利用蛤蚌毒素－生物素偶聯物檢測和鑑別親蛤蚌毒素蛋白的製作方法

2023-06-30 05:05:01 1

專利名稱：利用蛤蚌毒素－生物素偶聯物檢測和鑑別親蛤蚌毒素蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種麻痺性貝毒素偶聯物。尤其是，本發明涉及麻痺性貝毒素偶聯物在檢測、表徵、分離和/或純化所感興趣的分子，特別是親蛤蚌毒素蛋白及其配體方面的應用，雖然其應用並不限於此。
背景技術：
所謂的「親蛤蚌毒素蛋白(saxiphilins)」是不同種類的多肽，其是通過它們與蛤蚌毒素結合的能力來加以表徵的，其中蛤蚌毒素是麻痺性貝毒素(或PSTs)之一。術語「親蛤蚌毒素蛋白」是一個創造的術語，包括來自蛤蚌毒素的前綴「蛤蚌(saXi)」和後綴「philic」，其表示比作(或親)蛤蚌毒素。親蛤蚌毒素蛋白並不共享任何特定的化學結構或生理功能，親蛤蚌毒素蛋白的生理作用似乎也不一定是結合蛤蚌毒素。例如，所謂的「牛蛙親蛤蚌毒素蛋白」是一種分子，其與鐵結合蛋白的運鐵蛋白類共享50％以上的胺基酸序列同一性，因此也被認為是運鐵蛋白。鈉通道也結合蛤蚌毒素，因而可以被稱作「親蛤蚌毒素蛋白」。所謂的親蛤蚌毒素蛋白已經被分離自不同的來源，如河豚的血液。這種蛋白，和鈉通道一樣，結合蛤蚌毒素和河豚毒素，但與鈉通道不同的是，河豚蛋白是親水的。
鈉通道、河豚親蛤蚌毒素蛋白、以及運鐵蛋白各自是不同類型的親蛤蚌毒素蛋白的成員。在三種類型的親蛤蚌毒素蛋白之間沒有可辨別的胺基酸序列同源性。然而，基於它們的物理性能可以對它們進行描述。鈉通道是疏水的，因為它被固定在脂質膜中，而其他的類型是親水的。運鐵蛋白類的親蛤蚌毒素蛋白結合蛤蚌毒素但不結合河豚毒素，而鈉通道和河豚親蛤蚌毒素蛋白結合蛤蚌毒素和河豚毒素。可以用來區別這些分子的另外的性能是結合新蛤蚌毒素(neoSTX)的能力。此外，存在許多相關的毒素，稱作麻痺性貝毒素，結構上類似於蛤蚌毒素，這類分子在不同的程度上結合於蛤蚌毒素。
由攝取含有衍生自腰鞭毛蟲的毒素的魚、甲殼(貝)類動物或軟體動物而引起的麻痺性貝中毒是導致嚴重的人類病症的世界性的問題，其經常導致死亡。該中毒是由麻痺性貝毒素(PSTs)所引起的。此外，毒性淡水藻類的菌絨可以用相同的引起麻痺性貝中毒的神經毒素汙染水源。這種毒素汙染的水對於人類、家畜以及野生生物會具有可怕的後果。
PSTs具有以下結構，如由通式(I)所示的

此毒素家族可以分成四個主要種類蛤蚌毒素，其是高度有效力的神經毒素並且其不被硫酸化；膝溝藻毒素(gonyautoxins)(GTXs)，其被單獨硫酸化；N-磺基氨基甲醯基-13-硫酸化物C-毒素，其比STXs或GTXs具有較小的毒性；以及GC毒素，其在C13上具有酚基。
PSTs的毒性是它們結合於電位依賴性鈉通道的結果，其阻斷鈉離子的流入，因而阻斷了神經肌肉的傳遞。這引起了呼吸麻痺，對於此沒有可行的治療方法。在某些麻痺性貝中毒爆發的情況下，高達40％的受害者已經死亡。作為PSTs來源的腰鞭毛蟲周期性地形成藻類菌絨，稱作赤潮。軟體動物、魚、以及甲殼類動物，包括具有商業重要性的物種或利用水產養殖技術飼養的物種，會以這些腰鞭毛蟲為食，並積聚毒素。通過粗略的檢查不可能檢測到單個海生動物是否含有毒素，因此存在人類偶然食用含毒素動物的風險。因此對於要食用的物種必須監測PSTs的存在，以便避免中毒的危險，從而避免社會損失和經濟損失。
一種改進的用於蛤蚌毒素的測定方法披露於同系列的未決國際申請第WO 02/48671號中。該國際申請披露了一種檢測和/或測量存在於樣品中的麻痺性貝毒素的量的方法，其是通過將麻痺性貝毒素結合於經分離和純化的親蛤蚌毒素蛋白分子如分離自蜈蚣Ethmostigmus rubripes(巨型蜈蚣)的親蛤蚌毒素蛋白的方式來進行的。因此可以希望獲得來自其他來源的親蛤蚌毒素蛋白，其對於蜈蚣親蛤蚌毒素蛋白表現出相當或更好的結合性能。然而，已經證明親蛤蚌毒素蛋白是一組難以分離和純化的化合物，並且到現在為止僅有牛蛙親蛤蚌毒素蛋白得到了很好的表徵。因此，也需要能夠標記PSTs或將它們固定在固體載體上，用於對親蛤蚌毒素蛋白或其配體進行檢測和表徵。

發明內容
本發明人已經開發了一種技術，藉此PST如蛤蚌毒素被生物素化，以便可以採用抗生物素蛋白/鏈黴抗生物素蛋白系統，從而能夠檢測、表徵、分離和/或純化所感興趣的分子，如親蛤蚌毒素蛋白以及其配體。在分子中PST和生物素功能性的結合使得許多應用成為可能，其中涉及(鏈黴)抗生物素蛋白/生物素的結合，其可以和PST/親蛤蚌毒素蛋白結合活性一起用於測定法的設計。
因此，本發明的一個方面提供了一種用於俘獲親蛤蚌毒素蛋白的方法，以便於檢測、表徵、分離和/或純化所述親蛤蚌毒素蛋白或其配體，該方法包括(1)提供一種PST偶聯物，該PST偶聯物包括一PST部分，該PST部分經過一連接子，並通過一親蛤蚌毒素蛋白的非結合部位的部位結合於一生物素部分；
(2)將該PST偶聯物暴露於假定含有所述親蛤蚌毒素蛋白的樣品，以便產生反應混合物，並且暴露於(鏈黴)抗生物素蛋白；以及(3)允許通過該PST部分結合到親蛤蚌毒素蛋白上，並且通過該生物素部分結合到(鏈黴)抗生物素蛋白，以便形成俘獲的PST複合物。
本發明的另一個方面提供了一種用於檢測、表徵、分離和/或純化親蛤蚌毒素蛋白的方法，包括(1)提供一種PST偶聯物，該PST偶聯物包括一PST部分，其經過一連接子，並通過一親蛤蚌毒素蛋白的非結合部位的部位結合於一生物素部分；(2)將該PST偶聯物暴露於假定含有親蛤蚌毒素蛋白的樣品，以便產生反應混合物，並且暴露於(鏈黴)抗生物素蛋白；(3)允許通過該PST部分結合到該親蛤蚌毒素蛋白，並且通過該生物素部分結合到(鏈黴)抗生物素蛋白上，以便形成一種俘獲的PST複合物；以及(4)通過該俘獲的PST複合物對親蛤蚌毒素蛋白進行檢測、表徵、分離和/或純化。
有利的是，該生物素部分結合於一種固定的(鏈黴)抗生物素蛋白分子，用作一種親和純化介質。在該具體實施方式
中，通過結合暴露之前的(鏈黴)抗生物素蛋白，並通過該固定的PST偶聯物暴露於該樣品所產生的反應混合物中，該PST偶聯物可以固定在樣品上。可選替換的是，該PST偶聯物可以暴露於樣品中，用以同時在溶液中形成反應混合物，並且將該反應混合物暴露於被固定的鏈黴抗生物素蛋白，例如在親和柱或親和珠粒上，以便俘獲已經在溶液中形成的PST複合物。
可以使用任何合適的親和基質。合適的親和凝膠應該具有較高的孔隙度，以便允許最多的大分子接近被固定的配體，它應該具有均勻的尺寸和剛度，用以為良好的流動特性、以及機械和化學穩定性創造條件。典型的不溶性載體材料包括纖維素、聚苯乙烯凝膠、交聯葡聚糖、聚丙烯醯胺凝膠、多孔矽石和瓊脂糖及其衍生物如瓊脂糖凝膠。可以利用如本領域技術人員所了解的標準技術進行柱製備。結合了親蛤蚌毒素蛋白的洗脫可以通過改變條件，如緩衝液的pH、離子強度、或溫度來完成，使得基質對於結合了親蛤蚌毒素蛋白的親和力被降低和/或如本領域技術人員所熟知的通過將競爭性配體加入到洗脫緩衝液中。也可以以類似的方式使用任何適宜的珠粒載體，其包括磁珠或樹枝狀大分子(dendrimer)載體。有利的是，將生物素部分結合於固定的(鏈黴)抗生物素蛋白分子，供在PST生物傳感裝置中用作俘獲探針。在該具體實施方式
中，通過將暴露之前的(鏈黴)抗生物素蛋白結合，並通過將固定的PST偶聯物暴露於含有已知量的親蛤蚌毒素蛋白和PST的樣品所產生的反應混合物，可以將該PST偶聯物固定在固相上。可選替換的是，可以將該PST偶聯物暴露於樣品中，用以同時在溶液中形成反應混合物，並且將該反應混合物暴露於固定的鏈黴抗生物素蛋白，例如在膜、微杆、電極或化學活化的玻璃表面上，以便俘獲已經在溶液中形成的PST複合物。然後將吸附在固相上的PST-親蛤蚌毒素蛋白複合物的量通過結合的(鏈黴)抗生物素蛋白可以與樣品中的PST的量相關。典型的裝置(platform)包括電化學、光學、表面等離子體共振、聲波、微懸臂、以及離子通道轉換生物傳感器。
在一
具體實施例方式
中，本發明的PST偶聯物可以用作探針來檢測在組織、細胞中、或在其它地方的親蛤蚌毒素蛋白及其配體的存在。結合於親蛤蚌毒素蛋白是通過PST部分發生的，而檢測是通過生物素部分以傳統方式進行的。例如，可以使用(鏈黴)抗生物素蛋白的螢光、放射性或化學發光偶聯物。其他可以應用於(鏈黴)抗生物素蛋白的可檢測標記物包括(鏈黴)抗生物素蛋白的CMNB-籠形螢光素偶聯物，其可以用作光中介標記物或螢光共振能量傳遞試劑、螢光微球體標記物、膠態金、膠乳珠、脂質體、樹枝狀大分子、寡核苷酸、肽核酸以及類似物。此外，酶聯方法可以用於檢測，因而採用的(鏈黴)抗生物素蛋白可以是酶偶聯物如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶以及β-半乳糖苷酶的(鏈黴)抗生物素蛋白偶聯物。所有的抗(鏈黴)抗生物素蛋白抗體(標記的或未標記的)也可以用於檢測。
可選替換地，親蛤蚌毒素蛋白可以結合到固相上去，例如，在膜、微杆、電極或化學活化的玻璃表面上，然後可以俘獲標記的PST複合物。然後可以如本領域技術人員所熟知的那樣進行競爭實驗。
此外，該偶聯物可以用來篩選針對PSTs的特異性抗體或結合PSTs的DNA或RNA適配子。
因此，本發明的另一方面提供了俘獲PST的抗體或結合PSTs的DNA或RNA適配子的方法，包括(1)提供一種PST偶聯物，該PST偶聯物包括一PST部分，其經過一連接子，並通過一親蛤蚌毒素蛋白的非結合部位的部位結合於一生物素部分；(2)將該PST偶聯物暴露於假定含有所述抗體或適配子的樣品中，用以產生反應混合物，並且暴露於(鏈黴)抗生物素蛋白中；以及
(3)允許通過該PST部分結合到抗體或適配子上，並通過該生物素部分結合到(鏈黴)抗生物素蛋白上，用以形成一種俘獲的PST複合物。
有利地，PST是分類為蛤蚌毒素類的PSTs之一，尤其是蛤蚌毒素本身。
本發明的另一方面提供了PST偶聯物，供生物素/(鏈黴)抗生物素蛋白系統之用，其包括經過一連接子，並通過一親蛤蚌毒素蛋白的非結合部位的部位結合於生物素的PST。
有利的是，該連接子通過蛤蚌毒素的C12或C13或在其他PSTs中的等效位置，優選通過C13連接到PST上。鍵合可以是通過任何合適的連接基團並且可以通過與在PST上預先存在的官能團的反應或通過與由修飾PST所引入的基團的反應而形成。
可以採用任何合適的方式來引入合適長度的連接子，並且在延長連接子時可以利用不同的化學性質。
在本發明的特別優選的具體實施方式
中，鍵合是在脫甲氨醯化作用以後通過蛤蚌毒素本身的C13進行的。
在一
具體實施例方式
中，反應涉及形成酯鍵的形成。有利的是，dcSTX與二元羧酸(或相應的酸酐)進行反應。在本發明的特別優選的形式中，二元羧酸是琥珀酸/酸酐以便形成半琥珀酸dcSTX酯。有利的是，二元羧酸衍生物與生物素的肼衍生物進行反應用以將生物素連接到PST上。
可選替換的是，dcSTX與異氰酸酯進行反應，該異氰酸酯含有能夠連接到生物素衍生物上的官能團，如異氰酸N-(對-馬來醯亞胺苯基)酯，其能夠與生物素的硫氫基衍生物進行反應。
應當明了，連接子可以包括可以由官能團和/或雜原子和/或環狀結構中斷的碳鏈，包括環烷基、雜環以及芳環結構，並且可選被取代。在本發明特別優選的具體實施方式
中，連接子的長度大於4個原子(或相等長度，其中環狀結構存在於連接子中)以便促進親蛤蚌毒素蛋白整個範圍的結合。然而，通過延長連接子可以顯著改善結合親和力，並且長度為5個或更多原子的連接子是優選的。雖然僅出於經濟原因的考慮和缺少實際合成，對連接子長度給出了上限，但連接子長度優選為5至20個原子。連接子長度更優選為8至18個原子並且連接子長度最優選為11至18個原子。雖然不希望受到理論的限制，但被認為在結合PST時某些親蛤蚌毒素蛋白經歷構象變化，其對結合反應施加空間限制，雖然這些限制的程度在親蛤蚌毒素蛋白之間將依賴於它們的特性而有所不同。
根據本發明另外的方面，提供了包括一種PST偶聯物的複合物，其通過該PST部分複合到親蛤蚌毒素蛋白上。
根據本發明另外的方面，提供了一種包括PST偶聯物的複合物，其通過生物素部分複合到(鏈黴)抗生物素蛋白上。
根據本發明另外的方面，提供了一種包括如上所述的PST偶聯物的親和純化介質。
根據本發明的又一個方面，提供了一種包括如上所述的PST偶聯物的PST生物傳感裝置。
根據本發明的又一個方面，提供了一種PST生物傳感裝置，其包括共價連接於一種固體載體的親蛤蚌毒素蛋白，以及用於檢測PST偶聯物結合於其上的設備。
通常該PST偶聯物結合於(鏈黴)抗生物素蛋白，其使得可以對結合進行檢測，例如，通過結合後質量的變化進行檢測。
如本文中所使用的，術語「麻痺性貝毒素」或PST是指具有如上所述的通式I的化合物或其變異體，由於它們能夠結合於電位依賴性鈉通道，其對於哺乳動物具有毒性。
如在本文中所使用的，術語「PST殘基」或「PST部分」是指連接反應以後的PST殘基，該連接反應包括這類反應，其中官能團被除去作為前體物(如在C13的脫甲氨醯化作用或在C12的還原作用用以產生蛤蚌毒素醇(saxitoxinol))，因此由該PST構成了那些仍保留在反應產物中的原子。
如在本文中所使用的，術語「生物素」是指化合物生物素本身及其衍生物，其保留了結合抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白的能力，如脫硫生物素及其衍生物，其能夠可逆地結合於(鏈黴)抗生物素蛋白。
如在本文中所使用的，術語「(鏈黴)抗生物素蛋白」是指多肽鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白本身、或鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的修飾形式(包括其片段)，其保留了結合生物素的能力。尤其是，可以設想已去糖基化的抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白，如中性抗生物素蛋白生物素-結合蛋白(Invitrogen)和選擇性硝化的抗生物素蛋白衍生物(CaptAvidin，Invitrogen)，其親和力被顯著降低，用以使生物素的可逆結合成為可能。
如在本文中所使用的，術語「生物素殘基」或「生物素部分」是指連接反應以後生物素本身或其衍生物(如由上述定義的術語「生物素」所包括的)的殘基。
「生物素/(鏈黴)抗生物素蛋白系統」或等效術語，是指任何系統，包括測定、標記反應、純化以及合成，其涉及如本文中所定義的(鏈黴)抗生物素蛋白和如本文中所定義的生物素之間的結合相互作用，其中可以涉及不管什麼其他部分。作為(鏈黴)抗生物素蛋白的一種可選替換，可以採用抗生物素抗體用來檢測生物素。
如在本文中所使用的，術語「親蛤蚌毒素蛋白」是指具有不同功能的一類蛋白的任何成員，其特點在於它們結合蛤蚌毒素的能力。該親蛤蚌毒素蛋白包括具有這種性能的運鐵蛋白，具有這種性能的鈉通道和其他的疏水蛋白或膜結合蛋白，以及一組親水蛋白，該親水蛋白結合蛤蚌毒素和河豚毒素如河豚親蛤蚌毒素蛋白，不管知道或不知道它們的來源、化學性質或結構，只要蛋白質發揮其通常的生理作用。鑑於本發明的各個方面，涉及先前未知的親蛤蚌毒素蛋白的檢測、分離、以及表徵，應當明了，通過使用所述術語可以設想具有這種性能的已知的和先前未發現的分子。
在整個說明書和權利要求中，單詞「包括」是在非排他性意義上加以使用的，除非在上下文中另有要求。
可以清楚地理解，雖然在本文中引用了許多現有技術出版物，但這種引用並不是承認任何這些文獻在澳大利亞或在任何其他國家形成了本技術領域的一般公知常識的一部分。
附圖簡要說明

圖1是在實施例1中所製備的蛤蚌毒素偶聯物生物素-連接11-STX的質譜。
圖2是在實施例2中所製備的蛤蚌毒素偶聯物生物素-連接4-STX的質譜。
圖3示出了圖形形式的數據，圖示說明了在親蛤蚌毒素蛋白受體結合測定中在實施例1中所合成的化合物和放射性蛤蚌毒素之間的有效競爭，其表明了本發明的化合物結合親蛤蚌毒素蛋白。
圖4是曲線圖，圖示說明了在親蛤蚌毒素蛋白受體結合測定中在實施例2中所合成的複合物和放射性蛤蚌毒素之間的有效競爭，其表明了本發明的複合物結合親蛤蚌毒素蛋白，並且連接子的長度影響它們對於親蛤蚌毒素蛋白的親和力。
圖5示出了通過表面等離子體共振並利用生物素-連接11-STX對於標準蛤蚌毒素的檢測結果，其中生物素-連接11-STX被固定在塗布了鏈黴抗生物素蛋白的膜上，作為用於親蛤蚌毒素蛋白的俘獲探針。
具體實施例方式
實施例1生物素-連接11-STX的合成以及生物素-連接4-STX的合成在密封、抽真空的玻璃管中，在110℃下，通過在6M的HCl中水解4小時，將分離自甲殼類的蛤蚌毒素轉化成脫甲氨醯基-蛤蚌毒素(dcSTX)。將該溶液冷凍乾燥。將殘留物再溶解於0.05M的乙酸中，並將該溶液通過C18固相萃取柱柱體。將dcSTX通過凝膠過濾劑-P2層析法加以純化，並冷凍乾燥。
然後將dcSTX再溶解於0.1M pH為6.8的磷酸鈉緩衝液中，並通過在10℃下與兩次連續加入的琥珀酸酐(比率為dcSTX∶琥珀酸酐＝1∶20)反應2小時而轉化成半琥珀酸dcSTX酯，同時保持溫度為10℃以及pH為5.7±0.1。然後將半琥珀酸dcSTX酯從dcSTX中分離出來並加以純化，其中通過陰離子交換層析法並利用0.01M的磷酸鈉緩衝液作為洗脫溶劑，並且通過Carbograph石墨化炭黑進行固相提取，並利用超純水作為洗脫溶劑。
然後將半琥珀酸dcSTX酯充分冷凍乾燥，並在室溫下、在4摩爾當量的HATU(O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲陽離子六氟磷酸鹽，O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N，N，N′，N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate)存在下與4摩爾當量的生物素-醯肼或生物素-LC-醯肼反應過夜，用以分別產生生物素-連接4-STX和生物素-連接11-STX。
然後通過親水相互作用色譜-質譜測定法(HIC LC-MS)並利用Agilent 1100系列LC對生物素-連接4-STX和生物素-連接11-STX進行表徵並純化，其中LC是偶聯於裝備有電噴霧電離界面(HV毛細管+4kV，分離器(skimmer)電壓40V)的Esquire 3000+四極離子阱質譜儀(Bruker Daltonics，Billerica MA，美國)。LC分離是在保持在40℃的TSK-凝膠醯胺-80柱(5μm，250mm×4.6mm的內徑；TosoHass)上用2mM的甲酸銨、3.6mM的甲酸在50％的乙腈水中的等度溶液，以1mL/min的速度實現的。將純化後的化合物進行冷凍乾燥，並且儲存供進一步試驗用。生物素-連接11-STX的質譜(圖1)表明了在m/z＝710.0±0.5Da處存在單電荷離子，並且在m/z＝355.5±0.5Da處存在雙電荷離子。生物素-連接4-STX的質譜(圖2)表明了在m/z＝597.0±0.5Da處存在單電荷離子，以及在m/z＝298.9±0.5Da處存在雙電荷離子。
示於圖3的數據證實了生物素-連接11-STX結合親蛤蚌毒素蛋白。所採用的受體結合測定法描述於共同提出的未決國際申請第WO 02/48671號中，其內容以引用方式結合於本文中加以參考。將過濾用96孔微量滴定板用0.3％的聚1，2-亞乙基亞胺(polyethyleneimmine)預塗布1小時。將製備自生物巨型蜈蚣(Ethmostigmusrubripes，E.r.SXFN)的野生親蛤蚌毒素蛋白在室溫下並在氚標記的蛤蚌毒素[3H]STX以及幾次稀釋的半琥珀酸dcST酯和生物素-連接11-STX存在的情況下溫育1小時。將溶液過濾，而親蛤蚌毒素蛋白保留在過濾器上。所測得的信號相應於在過濾器上的殘留放射性，並直接與結合於親蛤蚌毒素蛋白的[3H]STX濃度相關。所示出的數據表明生物素-連接11-STX和半琥珀酸dcSTX酯均能夠與[3H]STX競爭親蛤蚌毒素蛋白的結合。通過分別試驗超純水和游離的非放射性蛤蚌毒素而得到陽性和陰性對照。
實施例2生物素-連接18-STX的合成在密封、抽真空的玻璃管中，在110℃下，通過在6M的HCl中水解4小時，將分離自甲殼類的蛤蚌毒素轉化成脫甲氨醯-蛤蚌毒素(dcSTX)。將該溶液冷凍乾燥。將殘留物再溶解於0.05M的乙酸中，並將該溶液通過C18固相萃取柱柱體。將dcSTX通過凝膠過濾劑-P2層析法加以純化並冷凍乾燥。將殘留物再溶解於無水DMF中，並在室溫下與過量的PMPI(異氰酸N-(對-馬來醯亞胺苯基)酯)反應過夜，用以產生PMPI-STX。通過反相HPLC-MS來純化PMPI-STX。在室溫下將NHS-LC-生物素與10mM pH為7.7的磷酸鈉緩衝液中的半胱胺反應3分鐘。將最終產物(生物素的硫氫基衍生物)通過C18固相提取加以純化，並冷凍乾燥過夜。將PMPI-STX再溶解於10mM pH為6.8的磷酸鈉緩衝液中，並在室溫下和過量的硫氫基生物素反應15分鐘，從而產生生物素-連接18-STX，隨後通過LC-MS來加以純化。生物素-連接18-STX的特點在於反相色譜和親水相互作用色譜測定均偶聯於電噴霧電離-串聯質譜測定(ESI-MS/MS)上。該質譜表明在m/z＝444.2Da處存在雙電荷離子。
實施例3製備抗生物素蛋白.生物素-連接4-STX、鏈黴抗生物素蛋白.生物素-連接4-STX、抗生物素蛋白.生物素-連接11-STX、以及鏈黴抗生物素蛋白.生物素-連接11-STX複合物鏈黴抗生物素蛋白.生物素-連接4-STX和鏈黴抗生物素蛋白.生物素-連接11-STX將324.8pmol的生物素-連接4-STX和90.4pmol的生物素-連接11-STX各自與10mM的磷酸鹽緩衝液(pH為6.5)中的30μg的免疫純鏈黴抗生物素蛋白混合，並在+4℃下溫育2小時。在溶液中加入400μL 0.1％的甲酸，然後利用5,000截止(cutoff)微透析離心管將溶液過濾少至30μL。重複相同的步驟一次。然後加入200μL 0.1％的甲酸，並再次將溶液過濾少至30μL。用水將生物素-連接4-STX的最終容積調節到65μL(最終濃度為5μM)，而對於生物素-連接11-STX用水將最終容積調節到90μL(最終濃度為1μM)。
抗生物素蛋白.生物素-連接4-STX和抗生物素蛋白.生物素-連接11-STX將324.8pmol的生物素-連接4-STX和90.4pmol的生物素-連接11-STX各自與10mM的磷酸鹽緩衝液(pH為6.5)中的50μg的免疫純抗生物素蛋白混合，並在+4℃溫育2小時。在溶液中加入400μL 0.1％的甲酸，然後利用5,000截止微透析離心管將溶液過濾少至30μL。重複相同的步驟一次。然後加入200μL 0.1％的甲酸，並再次將溶液過濾少至30μL。對於生物素-連接4-STX用水將最終容積調節到65μL(最終濃度為5μM)，而對於生物素-連接11-STX用水將最終容積調節到90μL(最終濃度為1μM)。
實施例4競爭實驗在加入試劑以前，將96孔GF/B微滴定過濾板(Millipore)用0.3％(w/v)的PEI預塗布至少1小時。所有反應都是在150μl的總容積中進行，其中包括20mM的MOPS-NaOH(pH為7.4)、200mM的NaCl、2nM的[3H]STX和稀釋70倍的粗製親蛤蚌毒素蛋白提取液(總蛋白質濃度為約10mg/mL)。在通過膜吸入之前允許對實驗進行1小時的平衡。用200μl的水對孔衝洗兩次。允許對未標記的STX、抗生物素蛋白.生物素-連接4-STX、鏈黴抗生物素蛋白.生物素-連接4-STX進行連續稀釋直到500nM，允許對抗生物素蛋白.生物素-連接11-STX和鏈黴抗生物素蛋白.生物素-連接11-STX進行連續稀釋直到100nM，以便與1.8nM的[3H]STX對於親蛤蚌毒素蛋白的結合部位進行競爭(圖4)。
IC50的計算利用方程粘合分數＝[STX]n/([STX]n+IC50n)，來擬合競爭曲線(圖1)，其中斜坡的斜率n＝1(除了抗生物素蛋白.生物素-連接4-STX，其中n＝0.85，以及鏈黴抗生物素蛋白.生物素-連接4-STX，其中n＝0.7)，IC50是引起50％抑制的濃度，並且[STX]是蛤蚌毒素或蛤蚌毒素類似物的濃度。

雖然通過延長連接子至11個原子可以顯著改善親和力(IC50大約低5倍)，但是在生物素和STX之間使用大於4原子長度的連接子可以使得抗生物素蛋白-生物素-連接子-STX結合於親蛤蚌毒素蛋白連接子。使用鏈黴抗生物素蛋白代替抗生物素蛋白時，連接子的長度的影響甚至更明顯。事實上，眾所周知，由於其結合部位的特定構象的結果，空間位阻由於鏈黴抗生物素蛋白而增加。在濃度高達500nM時，鏈黴抗生物素蛋白.生物素-連接4-STX不可能取代放射性標記的STX，這顯示了對於親蛤蚌毒素蛋白的弱親和力(估計的IC50＞1.5μM)。與之相反，使用11個原子的連接子使得鏈黴抗生物素蛋白.生物素-連接11-STX可以牢固地結合於親蛤蚌毒素蛋白，並具有和抗生物素蛋白.生物素-連接子11-STX(IC50＝4.5nM)類以的IC50。
實施例5通過表面等離子體共振檢測蛤蚌毒素利用Biacore X系統，以1μL/min的流速，將140μL的生物素-連接11-STX固定在塗布了鏈黴抗生物素蛋白的膜上(SA晶片，Biacore，Uppsala)。通過將純生物素-LC-醯肼結合到在同樣晶片上的相同的鏈黴抗生物素蛋白的膜而得到參比膜。然後將在pH為7.4的生理緩衝液中的巨型蜈蚣(Ethmostigmus rubripes)的親蛤蚌毒素蛋白的製劑注射並用緩衝液徹底洗滌。注射標準的蛤蚌毒素並通過與參比信號比較來測量親蛤蚌毒素蛋白的絕對取代。圖5上的柱狀示說明通過表面等離子體共振並利用生物素-連接11-STX作為俘獲探針可以檢測100ppb至1ppm的蛤蚌毒素。
權利要求
1.一種用於俘獲親蛤蚌毒素蛋白的方法以便於檢測、表徵、分離和/或純化所述親蛤蚌毒素蛋白或其配體，該方法包括(1)提供一種PST偶聯物，所述PST偶聯物包括一PST部分，所述PST部分經過一連接子並通過一親蛤蚌毒素蛋白的非結合部位的部位，直接或間接結合於一生物素部分；(2)將所述PST偶聯物暴露於假定含有所述親蛤蚌毒素蛋白的樣品，用以產生反應混合物，並且暴露於(鏈黴)抗生物素蛋白；以及(3)允許通過所述PST部分結合到所述親蛤蚌毒素蛋白上，並且通過所述生物素部分結合到(鏈黴)抗生物素蛋白上，以便形成一種俘獲的PST複合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述(鏈黴)抗生物素蛋白共價連接於固體載體。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述固體載體是一種用於親和純化的介質。
4.根據權利要求2所述的方法，其中所述固體載體適用於生物傳感裝置。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述(鏈黴)抗生物素蛋白攜帶一種可檢測的標記物。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述親蛤蚌毒素蛋白共價連接於一種固體載體。
7.根據權利要求1至6中任一權項所述的方法，其中所述PST是一種蛤蚌毒素。
8.一種用於檢測、表徵、分離和/或純化親蛤蚌毒素蛋白的方法，包括(1)提供一種PST偶聯物，所述PST偶聯物包括PST部分，所述PST部分經過一連接子並通過一親蛤蚌毒素蛋白的非結合部位的部位結合於一生物素部分；(2)將所述PST偶聯物暴露於假定含有所述親蛤蚌毒素蛋白的樣品，用以產生反應混合物，並且暴露於(鏈黴)抗生物素蛋白；(3)允許通過所述PST部分結合到所述親蛤蚌毒素蛋白上，並且通過所述生物素部分結合到(鏈黴)抗生物素蛋白上，以便形成一種俘獲的PST複合物；以及(4)通過所述俘獲的PST複合物對所述親蛤蚌毒素蛋白進行檢測、表徵、分離和/或純化。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述(鏈黴)抗生物素蛋白共價連接於一種固體載體。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述固體載體是一種用於親和純化的介質。
11.根據權利要求10所述的方法，其中將所述PST偶聯物在暴露於所述樣品之前固定於所述介質上。
12.根據權利要求10所述的方法，其中將所述PST偶聯物暴露於所述樣品中，以便形成一種通過所述介質用於俘獲的PST複合物。
13.根據權利要求9至12中任一權項所述的方法，進一步包括從所述介質中洗滌所述親蛤蚌毒素蛋白以便分離和/或純化所述親蛤蚌毒素蛋白的步驟。
14.根據權利要求9所述的方法，其中所述固體載體適用於生物傳感裝置。
15.根據權利要求8所述的方法，其中所述(鏈黴)抗生物素蛋白攜帶一種可檢測的標記物。
16.根據權利要求8所述的方法，其中所述親蛤蚌毒素蛋白共價連接於一種固體載體。
17.根據權利要求8至16中任一權項所述的方法，其中所述PST是蛤蚌毒素。
18.一種用於俘獲PST的抗體或結合PST的RNA適配子的方法，包括(1)提供一種PST偶聯物，所述PST偶聯物包括一PST部分，所述PST部分經過一連接子並通過一親蛤蚌毒素蛋白的非結合部位的部位結合於一生物素部分；(2)將所述PST偶聯物暴露於假定含有所述抗體或適配子的樣品，用以產生反應混合物，並且暴露於(鏈黴)抗生物素蛋白；以及(3)允許通過所述PST部分結合到所述抗體或適配子上，並且通過所述生物素部分結合到(鏈黴)抗生物素蛋白上，以便形成一種俘獲的PST複合物。
19.一種用於生物素/(鏈黴)抗生物素蛋白系統的PST偶聯物，包括經過一連接子並通過一親蛤蚌毒素蛋白的非結合部位的部位結合於一生物素部分的PST部分。
20.根據權利要求19所述的PST偶聯物，其中所述連接子通過蛤蚌毒素的C12或C13或在其他PSTs中的等效位置連接到所述PST部分。
21.根據權利要求20所述的PST偶聯物，其中所述連接子是通過脫甲氨醯蛤蚌毒素的C13進行連接的。
22.根據權利要求19至21中任一權項所述的PST偶聯物，其中所述連接子含有4個或更多的原子。
23.根據權利要求22所述的PST偶聯物，其中所述連接子具有5至20個原子。
24.根據權利要求23所述的PST偶聯物，其中所述連接子具有11至18個原子。
25.一種包括權利要求21至24中任一權項所述的PST偶聯物的複合物，所述複合物通過所述PST部分複合到親蛤蚌毒素蛋白上。
26.一種包括權利要求21至權利要求24中任一權項所述的PST偶聯物的複合物，所述複合物通過所述生物素部分複合到(鏈黴)抗生物素蛋白上。
27.根據權利要求26所述的複合物，其中所述(鏈黴)抗生物素蛋白攜帶一種可檢測的標記物。
28.根據權利要求26所述的複合物，其中所述(鏈黴)抗生物素蛋白共價連接於一種固體載體。
29.一種親和純化介質，包括一種根據權利要求28所述的複合物。
30.一種PST生物傳感裝置，包括一種根據權利要求28所述的複合物。
31.一種PST生物傳感裝置，包括共價連接於一種固體載體的親蛤蚌毒素蛋白以及用於檢測根據權利要求21至24中任一權項所述的PST偶聯物結合於其上的設備。
32.根據權利要求31所述的PST生物傳感裝置，其中所述PST偶聯物結合於(鏈黴)抗生物素蛋白。
33.根據權利要求32所述的PST生物傳感裝置，其中質量的增加被檢測。
全文摘要
本發明涉及用於俘獲親蛤蚌毒素蛋白的方法以便於檢測、表徵、分離和/或純化所述親蛤蚌毒素蛋白或其配體，該方法包括(1)提供一種PST偶聯物，該PST偶聯物包括PST部分，該PST部分經過連接子並通過一親蛤蚌毒素蛋白的非結合部位的部位直接或間接地結合於生物素部分；(2)將該PST偶聯物暴露於假定含有所述親蛤蚌毒素蛋白的樣品，用以產生反應混合物，並且暴露於(鏈黴)抗生物素蛋白；以及(3)允許通過該PST部分結合到親蛤蚌毒素蛋白，並且通過該生物素部分結合到(鏈黴)抗生物素蛋白上，用以形成俘獲的PST複合物。
文檔編號C07D487/14GK1774632SQ200480003991
公開日2006年5月17日 申請日期2004年2月12日 優先權日2003年2月12日
發明者塞德裡克·埃米爾·弗朗索瓦·羅比約 申請人:克利夫蘭生物傳感器私人有限公司