用於中風和缺血或缺血性病況的人抗體及其特異性結合序列的製作方法

2023-06-30 23:52:46 4

用於中風和缺血或缺血性病況的人抗體及其特異性結合序列的製作方法
【專利摘要】提供能夠結合併識別CNS中的神經元並引起CNS神經元反應的特異性結合成員、特別是人抗體、特別是重組抗體及其片段。所述抗體可用於與神經損害、損傷或變性有關的病況和神經變性疾病的診斷和治療，特別是治療或減輕中風或腦缺血。本發明的抗體、其可變區或其CDR結構域序列及其片段還可用於與化學治療劑、免疫調節劑或神經活性劑和/或與其它抗體或其片段的聯合療法。所述抗體或其活性片段可以單獨或與溶栓劑例如TPA組合用於中風或腦缺血的療法中。抗體通過本文提供其序列的抗體IgM12和IgM42舉例說明。
【專利說明】用於中風和缺血或缺血性病況的人抗體及其特異性結合序 列
[0001] 政府支持聲明 本文所述發明全部或部分受國立衛生研究院（National Institutes of Health)(資 助號 ROl NS 24180、R01 NS 32129、R01 CA104996、R01 CA096859)及全國多發性硬化協會 (National Multiple Sclerosis Society)(資助號 CA 1011 A8-3)的支持。美國政府在 本發明中享有一定權利。 發明領域
[0002] 本發明涉及能夠結合併識別CNS中的神經元並能夠引起CNS神經元反應的抗體， 特別是人天然抗體、來源其的重組抗體及其片段。這些抗體可用於診斷和治療與神經損害、 損傷或變性有關的病況、神經變性疾病、慢性神經損傷或損害和突發性神經損傷或損害。本 發明的抗體、其可變區或其CDR結構域序列及其片段還可用於與化療劑、免疫調節劑或神 經活性劑和/或與其他抗體或其片段組合的療法中。本發明特別涉及用於減輕或治療中風 或缺血、特別是腦缺血的方法，和用於中風或缺血的相關藥劑、構建體和組合物。
[0003] 發明背景 神經再生是指神經組織、細胞或細胞產物的再生長或修復。此類機制可包括髓鞘再生、 新的神經元、膠質細胞、軸突、髓磷脂或突觸的產生。神經再生因所涉及的功能機制以及再 生程度和速度而在周圍神經系統（PNS)和中樞神經系統（CNS)間有所不同。
[0004] 在損傷後成熟哺乳動物中樞神經系統（CNS)中的軸突再生非常有限。因此，在脊 髓損傷（SCI)、創傷性腦損傷、中風和涉及軸突斷裂的相關病況之後功能缺陷持續存在。這 種情形不同於哺乳動物周圍神經系統（PNS)中的情況，周圍神經系統中長距離軸突再生和 實質性功能恢復可發生在成體中。神經元的胞外分子和內在生長能力兩者影響再生的成 功。
[0005] 成年哺乳動物中，中樞神經系統（CNS)軸突在損傷後不會自發地再生。相比之下， 周圍神經系統（PNS)軸突容易再生，允許在周圍神經損害後恢復功能。Aguayo與同事證實， 至少一些成熟CNS神經元當提供有允許的周圍神經移植物時保持再生的能力（Richardson PM, McGuinness UM, Aguayo AJ (1980) Nature 284:264 - 265; Richardson PM, Issa VM, Aguayo AJ (1984) J Neurocytol 13:165 - 182; David S, Aguayo AJ (1981) Science 214:931 - 933; Benfey M, Aguayo AJ (1982) Nature 296:150 - 152)。該研究 表明對於軸突生長，PNS環境是刺激性的和/或CNS環境是抑制性的。隨後的研究鑑定出 PNS中的生長促進因子和CNS中的生長抑制因子兩者。再生的抑制劑包括CNS髓磷脂中的 特定蛋白質和與星形膠質瘢痕有關的分子。另外，CNS中相對於PNS的較慢的碎片清除可 妨礙軸突再生。了解影響軸突生長的因素對開發促進CNS再生的治療劑至關重要。
[0006] 在周圍神經損傷後，軸突容易再生。與細胞體斷開的軸突的遠端部分進行沃勒變 性。這種活性過程導致軸突斷裂和分解。碎片被神經膠質細胞（主要為巨噬細胞）除去。 近端軸突然後可再生，並且使其目標重新受神經支配，使得功能恢復。
[0007] CNS再生抑制劑的兩個主要類別是髓磷脂相關抑制劑（MI)和硫酸軟骨素蛋白聚 糖（CSPG)。這些分子限制軸突再生，並且通過幹擾其功能，在成體CNS中實現某種程度的生 長。細胞自主性因子也是CNS再生失敗的重要決定因素。CNS神經元不會增量調節生長相關 基因至與PNS神經元相同的程度。因此甚至在沒有抑制劑時，其再生能力也受到限制。提高 神經元的內在生長能力允許CNS內適度的軸突再生（Bomze HM等人（2001) Nat Neurosci 4:38 - 43; Neumann S，Woolf CJ (1999) Neuron 23:83 - 91)。
[0008] 作為CNS髓磷脂的組分，MAI是由少突膠質細胞表達的蛋白質。MAI體外削弱神經 突增生，被認為在CNS損傷後體內限制軸突生長。MAI包括Nogo-A (Chen MS等人（2000) Nature 403:434 - 439; GrandPre T 等人（2000) Nature 403:439 - 44)、髓憐脂相關糖蛋 白（MAG) (McKerracher L等人（1994) Neuron 13:805 - 811)、少突膠質細胞髓憐脂糖蛋 白（OMgp) (Kottis V 等人（2002) J Neurochem 82:1566 - 1569)、肝配蛋白-B3 (Benson MD 等人（2005) Proc Nat Acad Sci USA 102:10694 - 10699)和腦信號蛋白 4D (Sema4D) (Moreau-Fauvarque C 等人（2003) J Neurosci 23:9229 - 9239)。這些中的 3 種（Nogo-A、 MAG和OMgp)與神經元Nogo-66受體I (NgRl)相互作用從而限制軸突生長。這3種在結構 上不相關的配體還對第二種軸突生長抑制性受體（配對的免疫球蛋白樣受體B (PirB))顯 示親和力（Atwal JK 等人（2008) Science 322:967 - 970)。
[0009] 已鑑定出幾種識別分子，其充當構成促進和/或抑制神經突生長的基礎的分子 線索。在神經突增生促進性識別分子中，神經細胞粘附分子Ll在介導神經突增生中起突 出作用（Schachner M (1990) Seminars in the Neurosciences 2:497-507)。Ll 依賴 性神經突增生受嗜同性（homophilic)相互作用介導。LI促進表達LI的神經突和施萬細 胞及Ll轉染的成纖維細胞中的神經突增生（Bixby等人（1982) Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 84:2555-2559; Chang 等人（1987) J Cell Biol 104:355-362; Lagenaur 等人· (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:7753-7757; Seilheimer 等人（1988) J Cell Biol 107:341-351; Kadmon 等人（1990) J Cell Biol 110:193-208; Williams 等人（1992) J Cell Biol 119:883-892)。
[0010] 神經系統損傷每年影響90, 000多人，如果包括腦血管事件例如中風，則人數大更 多。據估計，僅脊髓損傷每年就影響10, 〇〇〇人。由於神經損傷這種高的發生率，神經再生和 修復（神經組織工程學的分支學科），正成為致力於發現損傷後恢復神經功能的新方法的 快速發展的領域。神經系統被分成兩部分：由腦和脊髓組成的中樞神經系統及由腦神經和 脊神經連同其相關神經節組成的周圍神經系統。雖然周圍神經系統具有修復和再生的內在 能力，但是相比之下，且就絕大多數而言，中樞神經系統在其自我修復和再生能力方面受到 限制。目前還沒有可接受並獲得批准的在中樞神經系統損傷後恢復人神經功能的治療法。
[0011] 在脊髓損傷（SCI)後，軸突保護和修復作為防止運動神經元損失和永久失能的有 效策略仍具有巨大潛力。使用防止損害和促進損傷後軸突修復的靶向營養因子已實現了神 經元保護。這些分子主要採用基於體外系統（其集中於靶向特異性小分子神經營養因子） 的選擇策略而鑑定。雖然這些分子在臨床前模型中顯示神經保護結果，但是臨床試驗的結 果不太有利。
[0012] 使用損傷和疾病的多個模型，證實了天然自體反應性單克隆抗體在CNS細胞中 的有益生物功能。使用小鼠單克隆IgM，IN-1，體內證實了神經元存活、軸突再生和功能恢 復的抗體介導的促進（Bregman BS 等人（1995) Nature 378(6556):498-501; Caroni P, Schwab ME (1988) Neuron 1(1) :85-96)。在CNS損傷前使用脊髓勻漿物（SCH)免疫，獲得 類似結果（Ellezam B, Bertrand J, Dergham P, McKerracher L (2〇〇3) Neurobiol Dis 12(1):1-10; Huang DW 等人（1999) Neuron 24 (3): 639-647)。
[0013] 多發性硬化（MS)是一種慢性、頻繁進行性、炎性中樞神經系統（CNS)疾病，其病 理學特徵在於原發性脫髓鞘，通常沒有最初的軸突損傷。MS的病因和發病機制未知。MS 的幾個免疫學特徵及其與某些主要組織相容性複合體等位基因適度相關，引起了 MS是免 疫介導的疾病的推測。自身免疫假設得到實驗性自身免疫（變應性）腦脊髓炎（EAE)模 型的支持，其中將某些髓磷脂組分注射給遺傳易感動物導致T細胞介導的CNS脫髓鞘。然 而，在MS患者的CNS中未明確鑑定出特異性自身抗原和致病性髓磷脂反應性T細胞，MS 也不與其他自身免疫疾病有關。基於流行病學數據的備擇假設是環境因素，或許是未鑑定 的病毒促成了 CNS中的炎症反應，其導致直接或間接（"旁路對象（bystander)"）的髓磷 脂破壞，可能伴有受誘導的自身免疫組分。這種假設得到以下證據的支持：在人和動物兩 者中若干天然存在的病毒感染可引起脫髓鞘。一個普遍應用的實驗性病毒模型由泰勒氏 (Theiler' s)鼠腦脊髓炎病毒（TMEV)誘導（Dal Canto, M. C.，和 Lipton, H. L.，J Path., 88:497-500 (1977))〇
[0014] 在MS的情況下，脫髓鞘最終導致神經細胞死亡。然而，脫髓鞘後的軸突死亡不是 即時的。如果提供合適的支持分子或細胞，神經系統則具有明顯的修復能力。保護CNS的 軸突有希望成為限制存活軸突的喪失和防止永久失能的有效策略。可通過調節損傷中的潛 在神經毒性炎性環境來實現神經保護。正在研究設計以限制興奮性毒性、抑制一氧化氮或 阻斷離子通道的試劑作為保護處於危險中的軸突的方法（Pitt，D.，P. Werner，和C. S. Raine (2000) Nat Med 6:67-70; Okuda, Y 等人（1997) Journal of neuroimmunology 73:107-116; Waxman, S. G. (2002) .J Rehabil Res Dev 39:233-242)。這些試劑中的 許多是具有已經證實的毒性並全身作用於所有細胞的小分子。
[0015] 缺血是向組織的血液供應受限，引起細胞代謝（以保持組織存活）所需要的氧和 葡萄糖短缺。缺血通常由血管問題引起，引起組織的損害或功能障礙。它也指有時由於淤 血（諸如血管收縮、血栓形成或栓塞）導致的身體給定部分的局部貧血。缺氧是其中作為 整體的身體或身體區域（組織缺氧、或較不常見的區域缺氧）缺乏足夠氧供應的病況。動 脈氧濃度的變化可以是正常生理的一部分，例如，在劇烈身體鍛鍊過程中。氧供應和其在細 胞水平的需求之間的錯配可以導致缺氧狀況。缺血性缺氧在血流減少時發生，並且可以例 如在心臟衰竭和血管擴張性休克中發生。腦缺氧在沒有足夠氧氣進入腦部時發生。腦部需 要氧和營養物的恆定供給來發揮功能。
[0016] 在腦缺氧時，有時只有氧供應中斷。這可以由煙霧吸入）、一氧化碳中毒、氣哽、防 止呼吸肌運動的疾病、高海拔、氣管（氣管）上的壓力和窒息（Strangulation)引起。在其 他情況下，氧和營養物供給兩者都被停止或中斷，例如在心臟驟停、心律失常、全身麻醉並 發症、溺水、藥物過量、出生期間或出生後新生兒損傷，諸如腦性麻痺、中風、非常低血壓中。
[0017] 腦缺血是到腦部的血流不足，並且可以是急性或慢性的。急性缺血性中風是神經 緊急情況，如果快速治療，其是可逆的。慢性腦缺血可以導致被稱為血管性痴呆的痴呆形 式。影響腦部的短暫缺血發作被稱為短暫性缺血發作（TIA)，經常被稱為小中風。
[0018] 中風，也稱為腦血管意外（CVA)，是由於到腦部的血液供應幹擾導致的腦功能的迅 速損失。這可能是由於堵塞（血栓形成、動脈栓塞）或出血（血液滲漏）引起的缺血（缺 乏血流）。腦缺血，也被稱為腦缺血，是其中到腦部的血流不足以滿足代謝需求的病況，並且 是與蛛網膜下腔出血和腦內出血一起發生的中風類型。缺血可以是局灶性缺血，其限於腦 的特定區域，或全腦缺血，其涵蓋腦組織的廣泛區域。中風是美國長期殘疾的主要原因。每 年，接近800, 000人患有中風。缺血性損傷之後，與臨床赤字相關的殘疾主要是由於神經元 的功能障礙。功能恢復的缺乏部分歸因於再生和神經可塑性的限制（Walmsley，A.R.，和 Mir, A. K. (2007) Ci/rrefli 13:2470-2484)。中風可以導致改變 的運動功能，諸如在身體一側不能移動一個或多個肢體，認知效果，諸如不能理解或組織說 話，或其他缺陷，包括視覺效果，諸如不能看到視野的一側。目前不存在有效的治療來預防 或逆轉中風相關的神經系統缺陷。
[0019] 缺血性中風在醫院中偶爾用血栓溶解（也稱為"凝塊破壞者（clot buster) "）治 療，並且一些出血性中風受益於神經外科手術。復發的預防可以涉及施用抗血小板藥物， 諸如阿斯匹林和雙嘧達莫，控制和降低高血壓，並且使用他汀類藥物。所選患者可能受益 於頸動脈內膜切除術和使用抗凝血劑。腦缺血的介入治療仍然受限於通過使用重組組織 纖溶酶原激活劑rtPA的酶促血栓溶解（Brott，T.G.，等人（1992)泣rofc 23:632-640; Haley, E.C·，等人（1992) 23:641-645; Group, Τ·Ν· (1995) New England J Med 333:1581-1587)，和經由直接插管介入去除血液凝塊（Gobin YP等人（2004) Stroke 35:2848-2854)。然而，rtPA具有短的3小時的治療窗口，如果超過3小時時間期輸注，則 出血性腦缺血發病率增加（Clark, WM等人（1999) JAMA 282:2019-2026; Hacke W等人 (2008) New England J Med 359:1317-1329)。
[0020] 已鑑定出人單克隆自身抗體，其在中樞神經系統中顯示活性，並且與刺激髓鞘再 生特別有關。將期望的是，開發在CNS中具有活性且具有促進神經再生和/或保護神經元免 受疾病、損傷、損害和/或死亡的能力的人單克隆抗體，特別是具有這些活性的重組抗體， 特別是在中風或腦部/腦缺血的情況下，或當到腦部或CNS的氧或血流被剝奪或受急性或 慢性影響時。具體而言，具有進入CNS並治療、預防或減輕腦缺血或中風的能力的人單克隆 抗體的使用和應用將是期望的。本發明針對的正是該目標的完成。
[0021] 本文參考文獻的引用不應解釋為承認所述文獻是本發明的現有技術。
[0022] 發明概述 本發明涉及在CNS中具有特定有效性的神經調節劑，所述調節劑包含選自IgM亞型 的抗體、其活性片段、其單體、其激動劑及其組合的物質。本發明的神經調節劑或抗體具有 以下一個或多個特徵：它們保護和/或穩定神經元；它們靶向CNS或神經細胞損害、受損 (compromise)或損傷的部位；它們減少或阻止細胞死亡，例如過氧化氫誘導的細胞死亡。 在本發明的一個具體方面，所述藥劑，特別是神經元結合單克隆抗體是有效的，且可應用或 用於治療和減輕中風和缺血，特別是腦缺血，和其中涉及或已經發生神經細胞或腦的缺血 或缺氧的病況。
[0023] 本發明提供神經元結合單克隆抗體，其具有促進神經突延伸、以在神經再生中起 作用和/或保護神經元免受損害以及用於中樞神經系統的診斷和治療目的的能力。本研究 證明，當將神經元結合單克隆抗體、特別是抗體IgM12 rHIgM12施用於中風之後的動物（在 這種情況下，用於誘導缺血性中風的動物模型）時，其導致動物功能的明顯改善並保護組 織完整性。
[0024] 具體而言，提供特異性重組抗體，其中所述抗體識別並能夠結合神經元，包括皮質 神經元、海馬神經元、小腦顆粒細胞和視網膜神經節細胞，且在中風、缺血病況或神經細胞 或小膠質細胞缺血或缺氧事件中或之後，其靶向並介導神經元和神經細胞。本文提供重組 完全人抗體。本發明的抗體在與神經受損、損害或損傷有關的病況或疾病中具有診斷和治 療用途。
[0025] 在一個總體方面，本發明提供針對且能夠結合神經元上的一個或多個表位的抗 體，所述神經元包括皮質神經元、海馬神經元、小腦顆粒細胞和視網膜神經節細胞。在一個 大的方面，本發明提供分離的特異性結合成員（binding member)，特別是抗體或其片段， 包括識別、結合和/或靶向神經元的重組人抗體。本發明提供特異性結合神經元和保護 神經元免於細胞死亡並且不會促進髓鞘再生的抗體，特別是人抗體，特別是IgM抗體。本 發明的抗體應用於治療或減輕其中神經受損、損傷或損害或處於受損、損傷或損害風險的 哺乳動物的疾病或病況，包括應用於脊髓損傷（SCI)、創傷性腦損傷（TBI)、肌萎縮性側索 硬化（ALS)、多發性硬化（MS)、阿爾茨海默病（Alzheimer' s disease)、中風、帕金森病 (Parkinson's disease)、亨廷頓舞蹈病（Huntington's disease)、產前缺氧/圍產期缺血、 大腦性麻痺、腦病、脊髓病或運動神經元疾病，並且特別應用於神經元和這些疾病中神經能 力的保護、存活或維持。
[0026] 在一個具體方面，本發明的抗體或其組合物可用且應用於中風和腦缺血中。在一 個具體方面，本發明的抗體或組合物可用於其中到腦部的血流和/或氧不足以滿足代謝需 求或其中對腦部的創傷性損傷導致神經元和相關細胞的死亡或損傷或死亡或損傷風險的 病況。在一個具體方面，本發明提供抗體或其片段，其是抗體12或42,特別是血清來源的或 重組的IgM12或IgM42。
[0027] 在本發明的一個方面，提供包含圖5和/或圖6中所示的可變區⑶R序 列的重組或合成神經元結合抗體。抗體12包含圖5中所示的重鏈CDR序列 CDR1 GGSVSLVY (SEQ ID N0 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ^ ID NO 32： 和 CDR3 ARSAS 丨 RGWFD (SEOID 唚調..及輕鏈 CDR 序列 CDR1 QSlSSY (SEQ IDNO.:判、CDR2 AAS (SEQ ID NO;35；和 CDR3 QQSWTPW (SEQ IO NO:36)。抗體 42 包含圖 6 中所示的 重鏈 CDR 序列 CDR1 GFTFSTYA (SK! ID NO: 3打、C0R2 INVC5GVII (SEQ ID NO38)和 CDR3 VRRSGFDRNSSPADF (8EQ l〇 NO^35}及輕鏈 CDR 序列 CDW QGIG《SEQ D NO..爾、 CDR2 TTS 丨+SEO ID NOW)和C0R3 QKYNSAPRf (SEQ ID NO..銷。因此，以本文鑑定的抗體的 CDR 為基礎的重組抗體可用於靶向和保護神經元，特別是疾病或癌症中的易感、受損、損傷或損 害的神經元。
[0028] 本發明因此提供特異性結合神經元和保護神經元免於細胞死亡並且不會促進 髓鞘再生的分離的人IgM抗體或其片段，其中抗體或片段包含：(a)圖5所示的可變重 鏈胺基酸⑶R 結構域序列 CDm GGSVSIYY (SEQ ID NO:31)、CD?2 GYI+YSSGST (SEQ ? NO:· 和 CDW ARSASIRGWFD (SM D Nft33)及輕鏈 CDR 序列 CDR1 QSISSY (SEO ID?.:制)、 CDR2 AAS (SEOID NO:?!和 CDR3 QOSYHTPW (SEQ ID W:3Q ;或（b)圖 6 所示的可變重鏈 胺基酸⑶R 結構域序列 CDR1 證了rtyMseq 3D 37丨、CDR2 IWGGVTT {SEQ ID NO:38| 和 CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID N0.39j 和輕鏈 CDR 序列 CDR1 QGIG (SEOIO NO ]、 core TTS {SEQ ID ΝΟι.41;·和CDFQCWYN&APRT (SEQ ID NO: 42丨，以用於治療或減輕其中神經受損、 損傷或損害或處於受損、損傷或損害風險的哺乳動物的疾病或病況。
[0029] 在更具體的方面，本發明的抗體包含包括圖5和/或圖6所示的抗體12或42的 胺基酸序列。本發明的重組抗體IgM12包含圖5所示的可變重鏈序列（SEQ ID NO: 1)和輕 鏈序列（SEQ ID N0:11)。本發明的重組抗體IgM42包含圖6所示的可變重鏈序列（SEQ ID NO: 17)和輕鏈序列（SEQ ID N0:27)。在本發明的具體方面，重組抗體是包含人重鏈可變區、 恆定區和人J鏈的完全人重組抗體。本文提供完全人重組IgM12抗體，其包含圖5所示的 人免疫球蛋白重鏈（包含可變區（SEQ ID NO: 1)或其CDR)、人恆定區、特別是κ序列（SEQ IDN0:3、5、7和9)和人J鏈（SEQIDN0:15)。
[0030] 在又一個方面，本發明提供分離的抗體或其能夠結合抗原的片段，其中所述抗體 或其片段包含含有基本如本文或圖6中所示的胺基酸序列的多肽結合結構域。本發明提 供能夠結合神經元的分離的人抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含重鏈可變區（SEQ ID N0:17)或其CDR和輕鏈可變區（SEQ ID N0:27)或其CDR，或包含基本如本文或圖6中 所示的胺基酸序列。
[0031] 在又一個方面，本發明提供分離的完全人抗體或其能夠結合抗原的片段，其中 所述抗體或其片段包含含有基本如本文和圖5中所示的胺基酸序列的多肽結合結構 域。本發明提供能夠結合神經元的分離的完全人抗體或其片段，其中所述抗體或其片段 包含重鏈可變區（SEQ ID NO: 1)或其⑶R及輕鏈可變區（SEQ ID NO: 11)或其⑶R，或包 含基本如本文和圖5中所示的胺基酸序列。本發明特別提供分離的人IgM抗體或其活 性片段，其包含圖5所示的可變重鏈胺基酸⑶R結構域序列CDR! GGSVSLW (SEOID NO:31! 、C0R2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32)和 CDR3 ARSASiRGWFD (S+EQ _0 NO:33)及輕鏈 CDR 序列 CDR1 QSISSY (SEQ IDNO： 3IJ > CDR2 MS {SEQ D N0:% 和 C.DR3. QQSWTPW (SEO ID NO:36)。在 一個具體方面，本發明提供分離的完全人重組IgM抗體或其活性片段，其包含可變重 鏈胺基酸 CDR 結構域序列 CDm GGS闢LYY (SEO ID NO:31 丨、CDR2 GYiYSSGST (SEQ ID NO:32：| 和 CDR3 ARSASIRGWFD {SEQ ID NO 33丨及輕鏈 CDR 序列 CDR1 QSISSY (SEQ 丨DW 3$、 CDR2MS 丨SEQ ID N0.35丨和 CDR3 QQSWiPW {.SEQ O NO:：?)、人恆定區和 SEQ ID NO: 15 所示的 人J鏈序列。
[0032] 在其他方面，本發明提供包含編碼上述神經元結合多肽或抗體的序列的分離的 核酸和製備本發明的多肽或抗體的方法，所述方法包括在引起所述多肽或抗體表達的條 件下表達所述核酸，並回收多肽或抗體。在一個此類方面，提供編碼具有圖5或圖6所示 的胺基酸序列的抗體可變區序列的核酸或提供具有圖5或圖6所示的CDR結構域序列的 抗體。在一個方面，提供包含圖5或圖6的核酸序列的核酸。在又一個方面，提供編碼 圖5或圖6所示的重鏈可變區VH或輕鏈可變區VL的核酸。本發明還涉及編碼本發明抗 體的重組DNA分子或克隆基因或其簡併變體；優選核酸分子，特別是編碼抗體VH和VL、 特別是⑶R區序列的重組DNA分子或克隆基因，其具有圖5或圖6所示序列或能夠編碼 圖5或圖6所示序列。在優選的方面，本發明提供編碼IgM12的重鏈（SEQ ID N0:2)和輕 鏈可變區序列（SEQ ID N0:12)的核酸，以及編碼IgM42的重鏈（SEQ ID N0:18)和輕鏈 可變區序列（SEQ ID N0:28)的核酸。在本發明的一個方面，提供核酸，其編碼包含可變 重鏈胺基酸 CDR 結構域序列 CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID N0:31丨.、CDR2 GYiYSSGST (SEQ ID 和① R3 ARSASIRGWFD (SEQ ID N0.33)及輕鏈 CDR 序列 CDfi1 OSISSY (SEO ID?.. 34}、 CDfS AAS (SM ID NCWS和CDR3 QQSYHWW既(2丨D NO 3?的抗體或其片段。在又一個方面， 核酸還編碼人恆定區和人J鏈，特別是SEQ ID NO: 15的J鏈。在本發明的一個方面， 提供核酸，其編碼包含可變重鏈胺基酸⑶R結構域序列CDR1 GFTFSTYA (SEO ID NO: 37) 、GDR2 INVGSVTT (SEQ ID ?;38丨和 CDRS VRRSGP+D側SSPADF {SEQ 丨D NO:39丨及輕鏈 CDR 序列 CDR1 QGIG{SEQ ID NO: )、CDR2 TTS {SEO O NCH1)和 CDR3 OKYNSAPRT (SE0I.D ?312 丨的抗體或 其片段。在又一個方面，核酸還編碼人恆定區和人J鏈，特別是SEQ ID NO: 15的J鏈。
[0033] 包含本發明的可變區序列的抗體、其片段和重組抗體可用於治療、預防或診斷人 或動物體的方法，例如哺乳動物中的神經保護方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有 效量的本發明的抗體、其片段和重組抗體。包含本發明的⑶R結構域序列的重組抗體或其 片段可用於哺乳動物中的神經保護方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量的本發 明的抗體、其片段和重組抗體。
[0034] 本發明的藥劑，特別是重組抗體或其片段可在預防、治療或減輕能夠、可能或的確 導致CNS損傷的神經損傷、損害或受損和併發症的方法中用作神經保護劑。當涉及或關聯 神經元的結構、功能或存活喪失（包括腦損傷或創傷、脊髓損傷（SCI)、神經損傷、頭損傷、 其中腦供血減少或受損的病況、腦感染性疾病、神經變性疾病）時，本發明的治療或預防方 法是可適用的。根據本發明的方法治療、預防或減輕的示例性的此類疾病或病況包括脊髓 損傷（SCI)、創傷性腦損傷（TBI)、肌萎縮性側索硬化（ALS)、多發性硬化（MS)、阿爾茨海默 病、中風、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、產前缺氧/圍產期缺血和/或大腦性麻痺、腦病、脊髓病 和運動神經元疾病。本發明因此涉及治療或減輕其中神經受損、損傷或損害的哺乳動物中 或者其中神經或神經元易於受損、損傷或損害或者有受損、損傷或損害風險的情形中的疾 病或病況的方法，所述方法包括施用選自IgM12和IgM42的重組抗體或完全人抗體或其片 段。
[0035] 在本發明的一個具體方面，包含根據本發明的可變區序列的抗體、其片段和重組 抗體，可以用於方法中或以組合物施用以治療或減輕中風或腦缺血。在本發明的一個具 體方面，包含根據本發明的可變區序列的抗體、其片段和重組抗體，可以用於方法中或以 組合物施用以治療或減輕中風。在本發明的一個具體方面，包含根據本發明的可變區序 列的抗體、其片段和重組抗體，可以用於方法中或以組合物施用以治療或減輕腦缺血。在 本發明的一個實施方案中，包含根據本發明的可變區序列的抗體、其片段和重組抗體，可 以用於方法中或以組合物施用以改善病況諸如中風中的運動功能。包含根據本發明的可 變區序列的抗體、其片段和重組抗體，可以用於方法中或以組合物施用以改善患有或疑 似患有中風的動物中的運動功能。包含根據本發明的可變區序列的抗體、其片段和重組 抗體，可以用於方法中或以組合物施用以改善已經具有中風或具有腦缺血的動物中的運 動功能。在一個具體方面，如圖5中所示，包含重鏈CDR序列CDR1 GGSVSLYY(SEQ ID N0.31j 、CDR2 GYIYSSGST (SE-Q ID NO:32)和 GDR3 ARSASiRGWFD 〖SEQ ID ?.以及輕鏈 CDR 序列 CDW QSISSY (SEO ?NO.:34)、CDR2 MS {SEO ID NO:35)和 CDFQCMSWfPVV (SEOO NO:36)的 IgM12、 rIgM12、抗體12用於治療、預防或減輕中風或腦缺血。在其一個方面，包含根據本發明的可 變區序列的抗體、其片段和重組抗體可以在其中確定、懷疑中風和/或腦缺血或處於中風 和/或腦缺血的風險的情況下，包括其中可以施用或利用酶促溶栓劑，諸如組織纖溶酶原 激活劑（TPA)或其他溶栓劑或抗血栓形成劑的情況下，進行施用。
[0036] 在本發明的一個方面，在其中神經受損、損傷或損害的情況、疾病或病況中或者在 其中神經或神經元易於受損、損傷或損害或者有受損、損傷或損害風險的情形下，包含本發 明的可變區序列的抗體、其片段和重組抗體可用於方法中或以組合物施用以改進或穩定神 經功能或運動功能。在一個具體方面，抗體或其片段在疾病、創傷或病況的早期或初始階段 使用或施用，或在疾病、創傷或病況的進程或持續時間內重複，以利於或維持神經系統功能 或運動功能的改進或穩定，包括或選自運動（例如步行）或認知功能（例如回憶或識別）。
[0037] 在本發明的一個方面，包含根據本發明的可變區序列的抗體、其片段和重組抗體 可用於方法中或以組合物施用以減緩或減輕中風或腦缺血事件中的神經影響、缺陷、損害 或神經元細胞死亡。根據該方法，所述抗體減輕一種或多種功能或可評價的神經或運動參 數，包括可評估的或可量的參數例如中風量表（scale)或功能量表。抗體的施用有效改善 或減輕一種或多種與中風相關的症狀或參數，包括例如，上下肢運動功能、肢體共濟失調、 感覺功能、語言、聲音清晰度、注意力、注視和視覺功能、手臂、手和腿部力量和運動中的一 種或多種。
[0038] 本發明的方法可包括施用多於一種抗體或片段，包括抗體IgM12和42的 組合。在本發明的一個方面，提供包括施用一種或多種抗體或其片段的方法，其 中抗體包含（a)可變重鏈胺基酸⑶R結構域序列CDR1 GGSVSLYY丨SEQ ID N0:31}、 CDR2 GY1YSSGST |SEQ IO NO:32)和 COR3 ARSASlRGWFO {SEQ D 嶋:夠及輕鏈 CDR 序列 CDR1 QS丨SSY (SEQ IDNO 34)、CDR2 WS pEQ IO NO:36)和 CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID M0.3S),或（b)可 變重鏈胺基酸 CDR 結構域序列 CDR1 GFTFSTOMSEQ 丨D NO: 37]、CDR2 胸VG.GVTT (SEQ 10 ?5:38》 和 CDR3 VRRSGPDRNSSPAOF {SEQ ID NO.獨及輕鏈 CDR 序列 CDRI QGIGpEOIDNO:蝴、 CDR2 TTS (SEQ ?0 N0:41 丨和 CDR3 OKYNSAPRT (SEQ 丨D NO: β)。在又一個此類方法中，抗體 IgM12 和/或抗體IgM42的一種或多種可與另一種CNS活性抗體組合，特別包括抗體rHIgM22和 /或rHIgM46的一種或多種。rHIgM22抗體包含SEQ ID N0:43和44所示胺基酸序列，或 這些SEQ ID的CDR。rHIgM46抗體包含SEQ ID NO: 45和46所示胺基酸序列，或這些SEQ ID的⑶R。因此，抗體IgM12和/或抗體IgM42的一種或多種可與一種或多種包含以下 的髓鞘再生抗體組合：（a)包含CDRl序列SSGMH、CDR2序列V師SYDGSRKYYADSVKG和CDR3 序列GVTGSPTLDY的重鏈可變區CDR及包含CDRl序列SGSSSNiGNNFVS、CDR2序列DfTKRPS 和CDR3序列G(E丨TWDSSLSAV V的輕鏈可變區CDR ;或（b)包含CDRl序列SGFTFSSYW、 CDR2序列丨KKDGSEK和CDR3序列ARPfCGGDCYLPWYFD的重鏈可變區CDR及包含CDRl序列 QSVLYSSNNKNY、CDR2序列YWAS和CDR3序列QQYYNTPQA的輕鏈可變區CDR。抗體的組合 可在不同的時間和以不同的量或濃度共同或連續施用。可使用雙特異性或多特異性抗體。 在一個具體此類方面，通過聯合施用或通過相隔短的持續時間或較長持續時間（包括數小 時、數天或數周）的連續施用，將抗體12和/或42與抗體22和/或46和/或具有IgM22 或IgM46的⑶R區⑶RU OTR2和⑶R3序列的抗體組合施用。在一個此類具體方面，通過聯 合或連續施用，將抗體12和/或42與抗體22和/或46組合施用用於治療或減輕涉及神 經變性的疾病或病況，特別包括脫髓鞘。在又一個此類方面，通過聯合或連續施用，將抗體 12和/或42與抗體22和/或46組合施用用於治療或減輕脫髓鞘疾病或病況。在一個具 體方面，通過聯合或連續施用，將抗體12和/或42與抗體22和/或46組合施用用於治療 或減輕多發性硬化。在一個此類方面，在MS疾病的可測量臨床方面，實現髓鞘再生和神經 保護的聯合作用，包括協同作用。
[0039] 鑑於本發明藥劑的神經保護和/或神經再生能力，本發明還涉及產生和刺激神經 元增殖的體外方法，包括皮質神經元、海馬神經元、小腦顆粒細胞和視網膜神經節細胞的增 殖。此類增殖的神經元可適於移植和神經細胞治療方案和方法。
[0040] 本發明的診斷效用延伸到本發明的抗體在表徵CNS神經損傷或損害或者篩查或 評價涉及神經損傷、損害或死亡（包括壞死性或凋亡性死亡）的疾病或病況的測定法和方 法中的用途，包括體外和體內診斷和成像測定法。因此，所述抗體可用於測定和方法中以評 價中風或缺血和/或評估缺血或中風或預測的或懷疑的缺血或中風後的損傷。在免疫測定 中，可製備控制量的抗體等，並用酶、特異性結合配偶體、配體、染料、螢光標籤和/或放射 性元素標記抗體，然後可引入細胞樣品中。在標記材料或其結合配偶體有機會與樣品中的 部位起反應後，所得質量可通過已知技術檢查，這隨所連接的標記的性質而變化。在體內 診斷或成像應用中，可製備抗體或其神經元結合片段，並用酶、特異性結合配偶體、配體、染 料、螢光標籤和/或放射性元素標記所述抗體或其神經元結合片段，然後可引入動物中。在 標記材料或其結合配偶體有機會與動物內的部位起反應後，可通過已知技術檢查動物，這 隨所連接的標記的性質而變化。在本發明的診斷效用的方面，本發明的抗體或其活性片段 可用於測定和方法中以表徵腦缺血或中風。具體而言，在其中疑似腦缺血或中風或有腦缺 血或中風風險的情況下，本發明的抗體可用於確定或評價腦缺血和或/中風。
[0041] 放射性標記的特異性結合成員，特別是抗體及其片段，可用於體外診斷技術和體 內放射性成像技術。在本發明的又一個方面，放射性標記的特異性結合成員，特別是抗體及 其片段，特別是放射性免疫綴合物，可用於放射性免疫療法，特別作為用於神經損傷修復、 神經再生、神經變性恢復、癌症或CNS腫瘤療法的放射性標記的抗體，或在某些情況下備選 地用於受損害神經組織或神經元的切除。在體內方面，抗體或其神經元結合片段是標記的， 並在手術或手術技術（包括立體定向術或最小侵入性技術）之前、期間或之後施用於動物， 用於定位神經損傷或評價其餘受損害或受損傷的神經組織的目的。在一個此類方面，放射 性標記的特異性結合成員，特別是抗體及其片段，可用於放射免疫導向手術技術，其中它們 可在靶向、鑑定或除去此類細胞的手術之前、期間或之後，鑑定和表明受損、受損害、受損傷 或瀕死神經細胞或神經元或神經組織的存在情況和/或位置。
[0042] 免疫綴合物或抗體融合蛋白包括在本發明中，其中本發明的特異性結合成員，特 別是抗體及其片段，與其他分子或藥劑綴合或連接，其進一步包括但不限於與神經活性藥 物、化學消融劑、毒素、免疫調節劑、細胞因子、細胞毒性劑、化療劑或藥物綴合的結合成員。 [0043] 本發明包括可以試驗試劑盒的形式製備的測定系統，其用於定量分析例如受損 害、受損或受損傷神經元的存在程度或定量測定樣品中的神經元。系統或試驗試劑盒可包 括通過本文所述的放射性技術和/或酶技術之一，使標記與抗體偶聯而製備的標記組分， 以及一種或多種其他的免疫化學試劑，任選其中至少一種是游離或固定的組分或其結合配 偶體。
[0044] 可在藥物組合物中製備本發明的抗體，且在一個具體的實施方案中為包含本文圖 5和圖6提供的重鏈和/或輕鏈序列的重組抗體，或其活性片段和來源於其中、特別包含圖 5和圖6所述CDR區序列的單鏈、重組或合成抗體，所述藥物組合物包括合適的媒介物、載 體或稀釋劑，用於在其中療法是適宜的情況下施用，以例如治療或減輕涉及神經元受損、損 害、損傷或死亡的病況或疾病。此類藥物組合物還可包括通過本領域已知方法（諸如聚乙 二醇化）調節抗體或片段的半衰期的方法。此類藥物組合物還可包含其他抗體或治療劑。
[0045] 本發明還包括與其他分子或藥劑共價連接或以其他方式結合的抗體及其片段。 這些其他分子或藥劑包括但不限於具有截然不同的識別特徵的分子（包括抗體或抗體片 段）、毒素、配體、神經活性劑和化療劑。在另一個方面，本發明的抗體或片段可用來靶向或 導向治療分子或其他藥劑，例如使分子或藥劑靶向神經元，例如靶向皮質神經元、海馬神經 元、視網膜神經節細胞或小腦顆粒細胞，包括傷口部位、缺血部位、腫瘤部位、炎症區域或神 經變性病灶。本發明的抗體或片段可用於靶向或引導治療性分子或其他藥劑，例如將分子 或藥劑靶向至腦缺血或中風的部位。
[0046] 從接下來的參照下列說明性附圖和隨附權利要求書進行的詳述來看，其他目的和 優勢對本領域技術人員而言將是顯而易見的。
[0047] 附圖簡沭 圖1 :人IgM與多種類型的神經元表面結合。sHIgM42 (A)和rHIgM12 (C)與共表達神 經絲（NF) (B和D)的活的皮質神經元表面結合。在培養基中與10 μ g/ml IgM孵育10分 鍾過程內，將細胞保持在冰上。將細胞固定，洗滌，用抗人μ鏈Fab'2-FITC第二Ab檢測人 IgM。內部NF以特有的節段模式存在。使皮質細胞在聚鳥氨酸包被的蓋玻片上的神經基礎 B27培養基中生長6天。並非所有的皮質神經元均表達NF，但是IgM與培養物中的所有神 經元結合。rHIgM12 (E綠色）和sHIgM42 (F綠色）與共表達神經絲（NF，紅色）的活的小 鼠海馬神經元表面結合。使海馬神經元在聚賴氨酸包被塑料上的神經基礎B27培養基中生 長1周。使自人顳葉切除而分離的細胞在DMEM/F12/N2/B27中生長21天。rHIgM12與也是 β III微管蛋白陽性（F，得自Promega的抗β III)的細胞表面結合（G)。
[0048] 圖2.人IgM以截然不同的模式標記小腦顆粒細胞表面。使在培養1天的大鼠小 腦顆粒細胞與10 Kg/ml人血清來源的IgM、sHIgM12或sHIgM42在培養基中在冰上活著孵 育15分鐘。在用4%低聚甲醛洗滌和固定後，使細胞在室溫下與FITC綴合的抗人μ鏈抗體 一起孵育，並使用免疫螢光顯微鏡成像。使用這兩種抗體的神經元膜標記的模式不同。神 經突膜的短區被sHIgM12結合，導致清楚的點狀模式。神經突膜的較大區被sHIgM42結合， 導致節段模式。放大倍數為400x。
[0049] 圖3.神經元結合性人IgM、rHIgM12和sHIgM42保護培養中的皮質神經元免於過 氧化物誘導的細胞死亡。培養3天的小鼠神經元用含或不含10 Pg/ml人IgM的500 nM H2O2 或鹽水處理30分鐘。細胞用新鮮的神經基礎B27培養基洗滌，24小時後，使用FLICA胱天 蛋白酶-3測定試劑盒（Immunochemistry Technologies 935)，檢測一式三份處理的96孔 中胱天蛋白酶-3的表達。條形柱表示免於胱天蛋白酶3活化的保護％。
[0050] 圖4表示用於產生重組抗體的可擴增載體。這是用於產生基於sHIgM22 (rHIgM22)的重組抗體的載體圖，該載體經修飾以產生重組IgM12和IgM42。對於在CHO細 胞中表達，VH啟動子用ElA啟動子置換。CX輕鏈恆定區用κ輕鏈恆定區C κ置換。
[0051] 圖5表示重組載體中的IgM12抗體胺基酸和核酸序列。重鏈胺基酸序列和編碼核 酸序列呈灰色，提供並標出Vh的每一個和恆定區序列CHl、CH2、CH3和CH4。輕鏈胺基酸序 列和編碼核酸序列呈紫色，標出可變VL和恆定CL (κ)序列。注釋了重鏈和輕鏈可變區的 CDR區序列。在胺基酸和核酸序列中標示了人J鏈。
[0052] 圖6表示重組載體中的IgM42抗體胺基酸和核酸序列。重鏈胺基酸序列和編碼核 酸序列呈灰色，提供並標出Vh的每一個和恆定區序列CHl、CH2、CH3和CH4。輕鏈胺基酸序 列和編碼核酸序列呈紫色，標出了可變VL和恆定CL (κ)序列兩者。注釋了重鏈和輕鏈可 變區的⑶R區序列。
[0053] 圖7.重組rHIgM12改進患TMEV誘導性疾病的小鼠中的缺陷。在100 Pg sHIgM12 的單一 i.p.劑量後3周，平均每小時自發性夜間活動（當小鼠有正常活動性時）改變。在 TMEV感染後90天各組5隻SJL小鼠用rHIgM12 (紅色條形柱）或對照人IgM (黑色條形 柱）治療，在AccuScan活動監測箱中按組每周監測3天。將3個夜間時段內的每小時夜間水 平活動的平均值土 SEM與IgM治療前3個夜晚的夜間活動進行比較。在單劑量的rHIgM12 治療後3周-7周存在與治療前水平相比夜間活動增加（P〈0. 01)，但用對照治療後無增加。 對未感染年齡匹配小鼠的運動水平作圖用於比較（綠色條形柱）。
[0054] 圖8.在小鼠腦幹採集的MRS光譜。上小圖表示從中採集信號的三維像素。定位該 目標區域使用解剖界標。極短MRI掃描用來獲取3個正交平面的圖像以定位腦幹上的2. 5 mm3立方體（上小圖）。小鼠腦幹的300MHz，IH光譜（下小圖）。容易地鑑定出膽鹼（Cho)、 肌酸（Cr)和N-乙醯基-天冬氨酸（NAA)峰。光譜參照水（在4. 7 ppm)。
[0055] 圖9.腦幹NAA水平降低與軸突喪失增加有關。用TMEV感染後0-270天，對10隻 SJL小鼠進行了前瞻性研究。獲得每隻小鼠腦幹的MRS，並測定NAA濃度（上）。在病毒感 染後90天（通過橫切面的直接計數顯示大軸突喪失的點），在達到統計顯著性下降的所有 小鼠中記錄到NAA逐漸降低（2)。在疾病持續期間，NAA水平保持低下。未感染小鼠（黑色 條形柱）、感染後90天（灰色）和270天（白色）以T6水平計數的絕對軸突（下）。
[0056] 圖10.在單劑量的人IgM後腦幹中的NAA。TMEV感染後90天，當NAA水平開始 下降，且可檢測到大軸突喪失時，向各組10-15隻SJL小鼠 i.p.施用單次100 Pg劑量的 SHIgM12、sHIgM42、對照人IgM或鹽水（PBS)。在治療前和治療後5周和10周，收集腦幹的 MRS。由這些光譜計算NAA水平。在sHIgM12和sHIgM42治療組中，與治療前水平相比，NAA 在5周後（P=0. 005, P=O. 029)和在10周（P〈0. 001，P=O. 037)增加。在用對照試劑治療的 各組小鼠中是穩定的或趨於向下。該圖表示腦幹三維像素 NAA水平的平均值+/-SEM。
[0057] 圖11.與神經元結合的人IgM不改變脫髓鞘、髓鞘再生或炎症。各組5隻慢性 TMEV感染小鼠用單次100 Pg劑量的人IgM治療。在治療後10周，所有組包括相同程度的 脊髓炎症（黑色條形柱）和脫髓鞘（紅色條形柱）。如所預期的一樣，用少突膠質細胞結合 性IgM、rHIgM22治療的小鼠，顯示較多髓鞘再生（綠色條形柱）。sHIgM12和sHIgM42不促 進脊髓髓鞘再生。這表明體內有保護軸突的多種方式。
[0058] 圖12.靜脈內注射後⑶-1小鼠循環中的神經元結合性人IgM的血清半衰期。夾 心ELISA用來定量測定48小時內小鼠血清的人μ鏈的衰變。鹼性磷酸酶底物（Sigma 104) 的0D405平均值獲自該方法。繪製每組3隻小鼠的血清和標準誤差。
[0059] 圖13. 35S標記的rHIgMl2進入TMEV感染和未感染SJL小鼠的腦和脊髓。將35S 標記的rHIgM12 i.p.施用於5個月TMEV感染的和年齡匹配的未感染SJL小鼠。4小時後， 一對小鼠用鹽水灌注，急速收穫組織，稱重，用剃刀切碎，並與10 ml閃爍液（Ultima Gold LSC)混合。在24小時時重複相同步驟。48小時後，使組織增溶，將小瓶在Beckman閃爍計 數器中計數1分鐘。對每隻小鼠的全腦和脊髓總計數繪圖。小瓶中無組織的背景計數為12 個計數。
[0060] 圖14.神經元結合性人IgM體內靶向脊髓病變。向患慢性TMEV誘導的脊髓脫髓 鞘的小鼠腹膜內施用1.0 mg sHIgM42 (A)、rHIgM12 (B)或對照人單克隆IgM (C)。4小時 後，小鼠用4%低聚甲醛灌注，取出脊髓，冷凍切片，使用針對人μ鏈的FITC綴合的Fab' 2 片段（Jackson Immnoresearch)免疫標記。來自接受sHIgM42或rHIgM12的小鼠的脊髓在 病變中含有人IgM。病變中幾乎未發現對照人IgM。下小圖為Η/E染色以顯現炎性細胞和 病變。我們得出的結論是，在TMEV模型中某些人IgM可穿過BBB。
[0061] 圖15.神經元結合性人IgM定位於脊髓病變中神經絲+ (NF)軸突。向患慢性 TMEV誘導的脊髓脫髓鞘的小鼠腹膜內施用1.0 mg IgM，4小時後處死。將脊髓縱向冷凍切 片，用FITC綴合的抗人μ鏈Fab' 2片段（綠色）和抗-NF (SMI-32和34,紅色）免疫標 記，接著用TRICT綴合的第二抗體免疫標記。合併的共聚焦圖像證實sHIgM42 (A)與長NF+ 纖維⑶共定位，在（C)中合併。rHIgM12 (D，綠色）也與NF+結構（D，紅色）例如橫切軸 突纖維束共定位。
[0062] 圖16. rHIgM12和sHIgM42不會使EAE臨床評分變差。在每隻小鼠達到1的臨床 評分（尾無力）時，向患MOG肽誘導的EAE的各組10隻C57BL6小鼠 i. V.施用單次100 Pg 劑量的rHIgM12、sHIgM42、對照人IgM或鹽水，且每隔一天進行監測直到免疫後28天。圖 為每個治療組的平均臨床評分的平均值+/-SEM。平均臨床評分的秩的ANOVA (ANOVA on ranks)表明組間無差異（Ρ=0· 14)。
[0063] 圖17. rHIgM12和sHIgM42不加重EAE脊髓病理。在圖13的研究結束時，取出 脊髓，切成I mm塊，從每3個的連續塊中切取橫切面，用erichrome染色以顯現病理。不 知情地對10個橫切面/小鼠（40象限（quadrant))進行分級。炎症（P=O. 825)或脫髓鞘 (Ρ=0· 766)在組間無差異。
[0064] 圖18. rHIgM12促進神經突增生使Ε15海馬神經元在聚-D-賴氨酸（PDL) (A) 或rHIgM12 (B)硝酸纖維素包被的蓋玻片上生長。接種（plating)細胞後12小時,將這些 神經元固定，並用β 3-微管蛋白抗體（Al和B1，綠色）和德克薩斯紅鬼筆環肽（A2和B2) 染色。A3-B3是A1-A2和B1-B2的重疊，其中核用DAPI (藍色）染色。C、D和E顯示總的 (C，p=0. 0056)、最長（D，p〈0. 0001)和次最長（E，p=0. 0782)神經突長度的測量值。與具有 多個對稱神經突的接種在對照PDL基質上神經元相比（72%相對於18%)，在rHIgM12上生長 的神經元帶有較少神經突（F，p〈0. 0001)，且大多數為3期神經元（G)。統計分析顯示平均 值土 SEM (非配對t檢驗）。
[0065] 圖19. rHIgM12驅動軸突形成海馬神經元在接種在TOL (A)、TOL+層粘連蛋白 (B)或rHIgM12 (C)的基質上後12小時用Taul (A1-C1，綠色）或MAP2 (A2-C2,藍色）染 色。A3-C3是Al-Cl和A2-C2的重疊，將F-肌動蛋白（紅色）用德克薩斯紅鬼筆環肽標記。 D-F顯示在通過短劃線標示的Al-Cl中，沿自細胞體到生長錐的最長神經突的相對Taul強 度。Taul染色不對稱地富集在於rHIgM12和層粘連蛋白基質兩者中生長的3期神經元中的 最長神經突遠部。
[0066] 圖20. rHIgM12結合識別神經元膜在固定後，將DIV3海馬神經元用rHIgM12、 霍亂毒素 B (CTB，Alexa Fluor 594)和菲律賓菌素三重染色（A)。rHIgM12 (Al)均勻地 標記神經元表面，其模式類似於分別用CTB或菲律賓菌素標記的GMl (A2)或膽固醇（A3) 的模式。然而，用rHIgM12在37°C下處理30分鐘後，膜結合的rHIgM12在神經元表面聚集 (B1-C1)。用rHIgM12處理導致膽固醇（B2)和GMl (C2)兩者的群聚，其與聚集的rHIgM12 共定位（B3-C3)。B和C底部的下小圖是方框標示區域的更高放大倍數，表明生長錐區中聚 集的rHIgM12 (綠色）與群聚的膽固醇（藍色）或GMl (紅色）共定位。
[0067] 圖21. rHIgM12與神經元膜微結構域中的GMl共定位A. DIVl海馬神經元 首先用4%低聚甲醒固定，然後經rHIgM12染色。rHIgM12標記較小的點結構（punctum structure)。B.將活的DIVl海馬神經元冷卻到4°C達30分鐘，然後用rHIgM12標記，接 著用抗β-III-微管蛋白抗體染色（在固定後）。rHIgM12使神經元表面上大得多的點形 成染色。C.活的DIV3海馬神經元用甲基-β-環糊精在37°C下處理30分鐘以消耗膽固 醇，然後冷卻至4°C。固定的神經元然後用rHIgM12 (綠色）和霍亂毒素 B (紅色）染色。 rHIgM12與較大的點（其與由霍亂毒素 B標記的GMl共定位）結合。下小圖顯示方框標示 區域的更高放大倍數。
[0068] 圖22. rHIgM12與脂筏結合使活的DIV7皮質神經元在4°C下與rHIgM12或對照 IgM抗體結合30分鐘。A.神經元在抗體結合後洗滌3次，在含有0. 5% NP-40的緩衝液中 裂解。裂解物通過在4°C下微量離心分離，上清液和沉澱兩者用抗人IgM第二抗體進行印跡 法。與不與神經元結合併洗掉的對照IgM抗體相比，rHIgM12在沉澱和上清液兩者中均有 分布。下小圖顯示加載等量的蛋白質的各個考馬斯染色凝膠。B.在含有1% Triton X-100 的緩衝液中裂解的神經元在4°C下以蔗糖梯度通過超速離心分級分離。相繼針對rHIgM12、 窖蛋白-1、轉鐵蛋白受體、β3-微管蛋白（B3-Tub)和β-肌動蛋白，用特異性抗體對所得 級分進行印跡法。rHIgM12位於含有窖蛋白-1和β 3-微管蛋白的低密度級分。較高密度 級分含有轉鐵蛋白受體、β 3-微管蛋白和肌動蛋白。一些rHIgM12定位於去汙劑不溶性沉 澱，所述沉澱主要由微管蛋白中富含的細胞骨架蛋白構成。大部分肌動蛋白進入去汙劑可 溶性較高密度級分。
[0069] 圖23. rHIgM12與微管結合A.首先將DIVl海馬神經元在37°C下用rHIgM12處 理30分鐘，然後用含有4%低聚甲醛和0.1% Triton X-IOO的緩衝液同時固定並提取，接著 針對rHIgM12 (綠色）、β3-微管蛋白（藍色）和F-肌動蛋白（紅色）進行染色。rHIgM12 結合去汙劑不溶性分子，所述去汙劑不溶性分子與沿神經突幹（neurite shaft) (A 2和4) 和在生長錐中心域的束狀微管共定位，但不與位於生長錐周圍的F-肌動蛋白共定位（A 3 和4)。B.使DIV7皮質神經元先結合rHIgM12,然後在0. 5% NP-40中裂解。對上清液進行 免疫共沉澱。rHIgM12和β 3-微管蛋白兩者彼此免疫共沉澱。
[0070] 圖24.提出的rHIgM12促進軸突形成的機制Α.神經元膜含有筏微結構域 (raft microdomain)和非後微結構域（nonraft microdomain)兩種。在神經兀膜均勻分布 的筏微結構域分隔成兩個庫。它們之一與微管結合。B. rHIgM12的結合誘導筏微結構域群 聚，這促進了微管穩定並錨定神經元膜。C.在神經突增生期間，通過與rHIgM12相互作用， 生長錐探測環境，而筏微結構域群聚。結果，微管穩定於rHIgM12接觸部位並錨定神經元 膜，這促進圖3和圖6中觀察的生長錐周圍至中心域轉換，其中浸泡施用的（bath-applied) rHIgM12在生長錐中心域聚集。
[0071] 圖25. rHIgM12不與微管蛋白直接結合A. N2A成神經細胞瘤細胞用rHIgM12 (Al,綠色）和β 3-微管蛋白（A2,紅色）染色。核用DAPI (A3,藍色）標記。N2A細胞是 rHIgM12染色陰性的，但表達β3-微管蛋白。Β.將Ν2Α細胞裂解物的上清液與rHIgM12 - 起孵育，與rHIgM12結合的分子被蛋白質-L瓊脂糖拉下（pulled down)，並進行Western印 跡法。rHIgM12不與沉澱結合。β 3-微管蛋白不被rHIgM12拉下，但在上清液中檢測到。
[0072] 圖26. rHIgM12拉下肌動蛋白，但不與F-肌動蛋白共定位A.在固定後，先將 DIVl活的海馬神經元在4°C下用rHIgM12 (A1，綠色）染色，將F-肌動蛋白（A2,紅色）用 德克薩斯紅鬼筆環肽標記。在生長錐區，F-肌動蛋白收縮，且在中心域富集，而rHIgM12使 生長錐表面上點結構均勻染色，這就標記了生長錐的最邊緣。B.少量肌動蛋白被rHIgM12 拉下，3種所測的抗肌動蛋白抗體無一在免疫沉澱反應中起作用。位於與β3-微管蛋白類 似位置的條帶是用空心箭頭標示的IgG重鏈。
[0073] 圖27 (a)細胞膜將在有數千納米孔（大小為200 nm)穿孔的薄金膜上重構。（b) 懸浮金膜與兩側的緩衝溶液接觸。
[0074] 圖28.與神經元結合的人抗體促進神經突延伸。將神經元接種在用人IgM包被 的基質上，使之生長24小時後，用抗神經絲進行免疫標記。與非許可性人IgM (B)相比， sHIgM42誘導增生（A)。
[0075] 圖29.與神經元結合的人抗體使膜結構域群聚。在0°C下進行體細胞（soma)和 軸突上的均勻免疫標記（A)。當細胞升溫至15°C達15分鐘時，sHIgM42定位在軸突細胞表 面上更多的分散斑塊上（B)。
[0076] 圖30.促進神經突延伸的人抗體體內靶向損傷部位。將抗體i.p.施用於患有慢 性SCI的小鼠，4小時後取出脊髓，在脊髓橫切面中檢測人IgM。來自施用抗體的小鼠的脊 髓受損區顯示結合帶螢光標籤的抗人IgM的平行纖維（A)。來自施用對照人IgM的小鼠的 脊髓受損區不含人IgM (B)。
[0077] 圖31.脊髓擠壓傷。顯微照片顯示來自對照小鼠（A)或8 g Fejota夾壓迫後30 天小鼠（B)的H&E染色脊髓的典型外觀。壓傷與廣泛炎性細胞浸潤、運動神經元喪失有關。
[0078] 圖32. TMEV感染小鼠自發性夜間活動的實例。A)在64天時間內水平活動原始完 整記錄。多夜間活動和少晝間活動易於理解。因為小鼠正常在夜間活動，因此我們選擇夜 間活動用於分析（6PM-6AM)。然而，通過目視檢查水平（B)或垂直（C)活動中的未過濾壓縮 記錄，可能難以鑑定真實的長期改變。
[0079] 圖33.單次i. p.劑量的神經元結合抗體（rHIgM12)改善慢性感染SJL小鼠的水 平活動。在90dpi將3組（5隻SJL小鼠）放入AccuScan活動監測箱。在8天時間內收 集基線測量。在治療後，在8周內連接監測小鼠。小圖A、C和E對應於水平活動，B、D和F 對應於垂直活動。A、B)作為每天的箱（bins)提供的平均夜間活動，表明僅在rHIgM12治 療組的水平活動有改善；C)高斯濾波（GB=2天）和E)標準化Z值的6階多項式擬合得出 rHIgM12治療小鼠中清楚明顯的改善。B、D和F)垂直活動不受任何治療影響。活動（垂直 標度）是每小時光束中斷次數。參數GB可解釋為半高時濾波器半寬的值（以天計）。隨著 GB值增加，標準差降低。給出每天的逐點95%置信帶。
[0080] 圖34.通過使用預測模型值在90dpi的3種治療的比較。在治療之前和之後每天 進行統計分析。與對照IgM治療和鹽水治療小鼠相比,在治療後第7天（p=0. 045)和第11 天（p=0. 042)，rHIgM12治療小鼠的水平夜間活動分別顯著偏離/改善（用黑色箭標示）。 給出每天的逐點95%置信帶。
[0081] 圖35.當在疾病早期施用時rHIgM12改善SJL小鼠的水平和垂直兩種活動。在 45dpi將5隻SJL小鼠3組放置在AccuScan活動監測箱中。在8天時間內收集基線測量。 在治療後，在8周內連接監測小鼠。小圖A、C、E和G對應於水平活動，B、D、F和H對應於垂 直活動。A、B)水平和垂直活動的原始未濾過記錄；C、D)作為每天的箱（bins)提供的平均 夜間活動；E、F)高斯濾波（GB=2天）；和G、H)標準化Z值的6階多項式擬合顯示rHIgM12 治療組中水平和垂直兩種活動皆改善。對照IgM治療組和鹽水治療組顯示整個研究中運動 活動水平相似。給出每天的逐點95%置信帶。
[0082] 圖36.通過使用預測模型值在45dpi的3種治療的比較。在治療之前和之後每天 進行統計分析。A、C)與對照IgM治療和鹽水治療小鼠相比，治療後第13天（p=0. 015)和 第9天（p=0. 036)，rHIgM12治療小鼠的水平夜間活動分別顯著偏離。B、D)治療後第14天 (ρ=0· 019)和第6天（ρ=0· 037)，rHIgM12治療小鼠的垂直（直立（rearing))活動分別偏 離/改善。黑色箭頭表示開始顯著改善的日期。給出每天的逐點95%置信帶。
[0083] 圖37.正常未感染SJL小鼠具有不受任何治療影響的高度可變的自發活動。將5 只未感染SJL小鼠3組放入AccuScan活動監測箱。在8天時間內收集基線測量。在治療 後，在8周內連接監測小鼠。任何治療都不引起水平（A、C、E和G)或垂直（B、D、F和H)活 動改變。給出每天的逐點95%置信帶。
[0084] 圖38.單劑量的人抗體延長SODl G86R突變體轉基因小鼠的存活。在55日齡時， 小鼠用單劑量的rHIgM12或PBS治療。一些小鼠則未治療。跟蹤小鼠直到漸死,然後處死用 於病理學。一些小鼠死於疾病。所有小鼠在死亡前都有極度的體重減輕。使用Kaplan-Meir 曲線繪製存活率，使用非參數Mantel-Cox檢驗確定統計顯著性。與PBS治療或未治療小鼠 相比，用rHIgM12治療的小鼠中存活率提高，P=O. 008。所有分析和治療以不知情方式進行， 使得做出處死小鼠決定的研究人員不了解治療組。在該分析中研究了共45隻小鼠。同窩 野生型SOD +/+小鼠具有正常的存活率且無體重減輕（數據未顯示）。
[0085] 圖39表示在50日齡時施用單次200 Pg劑量的rHIgM12的小鼠與施用PBS的對 照小鼠中，G86R SODl小鼠的體重減輕作為時間的函數。施用rHIgM12的小鼠顯示在單次 抗體注射後，在60天時間內較少體重減輕。
[0086] 圖40. SODl G86R突變體轉基因小鼠中單劑量的人抗體減少脊髓軸突變性。在55 日齡時，小鼠用單次250 μ g劑量的rHIgM12或PBS治療。一些小鼠則未治療。在位於胸正 中水平的脊髓中，統計變性軸突特有的髓磷脂螺環（whorl)的數目。與PBS治療（P=O. 003， T檢驗）和未治療小鼠相比，用rHIgM12治療的SODl突變體小鼠的變性軸突數減少。注意， 與SODl+/+突變體小鼠相比，野生型SOD-/-小鼠脊髓中的變性軸突數最少。在處死時，小 鼠用Trump固定液（4%甲醒，0· 1%戊二醒（gluataraldehyde))灌注，將脊髓切成Imm塊。 將塊包埋在Araldite塑料中，將來自T6水平的1微米切片用對苯二胺染色以顯現髓磷脂 環繞（wrapping)。顯示野生型SOD-/-(右上）和SODl+/+突變體（右下）的脊髓切片。 [0087] 圖41.單劑量的人抗體保護SODl G86R突變體轉基因小鼠脊髓中的前角和后角 神經元兩者。在55日齡時，小鼠用rHIgM12或PBS治療。一些小鼠則未治療。在胸正中水 平處脊髓的石蠟切片中，統計用特異性標記神經元的抗NeuN抗體染色的前角和后角細胞 數目。rHIgM12治療小鼠中前角和后角細胞的數目比用PBS治療的小鼠或未治療小鼠顯著 更多（P=O. 0025和P=O. 018,通過T檢驗）。用rHgM12治療的SOD突變體小鼠的前角和後 角細胞的數目與野生型SOD-/-小鼠中觀察到的數目類似。
[0088] 圖42.重組人抗體rHIgM12與各物種的神經元結合。小鼠皮質神經元（A、B、C、 D)、小鼠海馬神經元（E、F)和人皮質神經元（G、H)用rHIgM12 (A、C、E和G)活染，相同細 胞用抗神經絲抗體（B、D)或β微管蛋白（F、G)共標記。rHIgM12用帶螢光標籤的第二抗 體檢測。
[0089] 圖43.⑶-1小鼠中的腦缺血。A.顯示24H時腦缺血區域（高信號區域）的 DWI-MRI圖像掃描。B.腦缺血之後小鼠腦上的缺血性損傷（腦右半球上的灰白圓形區域）。 C.顯示受損組織（黑色突出顯示）的x4 H&E切片。
[0090] 圖44.神經元結合抗體（rHIgM12)的單次i. p.劑量改善經受光血栓形成腦缺血 的CDl小鼠中的水平㈧和垂直⑶活動。小鼠用200 Pg rHIgM12 (n=5)或PBS (n=5) 的單次劑量治療。rHIgM12治療組中的活動從第三天改善。C.在小動物MRI系統中掃描小 鼠，以測量圖中表示為mm 3的腦缺血的總體積。
[0091] 圖45. MT-MRI量度表明改善結果。使小鼠經受腦缺血並用rHIgM12或PBS治療。 缺血性損傷後三天，計算腦的缺血（紅色輪廓）和對側（綠色輪廓）半球的MTR圖（A小 圖）。與用PBS治療的組相比，用rHIgM12治療的組表明中風ROI內MTR的相對增加（小圖 B，藍色條代表在對照側上計算的值）和中風體積的降低（小圖C)。
[0092] 圖46.在聚-D-賴氨酸上生長5天且在缺氧條件（2. 7 % 02，5 % CO2)下孵育 4-44小時的皮層神經元（CN)的Western印跡分析。顯示與對照（44小時，在印跡中孵育0 小時）相比缺氧處理4小時、21小時和44小時之後裂解的胱天蛋白酶-3的水平的代表性 印跡。
[0093] 圖47描繪了顯示來自使用髓鞘標誌物MBP和凋亡標誌物裂解的胱天蛋白酶-3的 三次獨立實驗的Western印跡的定量分析的條形圖。使混合膠質細胞培養物在含有FBS (10 %)的培養基中生長4天，並在具有促進髓鞘再生的IgM rHIgM22、再生的mAb rHIgM12、同種 型對照sHIgM116 (各10 yg/ml)的化學定義的培養基或僅培養基中處理7天。每兩天更 換具有新鮮抗體的培養基。在4天結束時，使用Western印跡評價培養物的MBP或胱天蛋 白酶-3,通過OD/面積定量，並繪圖。
[0094] 圖48提供了顯示各種蛋白和標誌物的水平的代表性Western印跡：少突膠質細 胞祖細胞（OPC)標誌物I3DGFa R、髓鞘標誌物CNPase和M0G、小膠質細胞標誌物⑶68和 Lyn、增殖標誌物Ki-67和組蛋白H3、凋亡標誌物裂解的胱天蛋白酶-3和細胞周期標誌物 pRbS795。將OPC-小膠質細胞共培養物在具有促進髓鞘再生的mAbs A2B5、04、01、78. 09、 94. 03、rHIgM22,再生的 mAb rHIgM12,同種型對照（LEAF、5A5、ChromPure IgM、rHIgM42、 SHIgM14、SHIgM24、sHIgM26)(各10 yg/ml)的星形膠質細胞條件培養基或培養基中培養， 如所示。
[0095] 圖49描繪了顯示來自使用標誌物⑶68 (用於活化的小膠質細胞）和Lyn激酶（小 膠質細胞中的高豐度激酶，在OPC中程度較低，但在星形膠質細胞中不存在）的三次獨立實 驗的Western印跡的定量分析的條形圖。混合培養物（0PC小膠質細胞共培養物）用如上 對於圖48所述的抗體處理並標明。
[0096] 圖50提供了代表性免疫螢光圖像，其顯示在mAb處理之前培養第4天和用 rHIgM12、rHIgM22和同種型對照sHIgM24 (各10 Pg/ml)處理7天之後培養第11天混合 膠質細胞培養物中CD68 (綠色）和核標誌物DAPI (藍色）的水平。
[0097] 圖51提供了顯示缺氧誘導因子1(HIF1 α)、少突膠質細胞標誌物NG2、TOGFa、 〇lig-2、髓鞘標誌物MBP和CNPase、星形膠質細胞標誌物GFAP、小膠質細胞標誌物⑶68、細 胞周期標誌物pRbS795和凋亡標誌物裂解的胱天蛋白酶-3的水平的代表性Western印跡， 其中β肌動蛋白用作上樣對照。使混合膠質細胞培養物在含有FBS (10 %)的培養基中生 長4天，並在缺氧條件（3 % 02)(與常氧條件（21% 02)相比）下在化學定義的培養基中處 理直至額外7天。如所示在第1、3、5和7天通過Western印跡評價蛋白。
[0098] 圖52描繪了圖51的Western印跡的定量分析，以提供蛋白標誌物的表達的定量 值和蛋白標誌物的缺氧和常氧條件的比較。
[0099] 圖53提供了增殖標誌物Ki-67、小膠質細胞標誌物IBA-1、⑶68和iNOS、凋亡標誌 物裂解的胱天蛋白酶-3、星形膠質細胞標誌物GFAP、細胞周期標誌物pRbS795和pRbS80、 少突膠質細胞標誌物H)GF a R、NG2、01ig_l和01ig-2和髓鞘標誌物MBP的代表性Western 印跡。使混合膠質細胞培養物在常氧條件下在含有FBS (10 %)的培養基中生長4天，隨後 在缺氧（3 % 02)下在具有人再生抗體rHIgM12的化學定義的培養基或僅培養基中處理1-7 天。
[0100] 圖54提供了顯示在常氧和缺氧條件下生長且用rHIgM12或rHIgM22抗體處理（相 比於單獨的培養基）的第7天混合培養物中小膠質細胞標誌物IBA-I和CD68、細胞凋亡標 志物裂解的胱天蛋白酶-3、星形膠質細胞標誌物GFAP、少突膠質細胞標誌物TOGF a R、NG2、 01ig-2和髓鞘標誌物MBP和CNPase的水平的代表性Western印跡。將混合膠質細胞如前 所述培養，並在缺氧或常氧條件下在具有rHIgM12、rHIgM22的化學定義的培養基或僅培養 基中處理7天。
[0101] 圖55提供了來自P13的缺氧和常氧C57/B16新生小鼠的皮層的各種標誌物的 RT-PCR分析。C57/B16新生小鼠通過CDl母獸（dams)交叉培育，並從P3至P7暴露於缺氧 (10% 02) 4天。隨後將小鼠暴露於室內空氣，持續額外6天，並在P13處死。從兩個處理組的 皮層中分離RNA，並探測髓鞘標誌物PLP1、MOG、MBP1、少突膠質細胞祖細胞標誌物TOGF a R 和Olig-I、星形膠質細胞標誌物GFAP、神經元標誌物巢蛋白和β 3-微管蛋白、缺氧誘導因 子Ia和肌長蛋白蛋白SSPN。表達水平通過RT-PCR分析，並將結果針對β肌動蛋白的水 平均一化。
[0102] 圖56提供了表明如各小圖中所注來自對照（假操作）和中風小鼠（孟加拉玫瑰紅 方案）的各種組織中放射性標記的rIgM12抗體（如所示通過放射性測量為cpm/?θθμ?)的 量的圖。在中風後30至40 min，將500 ul體積鹽水中10百萬cpm的35S標記的rHIgM12(約 60 ug IgM)腹膜內施用於每隻小鼠。在IgM處理後6、12和24小時，從小鼠收集血液，用 30 ml生理鹽水洗滌脈管系統，並快速收集組織。對於中風組織中放射性標記的分析，將含 有病變區域的腦右前皮質去除，作為75 mg組織塊（在小圖中表示為腦）。去除一部分其他 組織，稱重並處理。CB=小腦，cord=脊髓。
[0103] 發明詳沭 根據本發明，可採用本領域技術人員所掌握的常規分子生物學、 微生物學和重組DNA技術。此類技術在文獻中有完整解釋。參見例如
【權利要求】
1. 分離的人IgM抗體或其片段，其特異性地結合神經元並保護神經元免於細胞死亡， 並且其不促進髓鞘再生，其中所述抗體或片段包含下列序列： (a) 如圖5中所示的可變重鏈胺基酸⑶R結構域序列CDRI GGSVSLYY (SEO iD N0.3〗} 、CDR2GYIYSSGST(SEQ ? NO:32:和 CDR3.ARSASIRSWro (SEQID 嶋:33：,及輕鏈 CDR 序列 CDRi QSISSY {SEQ !0N0; 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO:35) CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO:36) ； ^ (b) 如圖6中所示的可變重鏈胺基酸CDR結構域序列CDR! GRfSTYA {SEO ID NO: 37} 、001?2_00^11味0 0?:38:'和〇^3￥1^50?0剛539細:既0?嶋:39),及輕鏈〇)1?序列 CDF? QGIG (SEQ ID NO: ?)、CDR2 HS (SEO ID N0:41}和 C0R3 QKYNSAPRT (SEO ID NO: 42), 其用於治療或減輕腦缺血或中風，改善中風或腦缺血之後動物中的神經功能，或保護 神經元或神經細胞免於中風或腦缺血之後的損害或細胞死亡。
2. 權利要求1的分離的抗體，其包含SEQ ID NO: 1中所示的可變重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO: 11中所示的可變輕鏈胺基酸序列或包含SEQ ID NO: 17中所示的可變重鏈胺基酸序 列和SEQ ID N0:27中所示的可變輕鏈胺基酸序列，或者其高度同源的變體，其中所述變體 保持神經元結合和神經保護或神經再生活性。
3. 權利要求1的分離的抗體，其是重組抗體rHIgM42並包含如圖6中所示的SEQ ID NO: 17中所示的可變重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO:27中所示的可變輕鏈胺基酸序列。
4. 權利要求1的分離的抗體，其進一步包含人J鏈序列。
5. 權利要求4的抗體，其中所述J鏈包含SEQ ID NO: 15中所示的胺基酸序列。
6. 權利要求4或5的抗體，其是重組抗體rHIgM12並包含SEQ ID NO: 1中所示的可變 重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO: 11中所示的可變輕鏈胺基酸序列。
7. 權利要求5的分離的抗體或片段，其是包含重鏈和輕鏈可變區的完全人抗體或其抗 體片段，或者其高度同源的變體，所述重鏈和輕鏈可變區含有選自胺基酸序列SEQ ID N0:1 和11的胺基酸序列，其中所述變體保持神經元結合和神經保護或神經再生活性。
8. 權利要求1-7中任一項的分離的抗體或其片段，其用於中風、創傷性腦損傷（TBI)、 腦缺血或其中對腦或腦細胞或神經細胞存在血流或氧不足的其他病況。
9. 權利要求1的分離的抗體，其配製用於治療或減輕中風或腦缺血，並組合有一種或 多種作為溶栓劑、抗血小板藥、抗高血壓藥或他汀類藥物的藥劑。
10. 權利要求1-7中任一項的抗體，其標記有可檢測標記或功能標記。
11. 權利要求10的抗體，其中所述標記是酶、特異性結合配偶體、配體、染料、螢光標籤 和/或放射性元素。
12. 分離的核酸，其包含編碼權利要求1-7中任一項的抗體或片段的序列。
13. 製備權利要求1-7中任一項限定的抗體或片段的方法，其包括在引起所述抗體或 片段表達的條件下表達權利要求12的核酸，和回收所述抗體或片段。
14. 用於治療或減輕中風或腦缺血的藥物組合物，其包含權利要求1-7中任一項限定 的抗體或片段和藥學上可接受的媒介物、載體或稀釋劑。
15. 用於治療或減輕動物中的中風或腦缺血的試劑盒，其包含權利要求14的藥物組合 物的藥物劑型和含有一種或多種另外的神經活性劑或治療劑、溶栓劑、抗高血壓劑、抗血小 板劑、抗炎劑、神經遞質釋放調節劑、神經受體配體或激動劑或拮抗劑、鈣通道藥劑、免疫調 節劑、或其他CNS反應性抗體的單獨的藥物劑型。
16. 用於治療或減輕動物中的中風或腦缺血的方法，其包括向疑似或確定患有中風或 腦缺血的動物施用有效量的權利要求14的藥物組合物。
17. 權利要求16的方法，其中所述組合物作為單一劑量施用於所述疑似或確定患有中 風或腦缺血的動物。
18. 用於檢測患有或疑似患有中風或腦缺血的哺乳動物的神經損傷、死亡或損害的存 在情況或程度的方法，其包括： A. 將來自其中懷疑中風或腦缺血的哺乳動物的生物樣品與權利要求1-7中任一項的 抗體或片段在允許所述抗體或片段與所述樣品中的神經元結合發生的條件下接觸；和 B. 檢測來自所述樣品的所述神經元與抗體間是否已發生結合或者測定來自所述樣品 的所述神經元與抗體已發生結合的量； 其中檢測到結合表明在所述樣品中存在神經細胞損傷、死亡或損害，且結合的量表明 神經細胞損傷、死亡或損害的相對量。
【文檔編號】A61K39/395GK104379167SQ201380027368
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年4月17日 優先權日:2012年4月17日
【發明者】M.羅德裡格斯, A.E.沃林頓, L.R.皮斯 申請人:梅奧醫學教育和研究基金會