一種將粒毛盤菌胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法
2023-06-30 18:30:41
專利名稱：一種將粒毛盤菌胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法
技術領域：
本發明屬於黑色素溶解度改性方法技術領域，具體涉及將粒毛盤菌(Iachnum)胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法。
背景技術：
黑色素作為一類廣泛存在於自然界中的色素,是目前已知生物色素中來源較廣泛的色素之一，主要產生於動植物和微生物的進化過程中，是通過多羥基酚氧化而成的構造不規則的類多酚聚合體。根據結構上的差異，可分為真黑色素(eumelanins)、棕黑色素 (phaeomelanins)以及異黑色素(allomelanins)三種類型。黑色素的性質比較穩定。據《細胞微生物學》(CellularMirobiology，2003, 5，167-223)介紹，黑色素常與蛋白質牢固結合，且不溶於水。中國專利號ZL200910145058.4《一種粒毛盤菌及由其液態發酵製備黑色素的方法》公開了本發明人課題組以保藏編號為CCTCC No:M 209193的一株粒毛盤菌(Iachnum)YM-223 (本發明人課題組自定編號代碼)製備黑色素的方法。所製備的黑色素具有較強的抗氧化活性和光保護作用，且經過毒理性試驗證實其安全無毒，同時該粒毛盤菌黑色素在pH彡7時穩定，pH彡6時沉澱，其在(T40°C的水中溶解度為0. 03^0. 12g/100g。由於該該粒毛盤菌黑色素在水中的難溶性使其在醫療、食品等領域的應用受到限制。若能將鹼溶性黑色素改性成水溶性黑色素，以便於人體吸收，可充分發揮其保健功能，具有重大意義。目前，國際上對黑色素進行改性的研究很少。《生物化學與生物物理學》(Archivesofbiochemistry and biophysics, 1984, 2, 157-162)曾報導對以化學方法合成的黑色素進行甲基化修飾，並經紅外光譜和電子自旋共振光譜檢測，結果表明兩者有一定區別，甲基化黑色素具有較多的重氮甲烷成分。除此之外還未見有其他黑色素改性的報導，且至今尚未見到有關真菌黑色素改性或將不溶於水的黑色素通過改性獲得水溶性黑色素方面研究的報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種將保藏號為CCTCCNo:M 209193的粒毛盤菌(Iachnum)的胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法，以克服現有技術的上述缺陷。本發明將粒毛盤菌胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法，其特徵在於將保藏號為CCTCC No:M 209193的粒毛盤菌(Iachnum)發酵後提取純化製得的胞外黑色素，與精氨酸或組氨酸或賴氨酸，和水，按質量比為1:0. 5^1. 5:4. 5^50的比例混合,震蕩至黑色素固體溶解後，將該溶液乾燥，即得到水溶性粒毛盤菌黑色素。所述乾燥可選用冷凍乾燥、常溫乾燥、真空乾燥或噴霧乾燥。採用本發明上述方法得到的改性粒毛盤菌黑色素，在(T40°C的水中溶解度由原來改性前的0. 03 0. 12g/100g提高到了改性後的3. 85 4. 65g/100g。採用本發明方法可以克服原保藏號為CCTCC No:M 209193的粒毛盤菌(Iachnum)胞外黑色素由於難溶於水而不適合用於製成口服製劑或食品添加劑用於醫療、食品等領域的問題，對於擴展黑色素的應用領域和適用範圍具有積極意義。
圖I為改性前的原粒毛盤菌(Iachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素的紅外光譜圖；圖2為採用本發明方法對粒毛盤菌(Iachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素採用精氨酸進行改性後的黑色素的紅外光譜圖。
具體實施例方式實施例I :
本實施例中所使用的粒毛盤菌胞外黑色素，是根據中國專利號ZL200910145058. 4《一種粒毛盤菌及由其液態發酵製備黑色素的方法》，由保藏號為CCTCC No:M209193的粒毛盤菌(Iachnum) YM-223發酵後提取純化製得的。先將保藏號為CCTCC No:M 209193的粒毛盤菌(lachnum)YM_223純培養物接種於配方為按質量百分比由葡萄糖1%、蛋白質I. 0%、L-酪氨酸0. 03%、K2HPO4O. 1%、CuSO4O. 03%、瓊脂15-20%和蒸餾水IOOOmL組成的，pH 6. 0-7. 0的馬鈴薯葡萄糖培養基的平板上活化，在23°C恆溫培養5天後，取菌齡一致的菌塊接種於裝有50ml配方為按質量百分比由葡萄糖1_4%、蛋白質 0. 5-1. 0%、L-酪氨酸 0. 03-0. 1%, K2HP040. 03-0. 1%、CuS040. 01-0. 05% 和蒸餾水IOOOmL組成的，pH 6. 0-7. 0的粒毛盤菌YM-223馬鈴薯葡萄糖液體培養基的250ml三角瓶中，在25°C、以160r/min搖床培養5天後，得到粒毛盤菌(Iachnum) CCTCC No:M 209193種子液。將該粒毛盤菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193種子液按發酵培養基體積的4%接種於5L自動控制發酵罐，其中的發酵培養基同為上述粒毛盤菌YM-223馬鈴薯葡萄糖液體培養基，裝液量為3L，通氣量為2L/min，在28°C、以180r/min的轉速培養10天後，抽濾2次，所得到的濾液即為發酵液。將發酵液按體積比I: I與2mol/L的氫氧化鈉溶液混合成為浸提液，靜置12小時，用lmol/L鹽酸甲醇調節pH值至2 3，靜置12小時，將所得到的黑色素懸浮液置於高速離心機中，5，000r/min離心IOmin,所得沉澱經去離子水洗漆至pH值為7後，用真空冷凍乾燥機在_42'45°C溫度、5 13Pa壓力條件下真空冷凍乾燥後，得到黑色素粗提物。再按該黑色素粗提物的質量(g)與濃度為6mol/L鹽酸溶液的體積(ml)比為I ::40，在80°C水浴酸解4小時後，所得沉澱用去離子水洗滌至pH值為7後，置於高速離心機中，以5，000r/min離心15min，將沉澱按質量(g)與濃度為2mol/L的氨水溶液的體積(ml)比為1:10溶於氨水溶液中，採用旋轉蒸發儀蒸去氨氣至溶液pH值為7，將所得溶液先與石油醚按體積比1:1萃取3次，再與氯仿按體積比1:1萃取3次，最後與乙酸乙酯按體積比1:1萃取3次，所得萃取液用2mol/L鹽酸甲醇溶解調至pH值為2，用高速離心機以5，000r/min離心lOmin，棄上清液，所得沉澱經去離子水反覆洗滌至pH值為7後，用真空冷凍乾燥機在-42'45°C溫度、5 13Pa壓力條件下真空冷凍乾燥後，即得到粒毛盤菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193胞外黑色素。分別取Ig粒毛盤菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193胞外黑色素，分別加入0. 5g的
下列胺基酸天門冬氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、色氨酸和甘氨酸，其中一份作為對照不加入胺基酸，再分別加入IOOmL蒸餾水中，在40°C震蕩30min。採取5000r/min離心IOmin後收集上清液，測其在波長OD5tltl下的分光光度值，光度值越高表明溶解效果越好。結果表明採用不同胺基酸改性修飾後的黑色素的溶解度相差較大，其中以精氨酸改性修飾的黑色素吸光度最大，OD500為0. 357 ;而以賴氨酸和組氨酸改性修飾的黑色素OD5tltl分別為0. 137和0. 106，其溶解效果次於以精氨酸改性修飾的黑色素；而以天門冬氨酸、蘇氨酸、色氨酸和甘氨酸修飾的黑色素的溶解效果較差，其OD5tltl均低於0. 05。分別取Ig粒毛盤菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193胞外黑色素，分別加入0. 25g、0. 5g、0. 75g、l. 0g、l. 25g和I. 5g精氨酸，再分別溶於IOOmL蒸餾水中，後續實驗步驟同上。結果表明當精氨酸加入量增加時其改性黑色素溶解量增大，且當精氨酸添加量為I. Og時，其改性黑色素可完全溶解，OD值達最大，繼續加大精氨酸量，則OD值不再增加。故選擇最佳精氨酸改性修飾黑色素的質量比為黑色素精氨酸為1:1。取IOg粒毛盤菌(Iachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素於三角瓶中，加入IOg精氨酸及IOOmL蒸餾水，在40°C震蕩至黑色素溶解，用真空冷凍乾燥機在-42 _45°C溫度、5 13Pa壓力條件下真空冷凍乾燥後，即得到精氨酸修飾的粒毛盤菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193胞外精氨酸黑色素(以下簡稱為精氨酸黑色素)。對其進行復溶實驗，結果表明精氨酸黑色素復溶效果較好，在40°C水中的溶解度為4. 65g/100g，在0°C水中的溶解度為 4. 38g/100g。分別將採用上述方法改性後的與改性前的2mg粒毛盤菌(lachnum) CCTCCNo:M209193胞外黑色素，分別與400mg乾燥的KBr混勻壓片，採用FT-IR6700傅立葉變換紅外光譜儀於^OO^OOcnT1區間進行紅外光譜測定。圖I為改性前原粒毛盤菌(Iachnum)CCTCC No:M 209193胞外黑色素的紅外光譜圖，圖2為採用本發明方法對粒毛盤菌(lachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素採用精氨酸進行改性修飾後的黑色素的紅外光譜圖。對比分析這兩個紅外光譜圖的結果表明，改性前後的粒毛盤菌(lachnum)CCTCCNo:M 209193胞外黑色素均具有真菌黑色素具有的特徵吸收峰，即3218cm—1和1614cm—1處的C=O和-O(N)H基團特徵吸收峰，除具有相似的O-H伸縮振動(3218. 802cm^)和脂肪族C-H的伸縮振動(2923. 404CHT1和2811. 457cm—1)外，精氨酸黑色素還具有醯胺C=O收縮振動(1672. 346cm-1 和 1637. 679cm_l)、和醯胺 C-N 伸縮振動(1359. 614cm-1 和 1328. 842cm_l)特徵吸收峰，這是由於精氨酸與黑色素結合後，精氨酸的胍基與黑色素的羰基反應形成了醯胺。該結果表明精氨酸對粒毛盤菌(Iachnum)CCTCC No:M 209193胞外黑色素改性成功。準確稱量L OOOg粒毛盤菌(lachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素，加入ImLlmol L^1NH3 H2O搖勻後，加水定容於IOOmL的容量瓶中，取ImL色素溶液稀釋一定倍數，在212nm波長下測得吸光度值K。計算得其色價Ewlcm為221. 0 ;準確稱量I. OOOg改性後的粒毛盤菌(Iachnum)CCTCC No:M 209193胞外精氨酸黑色素，加水定容於IOOmL的容量瓶中，取ImL色素溶液稀釋一定倍數，在202nm波長下測得吸光度值A2。根據公式計算色價
AU
C = ，其中A為吸光度值，B為稀釋倍數，M為色素質量。測得其色價E15tlcmS 194. 6。兩
者相比，其中改性後的粒毛盤菌(Iachnum)CCTCC No:M 209193胞外精氨酸黑色素的色價略低，但仍為桂花種子黑色素色價(El%lcmlmax=60. 24)(據《Food Science and Technology》(食品科學與技術，2006，39:496-502)報導)的3. 23倍(色價高更有利於工業生產)。
實施例2:取實驗室中原先保留下來的由他人按中國專利號為ZL200910145058. 4的專利《一種粒毛盤菌及由其液態發酵製備黑色素的方法》中所述的方法製備獲得的粒毛盤菌(lachnum) CCTCCNo:M 209193胞外黑色素IOg於三角瓶中，加入IOg賴氨酸及IOOmL蒸餾水，震蕩至使黑色素溶解後，將該溶液在_42'45°C、壓力為5 13Pa的條件下真空冷凍乾燥後，即得到以賴氨酸改性修飾的粒毛盤菌(lachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素(以下簡稱為賴氨酸黑色素)。按實施例I中所述方法對賴氨酸黑色素的溶解度及色價進行測定，測得其在40°C的水中溶解度為4. 23g/100g，在(TC的水中溶解度為3. 94g/100g，略低於實施例I中製備的精氨酸黑色素。並測得賴氨酸黑色素的色價E15tlcm等於192. 7，與精氨酸黑色素相當。
實施例3:將IOg粒毛盤菌(lachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素置於三角瓶中，加入IOg組氨酸及IOOmL蒸餾水，攪拌後放置至黑色素溶解，將該溶液在_42'45°C、5 13Pa的條件下真空冷凍乾燥後，即得到以組氨酸改性修飾的粒毛盤菌(lachnum) CCTCC No:M209193胞外黑色素(以下簡稱為組氨酸黑色素)。按實施例I的方法對組氨酸黑色素的溶解度及色價進行測定，測得其在40°C的水中溶解度為3. 97g/100g,在0°C的水中溶解度為3. 85g/100g,略低於實施例I中製備的精氨酸黑色素，與實施例2中製備的組氨酸黑色素相當。並測得該組氨酸黑色素的色價E15tlran等於203. 3，略高於精氨酸黑色素與賴氨酸黑色素。在保持上述實施例1、2及3中其他條件不變的情況下，將粒毛盤菌胞外黑色素純品與精氨酸、賴氨酸或組氨酸的比例擴大到1:0. 5^1:1. 5，所得到的精氨酸黑色素、賴氨酸黑色素及組氨酸黑色素的溶解度與原實施例1、2及3中製備的精氨酸黑色素、賴氨酸黑色素及組氨酸黑色素的溶解度相同，並未發生改變。在保持上述實施例1、2及3中其他條件不變的情況下，將粒毛盤菌胞外黑色素純品與水的比例擴大到1:4. 5 1:50，所得精氨酸黑色素、賴氨酸黑色素及組氨酸黑色素的溶解度與原實施例1、2及3中相同，並未發生改變。在保持上述實施例1、2及3中其他條件不變的情況下，分別採用常溫乾燥、真空乾燥或噴霧乾燥的方法，所得到的精氨酸黑色素、賴氨酸黑色素及組氨酸黑色素的溶解度相同，並未發生改變。
權利要求
1.一種將粒毛盤菌胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法，其特徵在於將保藏號為CCTCCNo:M 209193的粒毛盤菌(Iachnum)發酵後提取純化製得的胞外黑色素，與精氨酸或組氨酸或賴氨酸，和水，按質量比為1:0. 5^1. 5:4. 5^50的比例混合,震蕩至黑色素固體溶解後，將該溶液乾燥，即得到水溶性粒毛盤菌黑色素。
2.如權利要求I所述將粒毛盤菌胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法，特徵在於所述乾燥選用冷凍乾燥、常溫乾燥、真空乾燥或噴霧乾燥。
全文摘要
本發明公開了一種將粒毛盤菌胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法，特徵是將保藏號為CCTCCNo:M 209193的粒毛盤菌(lachnum)發酵後提取純化製得的胞外黑色素，與精氨酸或組氨酸或賴氨酸，和水，按質量比為1:0.5~1.5:4.5~50混合，震蕩至黑色素固體溶解後，將該溶液乾燥，即得到水溶性粒毛盤菌黑色素。採用本發明方法改性後的粒毛盤菌胞外黑色素在0~40℃水中的溶解度提高到了3.85~4.65g/100g。採用本發明方法可以克服原粒毛盤菌胞外黑色素因難溶於水而不適合用於口服製劑或食品添加劑的問題，對於擴展黑色素的應用範圍具有積極意義。
文檔編號C09B61/00GK102746705SQ20121021840
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月28日 優先權日2012年6月28日
發明者盧瑩, 葉子揚, 葉明 , 郭賡藝 申請人:合肥工業大學