苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列的製作方法
2023-06-30 10:18:46
專利名稱：苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCR Vα19亞家族的Y基因序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及一個T細胞受體(TCR)的核苷酸序列，特別是指一種苯致再生障礙性貧血(AA)相關抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列。
背景技術：
苯是目前應用最為廣泛的化工原料和工業溶劑之一。我國職業接苯工人達50萬以上，佔各種化學物職業接觸人數之首。國際癌症研究署(IARC)和美國環境保護局(EPA)都將苯列為確證的人類致癌物。我國學者與美國國家癌症研究所(NCI)合作對中國74828名接苯工人和3580名對照工人進行的隊列研究證明，接苯工人發生血液淋巴系統惡性腫瘤，如再生障礙性貧血(AA)、骨髓增生異常症候群MDS)或白血病的相對危險性明顯增加。
再生障礙性貧血是血液系統的一種常見病，由多種因素引起骨髓造血功能衰竭，以全血細胞減少為主要臨床表現的症候群。其病因及發病機制至今雖未完全闡明，目前多數學者認為AA的病理機制高度異質，大致歸為以下三點1、造血幹細胞本身缺陷；2、造血微環境的損傷；3、機體異常免疫對造血的損傷。研究表明再生障礙性貧血患者發病的免疫機制中T淋巴細胞是主要效應細胞。分子免疫學證據表明AA患者存在T細胞克隆性或寡克隆性活化增殖。國內外對AA患者淋巴細胞異常克隆擴增的研究主要是集中在TCRβ亞家族的錄用情況，認為多克隆淋巴細胞被高度擴張的寡克隆淋巴細胞取代是再障發病起始階段主要致病原因之一。
上世紀90年代中期，第一個特異性CDR3單抗成功應用於治療I型糖尿病小鼠。目前，國外已將針對CDR3的特異性單抗的應用於自身免疫性疾病的治療中。但有關職業接苯人群中TCRα亞家族及其互補決定區3(CDR3)，即與抗原特異性識別結合的部位的研究資料較少。進一步了解苯致AA患者細胞免疫紊亂的始動因素為AA免疫方面的研究提供新思路，同時可將所獲得的T細胞克隆作為阻斷靶點，為AA免疫抑制治療提供依據。
發明內容
為了克服上述現有技術存在的不足，本發明的首要目的在於提供一種苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列。
本發明從苯致再生障礙性貧血患者外周血中存在T細胞受體(TCR)Vα亞家族的克隆性T細胞，經序列分析顯示其特異性TCR序列的高度可變區V-N-J區，即互補決定區3(CDR3)，與抗原特異性識別結合的部位，表明該克隆性T細胞所表達的TCR為苯致再生障礙性貧血相關抗原刺激所產生的特異性TCR，獲得了苯致再生障礙性貧血相關的TCR基因序列。
本發明公開了針對苯致再生障礙性貧血相關抗原的特異性TCR的基因序列，尤其是TCR的高度可變區即CDR3，後者是T細胞表面受體識別抗原的特異區域，針對於不同抗原，除了機體所選用的TCRVα亞家族T細胞不同，更為關鍵的是其TCR基因的CDR3序列的差異，該部位決定了所屬T細胞所能識別的抗原。本發明提供了一種識別苯致再生障礙性貧血相關抗原的TCRVα19基因序列，由於其CDR3的特異性，僅來自於單一克隆的T細胞，是一高度特異的序列。同時，根據CDR3的基因序列編碼的蛋白質，可用來了解職業接苯後的相關抗原肽，為了解苯致再生障礙性的生物學特性提供資料。
本發明的另一目的在於提供上述基因序列的應用，通過苯致再生障礙性貧血相關抗原特異的TCR基因製備對抗確定的特異性抗原的單抗，從而具備了發揮相應特異性去除苯致再生障礙性貧血中異常增殖的T細胞克隆。
根據所獲得的接苯後相關抗原的特異性TCR的核苷酸序列，可以用於(1)了解職業接苯人群所存在的TCRVα19亞家族T細胞的情況，用於評價病人的免疫功能狀態，早期發現可能的不良效應、篩檢易感人群等方面及時提供信息。(2)藉助所獲得的T細胞克隆，尋找接苯後引起AA的抗原，並採用TCR特異性單抗及TCR DNA疫苗選擇性地取出異常T細胞克隆從而靶向治療AA。
本發明的目的通過下述技術方案來實現一種苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列，所述基因序列如下所示 GTAAGTGCCGCCAAAAATGAAGTGGAGCAGAGTCCTCAGAACCTGACTGCCCAGGAAGGAGAATTTATCACAATCAACTGCAGTTACTCGGTAGGAATAAGTGCCTTACACTGGCTGCAACAGCATCCAGGAGGAGGCATTGTTTCCTTGTTTATGCTGAGCTCAGGGAAGAAGAAGCATGGAAGATTAATTGCCACAATAAACATACAGGAAAAGCACAGCTCCCTGCACATCACAGCCTCCCATCCCAGAGACTCTGCCGTCTACATCTGTGCTGTGAATTATGGAGGAAGCCAAGGAAATCTCATCTTTGGAAAAGGCACTAAACTCTCTGTTAAACCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATG。
其中，Y基因序列為507個bp1-276bp為V區；277-279bp為N區，280-343bp為J區；344-507bp為C區。
上述苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列翻譯的蛋白質如下 VSAAKNEVEQSPQNLTAQEGEFITINCSYSVGISALHWLQQHPGGGIVSLFMLSSGKKKHGRLIATINIQEKHSSLHITASHPRDSAVYICAVNYGGSQGNLIFGKGTKLSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSM。
上述苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列的製備方法，包括如下步驟 A、收集苯致再生障礙性貧血患者外周血，Ficoll分層法分離外周血單個核細胞； B、提取外周血單個核細胞的RNA，RT-PCR合成cDNA第一鏈； C、在NCBI的Genebank中查找TCRα鏈的基因序列，並標出各亞家族的V區及C區在基因組中的位置； D、設計29個Vα特異性上遊引物及Cα下遊引物； E、PCR擴增29個Vα亞家族TCR重排時產生的V-N-JC區； F、Cα-Fam標記PCR產物，基因掃描分析T細胞亞家族的表達和克隆性； G、將呈單克隆或寡克隆掃描圖的亞家族PCR產物進行切膠純化序列分析。
本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果 (1)本發明製備得到了一種獨特的苯致再生障礙性貧血抗原的相關TCRVα19基因序列，該序列可以作為一種新的抗原識別TCR基因(主要變化區在於CDR3序列)補充人類基因庫資料。
(2)該TCR基因可用於研究苯致再生障礙性貧血的特異性免疫診斷和治療。
上述苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα19亞家族的基因序列一方面可用於進一步檢測病人體內所存在的TCRVα19亞家族T細胞的情況，以評價其細胞免疫功能狀態，另一方面應用是製備選擇性地去除苯致再生障礙性貧血中異常增殖的T細胞克隆靶向免疫治療研究方面。
前者的檢測所採用技術與上述檢測TCR基因的技術相同，通過不同時間點的分析，可以了解病人所存在的TCRVβ13亞家族T細胞的情況，用於了解病人的免疫狀態。
後者主要通過苯致再生障礙性貧血相關抗原特異的TCR基因製備對抗確定的特異性抗原的單抗，從而具備了發揮相應特異性去除苯致再生障礙性貧血中異常增殖的T細胞克隆。本發明所提供的TCR基因的應用最終目的是通過對苯致再生障礙性貧血患者進行特異性免疫治療，從而提高療效，改善病人的生存質量等，是具有很大的市場推廣應用價值和和較大的社會經濟效益。
圖1為苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα19亞家族的基因掃描圖。
其中，A為TCRVα19亞家族多克隆圖；B為TCRVα19亞家族寡克隆圖。
具體實施例方式 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
實施例 (一)抗原特異性TCR基因序列的分析 分析TCRVα基因譜的CDR3的長度和鹼基序列的方法很多，常用的方法是利用RT-PCR-基因掃描方法分析TCRVα29個亞家族的CDR3長度。首先收集苯致再生障礙性貧血患者外周血，Ficoll分層法分離外周血單個核細胞，留取1*107個PBMCs(外周血單個核細胞)提取RNA，RT-PCR合成cDNA。同時，在NCBI的基因庫中查找出TCRα鏈的基因序列，並標出各亞家族的V區及C區在基因組中的位置。根據Vα29個亞家族基因的cDNA設計相應的29個Vα特異性上遊引物，並在Cα區設一Cα下遊引物，利用PCR技術擴增患者29個Vα亞家族TCR重排時產生的V-N-JC區。如圖1所示，螢光素Fam標記各亞家族PCR產物的Cα區，基因掃描分析T細胞各亞家族的表達，根據不同位置，高度和形態的峰，表示產物的大小、量和均一性，從而確定T細胞克隆性(一般情況下，正常轉錄的每個Vα亞家族包含8～10個峰，即8～10個不同克隆的T細胞；主峰的出現表明相同大小cDNA的過度擴增，單峰表明產物中DNA片斷大小相同，均存在寡克隆或單克隆T細胞群，三者分別提示產物來自多克隆、寡克隆和單克隆的T細胞)。基因掃描結果發現患者的Vα19亞家族T細胞呈明顯單克隆；將Vα19亞家族的PCR產物切膠純化，序列分析發現了Vα19亞家族TCR的基因序列及其CDR3區(V-N-J區)，即為與苯致再生障礙性貧血相關抗原特異性結合的部位。
苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列的製備方法 1、分離外周血單個核細胞 (1)取淋巴細胞分離液(Ficoll，密度1.077)4mL加入離心管內，將稀釋後的抗凝外周血標本混懸液平鋪於分離液之上，以水平離心機，2000rpm，離心15分鐘。
(2)吸取中間單個核細胞層轉移至另一離心管內，再加入5mL 1640液，輕輕吹打，以1500rpm，離心洗滌10分鐘，棄上清，加入1640液至2mL，混勻後計數，並用同樣的方法洗滌兩次，按2×107/mL調整細胞濃度備用。2、RNA提取(TRIzol試劑盒方法提取法) (1)將已加入TRIzol試劑-20℃凍存的細胞取出，置冰上解凍，混勻後加入0.2mL氯仿，充分混勻，4℃，14000rpm離心30分鐘。
(2)吸取上層液至另一離心管，加入0.5mL異丙醇並混勻，室溫靜置10分鐘後4℃，14000rpm離心30分鐘。
(3)去上清，並用1mL75％乙醇(-20℃)洗兩次(2～8℃，14000rpm)，每次混勻30秒後，離心10分鐘。
(4)去上清，再離心2～3分鐘，去除剩餘的乙醇，置於超淨臺上自然乾燥1～1.5小時。加入超淨水(20～50μL)溶解。
(5)於紫外線分光光度儀中檢測樣品的純度和含量，0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性和質量。
(6)RNA保存RNA樣品加入其0.1倍容積的3mol/LNaAC(醋酸鈉)和2倍容積的乙醇後，保存於-80℃備用。
3、cDNA合成 (1)應用六聚體隨機引物和反轉錄酶試劑盒合成cDNA第一鏈。1μgRNA加入16.5μL預先配製的混合液其中包括7μL H2O、2μL 10×PCR-Buffer、2μL0.1mmol/L DTT、5μL 2.5mmol/L dNTP和0.5μL Rand.Hexmer。
(2)於73℃3分鐘後，置於冰中30秒。低溫高速離心30秒置於冰中2～3分鐘。
(3)加入0.6μL Rnasin(33U/μL)和0.5μL Superscript(200U/μL)後，低溫高速離心30秒。
(4)室溫靜置10分鐘；42℃，40分鐘以上；83℃，5分鐘，-20℃保存備用。
4、cDNA合成質量檢測 將所有樣本的cDNA經PCR檢測β2M基因(引物序列見表1)而確定其合成質量。總反應體系20μL，其中上下遊引物0.5μmol/L，dNTP 0.1mmol/L，Taq聚合酶1.0U，MgCL2 1.5mmol/L，10×PCR緩衝液2μL，cDNA產物1μL和dH2O，同時設置陽性和陰性對照。在德國Biometra PCR擴增儀中進行PCR反應。
反應條件94℃1分鐘(首次3分鐘)，58℃1分鐘，72℃1分鐘(末次6分鐘)，共35個循環，最後保存於4℃中。取8μL PCR產物以1.5％(w/v)瓊脂糖凝膠進行電泳，β2M陽性者可進一步研究，陰性者視為無cDNA合成，棄去不用。
5、PCR擴增TCRVα29個亞家族 以29個TCRVα亞家族基因設計相應的特異性上遊引物，並在Cα區設計一下遊引物(引物序列見表1)。PCR按常規方法進行。總反應體系20μL，其中含任一Vα引物(29個Vα亞家族之一)和Cα引物0.5μmol/L，餘同上。
反應條件94℃、1分鐘(首次3分鐘)，60℃、1分鐘和72℃、1分鐘(末次6分鐘)，共進行40個循環，最後PCR產物保存於4℃中。取8μLPCR產物電泳分析結果。
6、T細胞克隆性分析 (1)標記PCR產物 10μL的反應體系含2.5μL未標記的PCR產物、0.15μmol/L Cβ-fam引物、1.5mmol/L MgCl2，0.1mmol/L dNTP，0.75U Taq聚合酶，1μL 10×PCR緩衝液和dH2O。PCR共進行35循環，每一循環包括94℃、1分鐘(首次3分鐘)，66℃、1分鐘和72℃、1分鐘(末次6分鐘)，最後PCR產物保存於4℃中。
(2)基因掃描樣品配製 螢光素標記的PCR產物(2μL)加入高質量的去離子甲醯胺(Hi-DiFormamide)與Genescan-500 LIZ分子量標準品按20∶1比例配好的10μL混合液中。
(3)基因掃描(按操作指南進行) 1)按操作指南準備好儀器並更換水和緩衝液。
2)灌膠灌膠前2小時從4℃冰箱取出POP-4(Performance OptimizedPolymer-4)膠回溫1～2小時，把膠液抽進貯膠5mL針筒中(抽取的mL數約為0.5+0.07x做樣次數)，倒置排出針筒內氣泡，裝緊針筒。
3)上樣將備好的樣品於94℃變性4分鐘，然後立即放置冰上冷卻2分鐘。變性後的樣品加入96孔板，直接裝載到3100遺傳分析儀進行電泳。
4)運行自動進樣器會自動把樣品板移到要分析的4個樣品的位置，電泳過程中CCD檢測器把螢光信號轉換為電信號並把它傳送給安裝了3100數據採集軟體的計算機工作站。
5)數據處理數據處理完成後就存貯在計算機的資料庫裡並以電泳信號圖的形式顯示出來。電泳信號圖的X軸表示時間，Y軸表示相對螢光強度，每個圖中同時畫出幾種用於標記DNA片斷的螢光素信號，電泳信號圖中的每個峰代表一個DNA片斷。完成處理的數據被自動地從資料庫中提取並進行分析。
6)結果分析打開GeneMapper SoftwareTM v3.5，將保存於計算機硬碟資料庫中的原始數據加進分析軟體，分析產物的長度和螢光素強度。
7、核苷酸序列分析 (1)E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化PCR產物 1)切膠將PCR產物全部加入1～2％的瓊脂糖凝膠的加樣孔，當電泳至足以分離目的DNA時，於紫外燈下用乾淨的手術刀切下含有目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，切下的凝膠塊置於1.5mL離心管中。
2)按E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒說明進行PCR產物的純化，先加入500μLBinding Buffer，55～65℃孵育至凝膠塊完全溶解；凝膠溶解液加入HiBind DNAspin-column中高速離心去廢液後，再依次加入300μL Binding Buffer、700μLSPW Buffer洗膜；高速離心甩幹spin-column的濾膜後，加入30μL DNA ElutionBuffer(加於濾膜上)，室溫靜置5min，高速離心1min後可得純化的PCR產物。
3)取3μL純化後的PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，觀察純化效果；剩餘的PCR純化產物真空冷凍乾燥濃縮約20min至10μL左右。
(2)BigDye標記 用BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing kit標記純化後的PCR產物，反應體系為BigDyeTerminator 1μL、相應單向引物(2μmol/L)1.6μL、純化後PCR產物2.4μL，反應條件96℃1min，(96℃ 10sec、50℃ 5sec、60℃4min)25個循環。
(3)測序 將標記好BigDye的5μL體系的測序產物補水至20μL，轉入1.5ml的離心管，再依次加入2μL 3M NaAc(pH5.2)、2μL 125mM EDTA-Na2、50μL 95％乙醇，旋渦振蕩後室溫下避光放置15min；5415型高速臺式離心機2800g離心20min，沿離心沉澱物的對側小心吸取上清並棄去，加入250μL70％冰凍乙醇，2800g離心5min，棄上清；將管蓋打開置於加熱板上，94～95℃1min使其乾燥。加入10μL高質量的去離子甲醯胺，反覆吹打混勻，轉入0.2μL的PCR管內，在PCR儀上95℃變性4min，然後迅速置冰中冷卻至少4min後，裝載到3100 DNA序列分析儀上進行毛細管電泳。
表1 RT-PCR實驗所涉及的引物序列 (二)抗原特異TCR基因轉導技術 1、重組質粒TCRVα19(Y)-pIRES的構建* (1)目的基因的擴增 根據苯致再生障礙性貧血相關TCRVα19亞家族基因序列(包括完整的CDR3區)設計引物，擴增病人樣本中的TCRVα19基因序列的上遊引物上帶有XhoI酶切位點、下遊引物上帶有EcoRI酶切位點(與真核表達載體pIRES中的插入位點A的酶切位點相對應)。按BD AdvantageTM 2PCR試劑盒說明書進行PCR反應PCR總反應體系50μL，其中含10×BD Advantage 2PCRBuffer、上下遊引物各0.5μmol/L、dNTP Mix 0.2mmol/L、50×BD Advantage2Polymerase Mix、超純水和1μL cDNA模板，同時設置陽性和陰性對照。反應條件94℃1min(首次為3min)、60℃1min、72℃2min(末次為7min)，共35個循環。擴增產物用1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定。
(2)重組質粒的構建 A、E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化目的基因TCRVα19的PCR產物(同第一部分，步驟7)； B、將真核表達載體pIRES與純化後的TCRVα19PCR產物分別用XhoI酶切，體系為①TCRVα19 PCR產物28μL、TangoTMbuffer 8μL、XhoI內切酶1μL、超純水3μL；②pIRES載體4μL、TangoTMbuffer 8μL、XhoI內切酶1μL、超純水27μL；混勻後置於37℃水浴3h； C、純化XhoI酶切後的pIRES載體和TCRVα19PCR產物； D、將已純化好的XhoI酶切後的pIRES載體和TCRVα19PCR產物分別再用EcoRI酶切，體系為①TCRVα19PCR產物(XhoI)28μL、TangoTMbuffer8μL、EcoRI內切酶1μL、超純水3μL；②pIRES載體(XhoI)28μL、TangoTMbuffer 8μL、EcoRI內切酶1μL、超純水3μL；混勻後置於37℃水浴3h； E、雙酶切後的pIRES載體和TCRVα19PCR產物進行連接反應體系為10×T4 buffer1μL、T4 DNA酶1μL、雙酶切後的pIRES載體2μL、雙酶切後的TCRVβ13 PCR產物6μL，混勻後置於16℃過夜； F、轉化①將連接產物(10μL)加入感受態大腸桿菌DH5α(1.5mL離心管，100μL菌液，-70℃保存，北京Tiangen公司)中，輕輕混勻，置冰中30min；②42℃熱休克90s，迅速置冰中3min；③加入SOC培養基800μL，置乾燥恆溫振蕩箱中37℃180～200rpm振搖60min；④菌液用玻璃推鋪於1.5％LB固體培養基(含氨苄青黴素100μg/mL)上，置37℃孵箱過夜培養； G、隨機挑選10個菌落，分別接種於5mL含氨苄青黴素的LB培養液中，37℃180rpm振搖培養過夜，PureLinkTM超純質粒提取試劑盒抽提質粒(5415型臺式高速離心機)①3000rpm室溫下離心菌液15min，去上清；②加入250μL含RNase A的Resuspension Buffer，重懸細菌；③加入250μL Lysis Buffer，輕輕混勻，室溫下放置5min；④加入350μL Precipitation Buffer，立即振蕩混勻；⑤以11400rpm離心10min後，將上清液轉移至Mini column中，11400rpm離心1min，去廢液；⑥加入700μL Wash Buffer，11400rpm離心1min，去廢液；⑦再以11400rpm離心1min後，將Mini column放入一新的1.5mL離心管中，加入75μL預熱65℃的TE Buffer，室溫下放置3min，11400rpm離心2min，所收集的溶液即為富含質粒溶液； H、提取質粒DNA後用XhoI和EcoRI雙酶切鑑定，同時在pIRES載體的IRES區設計一下遊引物IRES-R(5』-TATAGACAAACGCACACCGG-3』)，結合pIRES載體上遊的T7公共引物(5』-TACGACTCACTATAGGCTAG-3』)進行PCR鑑定，PCR反應體積為25μL，包括0.1mmol/L dNTP、1.5UTaq聚合酶、10×PCR緩衝液、1.5mmol/L MgCl2和超純水，引物濃度均為0.4μmol/L，以1∶500稀釋的質粒DNA1μL作為模板。PCR擴增條件為94℃3min，(94℃30s，60℃1min，72℃2min，35個循環)，72℃5min；酶切產物及PCR擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定。篩選出陽性克隆，再對其進行雙向測序鑑定，證實為本研究特異基因序列後擴增陽性克隆並提取質粒，從而獲得特異性苯致再生障礙性貧血相關的TCRVα19-pIRES質粒。用紫外分光光度計測定重組質粒的濃度。
2、脂質體介導的重組質粒TCRVα19-pIRES轉染 (1)脂質體LipofectamineTM2000轉染A549細胞株、Molt4細胞株 轉染A549細胞株①將處於對數生長期的A549細胞株以4×105個細胞/孔的密度，加入2mL無血清無抗生素的IMDM培養基，接種6孔培養板；②取TCRVα19-pIRES重組質粒(4μg)置於1.5mL離心管中，加入無血清無抗生素的IMDM培養基至250μL，輕輕混勻；③取15μL脂質體LipofectamineTM2000置於1.5mL離心管中，加入無血清無抗生素的IMDM培養基至250μL，輕輕混勻後室溫下孵育5min；④將②和③混勻後，室溫下孵育20min；⑤將④加入①的A549細胞培養基中(轉染平行2孔)，另設1孔轉染pIRES空載體作為陰性對照，具體操作方法同轉染重組質粒；置於37℃、5％CO2培養箱中培養24h後全量換液為完全培養基，培養72h後加G418進行篩選(終濃度600μg/mL)，每4天換一次培養基，同時加入相同濃度的G418，在此篩選條件下培養20d可得到穩定表達細胞系。
轉染Molt4細胞株將處於對數生長期的Molt4細胞株以2×106個細胞/孔的密度接種6孔板，取4μg TCRVα19-pIRES重組質粒和脂質體LipofectamineTM2000混合後轉染Molt4細胞株，方法同轉染A549細胞株。
3、重組質粒轉染後TCRVα19基因表達的鑑定 (1)RT-PCR和實時定量PCR檢測TCRVα19mRNA的表達 轉染7天後，各孔收集3×106細胞，用TRIZol試劑盒和SurperScript II逆轉錄試劑盒分別提取總RNA、合成cDNA，經PCR擴增管家基因β2M檢測cDNA的合成質量(同第一部分，步驟7)；用相應的TCRVα19引物以及相應的Cβ引物進行PCR擴增，轉染空載體組作為陰性對照，PCR擴增體系和擴增條件同前所述。
(2)間接免疫螢光法和流式細胞儀檢測重組質粒的表達 轉染10天後，收集1×106細胞，用0.1mol/L的PBS洗滌細胞兩次後，標記大鼠抗人TCRVα單抗(一抗，1∶100稀釋)，37℃孵育1h；PBS洗滌細胞三次後，標記FITC-兔抗大鼠IgG抗體(二抗，1∶50稀釋)，37℃孵育1h；PBS洗滌細胞三次後，在螢光顯微鏡下觀察重組質粒在轉染後細胞株中的表達情況；或直接用FITC-大鼠抗人TCRVα19單抗標記，37℃孵育30min，PBS洗滌細胞一次後用流式細胞儀進行流式檢測重組質粒的表達。
(3)點印記雜交和Western Blot檢測TCRVα19蛋白的表達 轉染20天後，收集2×106穩定表達重組質粒的細胞，用RIPA蛋白提取試劑盒提取總蛋白，真空冷凍乾燥濃縮後考馬斯亮蘭法定量；同樣提取臍血細胞(TCRVα19亞家族表達均陽性)的蛋白作為陽性對照，轉染空載體的細胞的蛋白為陰性對照。
1)點印記雜交 A、取NC膜2cm×4cm，劃分小格，用微量加樣槍分別點膜，重組質粒組、陽性對照組、陰性對照組的蛋白樣品分別點3次，每次1μL；進行2個平行反應； B、用blocking Reagent封膜4h後用wash buffer洗滌2次，每次5min； C、加入1∶500的大鼠抗人TCRVα19單抗(用blocking Reagent稀釋)，4℃孵育過夜後用wash buffer洗滌2次，每次5min； D、加入1∶500的HRP-兔抗大鼠IgG抗體(用blocking Reagent稀釋)室溫孵育2h，用wash buffer洗滌3次，每次5min； E、將NC膜浸入DAB底物液(避光)顯色。
2)Western Blot A、SDS-PAGE電泳將轉染重組質粒組的濃縮蛋白樣品、陽性對照和陰性對照分別加樣於15％SDS-PAGE膠(每孔上樣約100μg)，以PageRulerPrestained Protein Ladder為預染marker，進行3個平行反應；用恆壓60V電泳30min後，改恆壓100V1h； B、分離其中1個平行反應的SDS-PAGE膠，用考馬斯亮蘭染色後，用冰乙酸甲醇洗脫液反覆漂洗直至有清晰條帶顯出； C、轉膜PVDF膜預先用甲醇浸泡1min，再浸泡到轉膜液中備用；切好的濾紙和海綿也浸泡到轉膜液中10min；將切下的另2個平行反應的SDS-PAGE膠與相應的PVDF膜放入轉膜液中浸泡片刻；將海綿-濾紙-PVDF膜-SDS-PAGE膠-濾紙-海綿依次放到陽極板上，膠大小＝膜＞濾紙；用4℃預冷的轉膜液，恆壓40V，90min(溼轉)； D、封膜用blocking Reagent封膜4h後用wash buffer洗滌2次，每次5min； E、檢測人β-actin蛋白(內參照)的表達將其中1個平行反應的PVDF膜加入1∶800的小鼠抗人β-actin單抗(用blocking Reagent稀釋)，4℃孵育過夜後用wash buffer洗滌2次，每次5min；加入1∶1000的HRP-羊抗小鼠IgG抗體(用blocking Reagent稀釋)室溫孵育2h，用wash buffer洗滌3次，每次5min； F、檢測目的蛋白TCRVα19的表達將另1個平行反應的PVDF膜加入1∶800的大鼠抗人TCRVα單抗(用blocking Reagent稀釋)，4℃孵育過夜後用washbuffer洗滌2次，每次5min；加入1∶1000的HRP-兔抗大鼠IgG抗體(用blockingReagent稀釋)室溫孵育2h，用wash buffer洗滌3次，每次5min； G、化學發光法顯影在暗室中將PVDF膜轉入LumiGLO Working Reagent中，室溫孵育3min；用鑷子將PVDF膜取出，瀝去多餘的試劑；將PVDF膜放入塑料薄膜中，要保證PVDF膜與塑料薄膜之間沒有氣泡；將含有PVDF膜的塑料薄膜放入X線曝光暗盒中，壓上X線膠片(曝光30s)，常規顯影、定影后得到顯影的X線膠片。
4、重組質粒TCRVα19-pIRES轉染正常人T細胞，免疫小鼠製備單克隆抗體 (1)重組質粒TCRVα19-pIRES轉染正常人T細胞 將處於對數生長期的正常人T細胞以2×106個細胞/孔的密度接種6孔板，取4μgTCRVα19-pIRES重組質粒和脂質體LipofectamineTM2000混合後轉染正常人T細胞，操作方法同前所述，培養擴增後得到表達抗原特異性相關TCRVα19基因的T細胞，並檢測驗證重組質粒的表達(方法同前)。
(2)免疫小鼠製備特異性單抗 體外大量培養特異性表達TCRVα19的T細胞，收集特異性表達TCRVα19T細胞後腹腔注射小鼠，根據單克隆抗體製備相關技術製備針對苯致再生障礙性貧血的單抗。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
SEQUENCE LISTING
暨南大學
苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列
40
2
PatentIn version 3.2
1
507
DNA
Artificial sequence
苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列
1
gtaagtgccg ccaaaaatga agtggagcag agtcctcaga acctgactgc ccaggaagga60
gaatttatca caatcaactg cagttactcg gtaggaataa gtgccttaca ctggctgcaa120
cagcatccag gaggaggcat tgtttccttg tttatgctga gctcagggaa gaagaagcat180
ggaagattaa ttgccacaat aaacatacag gaaaagcaca gctccctgca catcacagcc240
tcccatccca gagactctgc cgtctacatc tgtgctgtga attatggagg aagccaagga300
aatctcatct ttggaaaagg cactaaactc tctgttaaac caaatatcca gaaccctgac360
cctgccgtgt accagctgag agactctaaa tccagtgaca agtctgtctg cctattcacc420
gattttgatt ctcaaacaaa tgtgtcacaa agtaaggatt ctgatgtgta tatcacagac480
aaaactgtgc tagacatgag gtctatg507
2
169
PRT
Artificial sequence
苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα
19亞家族的Y基因序列翻譯的蛋白質
2
Val Ser Ala Ala Lys Asn Glu Val Glu Gln Ser Pro Gln Asn Leu Thr
1 5 10 15
Ala Gln Glu Gly Glu Phe Ile Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Ser Val Gly
20 25 30
Ile Ser Ala Leu His Trp Leu Gln Gln His Pro Gly Gly Gly Ile Val
35 40 45
Ser Leu Phe Met Leu Ser Ser Gly Lys Lys Lys His Gly Arg Leu Ile
50 55 60
Ala Thr Ile Asn Ile Gln Glu Lys His Ser Ser Leu His Ile Thr Ala
65 70 75 80
Ser His Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Ile Cys Ala Val Asn Tyr Gly
85 90 95
Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val
100 105 110
Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp
115 120 125
Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser
130 135 140
Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp
145 150 155 160
Lys ThT Val Leu Asp Met Arg Ser Met
16權利要求
1、一種苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列，其特徵在於所述基因序列如下
GTAAGTGCCGCCAAAAATGAAGTGGAGCAGAGTCCTCAGAACCTGACTGCCCAGGAAGGAGAATTTATCACAATCAACTGCAGTTACTCGGTAGGAATAAGTGCCTTACACTGGCTGCAACAGCATCCAGGAGGAGGCATTGTTTCCTTGTTTATGCTGAGCTCAGGGAAGAAGAAGCATGGAAGATTAATTGCCACAATAAACATACAGGAAAAGCACAGCTCCCTGCACATCACAGCCTCCCATCCCAGAGACTCTGCCGTCTACATCTGTGCTGTGAATTATGGAGGAAGCCAAGGAAATCTCATCTTTGGAAAAGGCACTAAACTCTCTGTTAAACCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATG。
2、根據權利要求1所述的一種苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列，其特徵在於所述苯致再生障礙性貧血相關抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列翻譯的蛋白質如下
VSAAKNEVEQSPQNLTAQEGEFITINCSYSVGISALHWLQQHPGGGIVSLFMLSSGKKKHGRLIATINIQEKHSSLHITASHPRDSAVYICAVNYGGSQGNLIFGKGTKLSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSM。
全文摘要
本發明公開了針對苯致再生障礙性貧血相關抗原的特異性T細胞受體的核苷酸序列。通過RT-PCR基因掃描分析發現苯致再生障礙性貧血患者外周血中TCR Vα19亞家族呈明顯單克隆，其PCR產物進行序列分析，發現了特異性TCR序列的V-N-J區，即互補決定區3，是和抗原特異性識別結合的部位，表明該克隆性T細胞的TCR為苯致再生障礙性貧血相關抗原刺激所產生的特異性TCR。它是進行苯致再生障礙性貧血免疫靶向治療的基礎和關鍵。該特異性TCR的核苷酸序列為進一步開展針對苯致再生障礙性貧血的特異性細胞免疫治療提供條件。
文檔編號C12N15/10GK101250526SQ20071003281
公開日2008年8月27日 申請日期2007年12月26日 優先權日2007年12月26日
發明者李揚秋, 萡 李, 陳少華, 楊力建 申請人:暨南大學