶液。取IOOmL該膠體溶液，加入IOOmg牛胰脂肪酶混合，混合液在25°C、200rpm下振蕩20h。結束後，將該混合液在15000rpm下離心lOmin，得到沉澱。用去離子水洗滌沉澱數次至中性，冷凍乾燥12h後得到固定化脂肪酶固體。將上清液和洗滌液合併，利用Bradford法測定合併溶液中的剩餘蛋白量為Omg，得到脂肪酶在載體上的負載量為lOOmg，負載的脂肪酶蛋白與載體的質量比為1:1。以脂肪酶水解對硝基苯棕櫚酸酯為模式反應，測定不同脂肪酶負載量下固定化脂肪酶的催化活性，發現固定化酶最高催化活性為游離酶的5倍。每批反應結束，將固定化酶離心後用於下一批反應，考察固定化酶的重複利用性能。發現反應10批之後，固定化酶的催化活性仍保持為初始活性的85%以上，顯示出良好的操作穩定性。
[0034]利用XRD測定膨潤土單層薄片負載和未負載脂肪酶情況下的層間距變化，發現未負載脂肪酶的膨潤土薄片經乾燥後，在原來的位置上仍然出現了晶體衍射峰，說明該載體恢復成一定的層間結構；而單層薄片負載脂肪酶後，其晶體衍射峰完全消失，說明膨潤土單層納米薄片經脂肪酶負載後變成了無定型的結構。由於在PH4.0條件下，膨潤土納米薄片的端面帶正電，表面帶負電，通過靜電吸引將端面和表面連接起來，使固定化酶形成了「卡片屋」式的結構。
[0035]實施例2
[0036]稱取Na2S043g溶於500mLpH4.0的醋酸鹽緩衝溶液中，加入鈉基膨潤土 5g製成濃度為1%的膨潤土懸液。室溫下，將該懸液置於超聲儀中超聲處理(頻率為50KHz)，同時開啟攪拌機在2500rpm下攪 拌,每超聲Ih後停止20min。連續處理3h後,3000rpm下離心IOmin棄去沉澱,加pH4.0醋酸鹽緩衝液稀釋得到2mg/mL的膨潤土剝離納米薄片膠體溶液。取該溶液 IOOmL,加入脂肪酶 YLL (Yarrawia lipolytica lipase) 400mg,混合後在 25°C、200rpm下振蕩24h。結束後,將混合液在15000rpm下離心IOmin,得到沉澱。用去離子水洗滌沉澱數次至中性，冷凍乾燥12h後得到固定化脂肪酶固體。合併上清液和洗滌液，利用Bradford法測定合併溶液中的蛋白量為42mg，得到脂肪酶在載體上的負載量為358mg，負載的脂肪酶蛋白與載體的質量比為3.58:1。以脂肪酶水解對硝基苯棕櫚酸酯為模式反應，測定不同脂肪酶負載量下固定化脂肪酶的催化活性，發現固定化酶最高催化活性為游離酶的3.5倍。每批反應結束，將固定化酶離心後用於下一批反應，考察固定化酶的重複利用性能。發現反應10批之後，固定化酶的催化活性仍保持為初始活性的90%以上，顯示出良好的操作穩定性。利用XRD測定發現，固定化脂肪酶固體也沒有出現相應的衍射峰(圖略)，說明膨潤土載體原有的層間結構不復存在，推測固定化酶形成了「卡片屋」式的結構。同時，該固定化酶的TEM (磷鎢酸負染法)圖(如圖6所示)顯示，酶蛋白負載量得到提高的同時，酶分子都很分散的固定在載體材料上，因此能保持高催化活性。
[0037]實施例3
[0038]稱取NaC14.5g溶於500mLpH6.0的磷酸鹽緩衝溶液中，加入鈣基膨潤土 2.5g製成濃度為0.5%的膨潤土懸液。室溫下，將該懸液置於超聲儀中超聲處理(頻率為60KHz)，同時開啟攪拌機在3000rpm下攪拌,每超聲Ih後停止20min。連續處理5h後,3000rpm下離心IOmin棄去沉澱,加入pH6.0磷酸鹽緩衝液稀釋得到0.5mg/mL的膨潤土剝離納米薄片膠體溶液。取該溶液IOOmL,加入180mg胰蛋白酶，在25°C、200rpm下振蕩24h。結束後，將該反應液在15000rpm下離心IOmin,得到沉澱。用去離子水洗漆沉澱數次至中性,冷凍乾燥12h後得到固定化胰蛋白酶固體。合併上清液和洗滌液，利用Bradford法測定合併溶液中的蛋白量為30mg，得到蛋白酶在載體上的負載量為150mg，負載的胰蛋白酶與載體的質量比為3:1。以蛋白酶水解BAEE為模式反應，測定不同蛋白酶負載量下固定化胰蛋白酶的催化活性，發現固定化酶最高催化活性為游離酶的2.8倍。每批反應結束，將固定化酶離心後用於下一批反應，考察固定化酶的重複利用性能。發現反應6批之後，固定化酶的催化活性仍保持為初始活性的85%以上，顯示出良好的操作穩定性。利用XRD測定發現，固定化胰蛋白酶固體沒有出現相應的衍射峰(圖略)，說明膨潤土載體原有的層間結構不復存在，推測固定化酶形成了 「卡片屋」式的結構。
[0039]實施例4
[0040]稱取Na2C032.5g溶於500mLpH5.0的醋酸鹽緩衝溶液中，加入鈣基膨潤土 3g製成濃度為0.6%的膨潤土懸液。室溫下，將該懸液置於超聲儀中超聲處理(頻率為40KHz)，同時開啟攪拌機在3000rpm下攪拌,每超聲Ih後停止20min。連續處理5h後,3000rpm下離心IOmin棄去沉澱,加入pH5.0醋酸鹽緩衝液稀釋得到lmg/mL的膨潤土剝離納米薄片膠體溶液。取IOOmL該膠體溶液，加入200mg糜蛋白酶，在25°C、200rpm下振蕩24h。結束後，將該反應液在15000rpm下離心IOmin,得到沉澱。用去離子水洗漆沉澱數次至中性,冷凍乾燥12h後得到固定化糜蛋白酶固體。合併上清液和洗滌液，利用Bradford法測定合併溶液中的蛋白量為35mg，得到蛋白酶在載體上的負載量為165mg，負載的糜蛋白酶與載體的質量比為1.65:1。以蛋白酶水解BAEE為模式反應，測定不同糜蛋白酶負載量下固定化糜蛋白酶的催化活性，發現固定化酶最高催化活性為游離酶的5倍。利用XRD測定發現，固定化糜蛋白酶固體沒有相應的衍射峰( 圖略)，說明膨潤土載體原有層間結構不復存在，推測固定化酶形成了「卡片屋」式的結構。
[0041]實施例5
[0042]稱取NaC13g溶於500mLpH4.0的醋酸鹽緩衝溶液中，加入鈉基膨潤土 5g製成濃度為1%的膨潤土懸液。室溫下，將該懸液置於超聲儀中超聲處理(頻率為40KHz)，同時開啟攪拌機在3000rpm下攪拌,每超聲Ih後停止20min。連續處理4h後，3000rpm下離心IOmin棄去沉澱，加入PH4.0醋酸鹽緩衝液稀釋得到0.5mg/mL的膨潤土剝離納米薄片膠體溶液。取IOOmL該膠體溶液，加入200mg牛血清白蛋白，在25°C、200rpm下振蕩24h。結束後，將該反應液在15000rpm下離心IOmin,得到沉澱。用去離子水洗漆沉澱數次至中性,冷凍乾燥12h後得到固定化牛血清白蛋白固體。合併上清液和洗滌液，利用Bradford法測定合併溶液中的蛋白量為25mg，得到蛋白酶在載體上的負載量為175mg，負載的牛血清白蛋白與載體的質量比為3.5:1。利用XRD測定發現，固定化牛血清白蛋白固體沒有出現相應的衍射峰(圖略)，說明膨潤土載體原有層間結構不復存在，推測固定化牛血清白蛋白形成了「卡片屋」式的結構。
[0043]本發明利用酶分子與膨潤土納米片層表面的陽離子(Na+、Ca2+)之間的離子交換，使酶分子分散的固定在原有的陽離子點位上，不僅有效避免了酶固定化過程中的聚集問題，而且大大提高了酶分子的負載量(可以實現每g載體3.5g酶蛋白的最高負載量)。該製備方法無需加入任何有機溶劑和有機化合物，與大部分酶固定化過程中要加入有機溶劑和有機化合物相比，本方法真正實現了酶催化劑的綠色製備。本發明製備得到的固定化酶的催化活性得到顯著提高(水相中的催化活性最高為游離酶的5倍)，克服了一般固定化酶在水相中的催化活性要低於游離酶的缺點，同時實現了生物酶的多批次穩定化操作。
[0044]總之，以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所作的均等變化與修飾，皆應屬本發明專利的涵蓋範圍。
【權利要求】
1.一種膨潤土單層剝離納米片組裝酶的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步驟(1):在PH4-6的緩衝液中加入電解質，然後加入膨潤土製成膨潤土懸浮液，室溫下，將膨潤土懸浮液置於超聲儀中超聲處理，同時攪拌l_5h，製得膨潤土單層納米薄片膠體溶液；步驟(2):取步驟(1)製得的膠體溶液，加入生物酶與膠體溶液進行混合，在25°C下振蕩10-24h，反應結束後進行離心得到沉澱，該沉澱用去離子水潤洗至中性，冷凍乾燥後得到產物固定化酶。
2.根據權利要求1所述的膨潤土單層剝離納米片組裝酶的製備方法，其特徵在於:所述的步驟(1)中的電解質選取NaCl、Na2CO3^ Na2SO4中任一種。
3.根據權利要求1所述的膨潤土單層剝離納米片組裝酶的製備方法，其特徵在於:所述的步驟(1)中的膨潤土採用鈉基膨潤土、鈣基膨潤土中任一種。
4.根據權利要求1所述的膨潤土單層剝離納米片組裝酶的製備方法，其特徵在於:所述的步驟(1)超聲處理頻率為20-60KHZ。
5.根據權利要求1所述的膨潤土單層剝離納米片組裝酶的製備方法，其特徵在於:所述的步驟(2)中生物酶的加入量為膨潤土質量的1-5倍。
6.根據權利要求1所述的膨潤土單層剝離納米片組裝酶的製備方法，其特徵在於:所述的步驟(2)中離心速率為10000-15000rpm。
7.根據權利要求1所述的膨潤土單層剝離納米片組裝酶的製備方法，其特徵在於:所述的膨潤土的濃度為0.1%-1.0%。
8.根據權利要求1所述`的膨潤土單層剝離納米片組裝酶的製備方法，其特徵在於:所述的電解質的濃度為0.1%-1.0%。
9.根據權利要求1或5所述的膨潤土單層剝離納米片組裝酶的製備方法，其特徵在於:所述的生物酶為蛋白酶或脂肪酶。
10.一種利用所述權利要求1-9任一方法製得的膨潤土單層剝離納米片組裝酶。
【文檔編號】C12N11/14GK103627694SQ201310606938
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月25日 優先權日:2013年11月25日
【發明者】董華平, 李益民, 李建法, 盛國棟, 吳夢琪, 徐丹紅 申請人:紹興文理學院