一種電極陣列微晶片傳感器、其製備方法及應用的製作方法
2023-06-30 08:14:41 2
專利名稱：一種電極陣列微晶片傳感器、其製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及電極陣列微晶片傳感器領域。具體的說，本發明設計了一種集成三電極體系的多通道陣列微晶片傳感器。本發明還提供了該微晶片傳感器的製備方法與應用。
背景技術：
微型化、集成化、智能化與高通量已成為生物/化學分析領域的重要研究方向。他們以其鮮明的優點已經在疾病診斷與預測、藥物篩選、基因表達譜分析、新基因的發現、基因突變檢測及基因測序等領域獲得了引人注目的成就，包括從學術研究到商業應用等領域都得到了全方位的發展。將分析檢測系統微型化後集成到一塊微小晶片上，可以實現樣品需要量少、檢測時間短、靈敏度高、檢測下限低、多通道、高通量檢測等諸多特點。這種分析晶片在微小空間內可集成了大量的測試單元，將微晶片與相關的測試技術及數據處理軟體相結合，將可進一步實現原位、在線的微全分析系統，給傳統生物分析和臨床檢測帶來根本變革。
MEMS(微電子機械加工技術)在製作不同的微型化分析裝置方面扮演了一個重要的角色。MEMS工藝加工的陣列電極晶片被廣泛應用於電化學生物傳感器、電子舌或電子鼻、毛細管電泳及高效液相色譜的檢測器等等。特別是陣列蛋白質晶片與電化學檢測技術相結合在檢測疾病相關標誌物方面有重要的潛能。
綜合專利檢索及文獻查新，現在大部分的多通道電化學陣列晶片只是工作電極陣列的形式，很少有集成三電極體系的。以「electrodes array」問關鍵詞對美國專利進行檢索，查到7篇相關專利。其中專利(860329，Electrochemicalsensor/detector system and method和576289，Electrochemical sensor/detector systemand method)分別提出了一種基於微電極陣列的電化學檢測系統；專利(869102，Electrode array for development and testing of materials和681285，Method of usingan array of electrodes for high throughput development and testing of materials)分別介紹了一種用於原材料檢測的電極陣列；專利(485201，Sensor array for detectingelectrical characteristics of fluids)公開了一種用於檢測流體導電特徵分布的傳感器陣列；上述專利只是實現了檢測體系的多通道，並未實現工作電極陣列與參比電極及對電極的集成。而在專利(492369，Unitary multiple electrode sensor和541566，Unitary multiple electrode sensor)中則分別公開了一種用於檢測血液、血液組分樣品或其它測試樣品分析的多電極傳感器，然而其中單通道的三電極體系是孤立分布在不同的樣品井中的，還不具備多通道傳感器的特徵。
以「電極陣列」或「電極晶片」為關鍵詞對中國專利進行檢索，共檢索到6篇相關專利。其中專利(01136952，電極陣列型基因晶片及其製作方法)公開了一種電極陣列型基因晶片及其製作方法，屬於生命科學領域，涉及一種具有對基因進行檢測、識別、鑑定、診斷功能的器件。該基因晶片選用金絲或表面鍍金的金屬絲作為電極，電極排成陣列並固定在晶片基底上，電極的一端用作探針的探頭，部分或全部探頭表面生長並固化有探測基因，電極的另一端用作引腳；專利(03129410，微電極陣列晶片傳感器)提供了一種矽基表面的微電極陣列晶片傳感器，該微電極陣列由叉指狀微電極組成；專利(03159801，多電極陣列及其製造方法和03252672，一種多電極陣列)涉及多電極陣列技術，特別是一種多電極陣列結構。該多電極陣列由微孔陣列、單電極和固定樹脂組成，其單電極為直角形，置於微孔陣列的垂直孔中，單電極的尾部較頭部長，水平延伸，單電極的頭部呈尖狀，伸出微孔陣列的垂直孔，在單電極的部分水平尾部與微孔陣列的上表面上方有固定樹脂；專利(98811070，毫微電極陣列和200530002301，電極陣列傳感器)所述的電極陣列傳感器也都僅僅是工作電極的陣列化，並未實現與參比電極及對電極的集成化。另外，據文獻追新檢索，目前只有美國Michael S.Wilson小組於2006年4月(Michael S.Wilson and Weiyan Nie，Analytical Chemistry2006，78(8)，2507-2513)提出過基於玻璃基底集成三電極體系的免疫蛋白質晶片。但是，此處免疫蛋白質晶片的電解池是通過粘合矽墊圈粘結聚碳酸酯井形成的，體積(0.5-1.5mL)比較大，同時又由於未在玻璃基底表面實現微加工，因此並未實現整個檢測體系的微型化。
目前，蛋白質免疫微晶片的檢測方法主要還是放射免疫、酶連免疫或化學發光檢測，這幾種方法都需對反應物先行進行標記，然後才能進行免疫反應的檢測。而標記過程的存在極易給檢測體系帶來幹擾，使體系目標物的測定準確性產生誤差，產生的幹擾信號還會影響測定的特異性；並且標記過程的存在還進一步增加了檢測成本。
從以上分析可以看出，現階段電化學免疫蛋白質晶片雖然已經突破了單通道的局限，但在集成化與微型化方面仍有待進一步發展，使電化學檢測在免疫蛋白質晶片中的優勢得到充分發揮。
發明內容
本發明的一個目的是提供了一種電極陣列微晶片傳感器，以期實現檢測體系的微型化、集成化與智能化。
本發明的另一個目的是提供了上述微晶片傳感器的製備方法。
本發明的另一個目的是提供了上述微晶片傳感器的應用，即將微晶片傳感器與控制儀器相連，通過一定的操作，實現對環境樣品的分析檢測。
本發明提供了一種電極陣列微晶片傳感器，它由電極陣列微晶片和檢測池組成，電極陣列微晶片是由工作電極陣列、對電極及參比電極組成，工作電極陣列相對平行，陣列中間是對電極，對電極中間是參比電極，工作電極與多通道一一相應，電極的引線引出端分別位於微晶片的四邊，密封電極引線後形成的檢測池位於微晶片表面。
本發明的電極陣列微晶片中，工作電極是圓盤電極，分為兩組，呈軸對稱平行分布在晶片兩側；對電極及參比電極亦呈軸對稱，分別獨立分布在微晶片內側。
本發明中，工作電極的數量可根據實際需要而定，例如為2-10對。
本發明中，作為電極陣列微晶片的基質材料可以是矽、普通玻璃、優質石英以及有機聚合物材料等。在本發明的一個實施例中，採用單晶矽片作為基質。
本發明中，電極陣列微晶片及各電極的尺寸、工作電極的數量均可根據集成度及實際需要確定。在本發明的一個實施例中，製備了一種集成工作電極陣列、對電極及參比電極的電極陣列矽微晶片，工作電極陣列通道數為6通道。
本發明中，電極陣列微晶片與外接控制設備之間通過引線和電極連接。該陣列電極微晶片的電極可採用各種金屬材料製成。在本發明的一個實施例中採用鈦金材料製作工作電極與對電極，採用鈦鎳銀材料製作參比電極基底。引線的引入是利用壓片技術將微晶片壓制到一個設計好的管芯中，從而引出導線。
本發明的電極陣列微晶片中，電極陣列微晶片表面所形成的電解池容積大小為10-50微升。
本發明的電極陣列微晶片中，圓盤工作電極直徑為0.2-2毫米，對電極與參比電極的寬度為0.1-0.5毫米。各電極之間的距離為0.1-1毫米。
本發明的電極陣列微晶片中，各電極與基質材料邊緣的距離為0.5-2毫米。
另一方面，本發明提供了上述電極陣列微晶片傳感器的製備方法，它包括以下步驟1.對基質進行第一次光刻，用脫膜(lift-off)工藝製作工作電極及對電極；2.對基質進行第二次光刻，用脫膜工藝製作參比電極基底；3.對基質劃片，然後將單片微晶片壓片、引線並封裝；4.參比電極製作。
如前所述，作為電極陣列微晶片的基質材料可以是矽、普通玻璃、優質石英以及有機聚合物材料等。在本發明的一個實施例中，採用單晶矽片作為基質。
在單晶矽片上製作電極的方法也有很多，在本發明的一個實施例中，採用蒸鍍的方法。在蒸鍍之前，要先設計製作相應的掩膜。根據實驗要求及單晶矽尺寸進行晶片圖形設計，然後將設計好的圖形分別製作成掩膜板。
上述電極陣列微晶片傳感器的製備方法可按如下步驟具體操作1.單晶矽片的預處理(1)清洗直徑2.5-7.5英寸的單晶矽片表面進行清洗。
(2)氧化生成SiO2絕緣基底氧化爐內，氧氣存在，300-800℃條件下，單晶矽表面熱氧化生成一層約200-700納米厚的SiO2薄層。
2.電極製作(1)工作電極及對電極的製作使用光刻機進行第一次光刻(版圖去掉銀後剩下的圖形)；蒸發臺下依次蒸發Cr或Ti5-20納米，金200-600納米，lift-off，製作出金工作電極陣列及對電極。
(2)參比電極基底的製作第二次光刻(銀的圖形)；依次蒸發Cr5-20納米，Ni5-20納米，Ag300-700納米，lift-off，製作出銀基底電極。
3.使用劃片機對前述單晶矽片進行劃片，然後將單片微晶片室溫下(25±2℃)通過504萬能膠黏合到陶瓷底座上，手動引線儀引線，利用矽橡膠黏合劑室溫下進行微晶片的封裝。矽橡膠黏合劑固化後，微晶片表面即形成10-50微升的電解池。
4.參比電極製作微晶片表面所形成電解池內加入10-50微升的5-50毫摩爾濃度的氯化鉀溶液，以晶片表面銀作為工作電極，外接鉑絲對電極及銀、氯化銀絲參比電極，0.05-0.5V(相對於銀/氯化銀絲電極)下氧化50-300秒(上海辰華儀器公司CHI1030電化學工作站)。
本發明還提供了上述電極陣列微晶片傳感器的應用。即將傳感器與控制設備相連接，對加入微晶片表面電解池內不同的電解質或樣品分別進行分析、檢測。
臨床免疫學檢測是指根據抗原、抗體特異性反應的原理，利用已知的抗體去檢測相應的疾病標誌物抗原，通過檢測結果給臨床診斷提供依據。臨床免疫學檢測自提出到被廣泛應用經過了長期而又紮實的發展，以我國為例，我國臨床免疫學檢測基本經歷了放射免疫檢測(興起於20世紀70年代)；酶聯免疫檢測(興起於20世紀80年代)；以化學發光為代表的光生物學標記免疫檢測技術(20世紀90年代開始推廣使用)三個階段。上述三種免疫檢測方法在目前醫療市場上並存。令人遺憾的是，目前醫院採用的大部分為昂貴的進口設備。經綜合分析，以上三種免疫檢測方法有以下問題需要解決操作複雜，檢測時間長；儀器設備昂貴，檢測成本較高；方法的準確性有待提高，存在假「陽性」；單指標檢測，無法做到多種相關疾病標誌物同時檢測的要求；樣品需要量大，加重病人痛苦。本發明的應用之一就是側重於解決現階段臨床免疫分析所存在的上述問題。
將電極陣列微晶片與CHI1030電化學工作站相連，首先加入聚合單體及待共聚抗體，一定電化學條件下，生成抗體-聚合物膜。然後利用這層抗體-聚合物膜去特異性的檢測樣品中相對應的抗原。其原理是抗體可以以物理包埋及氫鍵等作用力方式與電化學高分子聚合物共聚生成抗體-聚合物膜。然後利用抗原-抗體的特異性反應達到利用抗體-聚合物膜去檢測樣品中相對應的抗原的目的。
具體操作步驟如下首先，生成抗體-聚合物膜。在電極陣列微晶片表面所形成的電解池內加入10-50微升的聚合單體-抗體溶液，將電極陣列微晶片的各引線連接到多通道電化學工作站的對應的工作電極、對電極及參比電極連線埠。一定的電化學條件下生成抗體-聚合物膜。
通過更換前述聚合單體溶液及改變其中所含抗體的種類，可以在同一微晶片傳感器的不同的電極位置固定上不同的抗體，從而製備出多通道的免疫微晶片傳感器。
其次，消除所生成的抗體-聚合物膜的非特異性吸附。在已生成抗體-聚合物膜的微晶片傳感器表面的電解池內加入合適的溶液與抗體-聚合物膜一定溫度下作用一段時間。
最後，樣品的檢測。將待測樣品加入到已消除非特異性吸附的微晶片傳感器表面所形成的電解池內。通過選定的電化學手段對樣品進行檢測分析。
在本發明中，通過MEMS工藝加工的電極陣列微晶片首次實現了集成化多通道電極陣列晶片傳感器的微型化，微晶片表面所形成的電解池體積不大於50微升，微型化的實現同時增加了檢測靈敏度和檢測速度；並且由於MEMS工藝可以實現大批量生產並且生產過程具高度重現性，從而使得陣列電極微晶片傳感器在製作成本大大降低的同時，給實際樣品的檢測提供了可能。在本發明所提供的電極陣列微晶片傳感器的應用中，通過無標記電化學檢測實現了多通道免疫蛋白質晶片對實際血清樣品的檢測，從而避免了標記免疫檢測方法存在的前述問題，進一步提高了免疫檢測的靈敏度和準確性，同時降低了檢測下限。
本發明充分發揮了集成式多通道電極陣列微晶片的優勢，真正實現了檢測體系的微型化、集成化與智能化。本發明的電極陣列微晶片傳感器除了可以應用於臨床免疫分析，還可應用於分析檢測化工、生物、醫藥、環保等行業的樣品，具有高通量、高靈敏度和低檢測限等諸多優點。另外，本發明可以實現工業化批量化生產，相對現有的檢測技術大大降低了檢測成本。因此，本發明在臨床免疫分析及環境樣品檢測等領域將有非常廣闊的應用前景。
圖1為陣列電極微晶片的設計圖。其中1為單晶矽片的SiO2絕緣基底，2為圓盤工作電極，3為參比電極，4為對電極，5為工作電極引線引出端，6為參比電極引線引出端，7為對電極引線引出端。圓盤工作電極直徑為0.2-2毫米，對電極與參比電極的寬度為0.1-0.5毫米。各電極之間的距離為0.1-1毫米，各電極與基質材料邊緣的距離為0.5-2毫米。
圖2為封裝後的晶片示意圖。其中1為單晶矽片的SiO2絕緣基底，2為圓盤工作電極，3為參比電極，4為對電極，5為工作電極引線引出端，6為參比電極引線引出端，7為對電極引線引出端，8為陶瓷底座。
圖3為封裝後的晶片橫截面示意圖。其中8為陶瓷底座，9為封裝後在晶片表面形成的檢測池。電極陣列微晶片傳感器表面所形成的電解池大小為10-50微升。
具體實施例方式
實施例1電極陣列微晶片傳感器的製作1.單晶矽片的預處理(1)清洗直徑2.5-7.5英寸的單晶矽片表面先按照以下過程進行清洗，。1#液(NH3∶H2O2∶H2O＝1∶2∶7)煮沸10分鐘，去離子水衝洗15min；再用2#液(HCl∶H2O2∶H2O＝1∶2∶7)煮沸10分鐘，去離子水衝洗15分鐘，紅外燈下烘乾。
(2)氧化生成SiO2絕緣基底國產氧化爐內，氧氣存在，500℃條件下熱氧化生成一層約500納米厚的SiO2薄層。
2.電極製作(1)工作電極及對電極的製作使用德國卡爾休斯光刻機進行第一次光刻(版圖去掉銀後剩下的圖形)；國產蒸發臺下依次蒸發Cr或Ti10納米，金400納米，lift-off，製作出金工作電極陣列及對電極。其中，圓盤工作電極直徑為1毫米，對電極寬度為200微米，各電極間距離為200微米。
(2)參比電極基底的製作第二次光刻(銀的圖形)；依次蒸發Cr10納米，Ni10納米，Ag500納米，lift-off，製作出銀基底電極。其中，銀電極寬度為200-400微米。
3.使用國產劃片機對前述單晶矽片進行劃片，然後將單片微晶片室溫下通過504萬能膠黏合到陶瓷底座上，國產手動引線儀引線，利用矽橡膠黏合劑室溫下進行微晶片封裝。矽橡膠黏合劑固化後，微晶片表面即形成10-50微升的電解池。
4.參比電極製作微晶片傳感器表面電解池內加入50微升的10毫摩爾濃度的氯化鉀溶液，以晶片表面銀作為工作電極，外接鉑絲對電極及銀、氯化銀絲參比電極，0.1V(相對於銀/氯化銀絲電極)下氧化120秒(CHI1030電化學工作站)。
實施例2用於人血清樣品中多種疾病標誌物的高通量檢測1.多通道電極陣列微晶片傳感器的製作參照實施案例1的方法製作6通道的電極陣列微晶片傳感器。
2.抗體-聚合物膜的生成在微晶片傳感器表面所形成的電解池內加入50微升的10毫摩爾濃度的pH7.0磷酸緩衝溶液，其中含10毫摩爾濃度的鄰苯二胺聚合單體及3微克/毫升的待共聚抗體。將電極陣列微晶片傳感器的各引線連接到多通道電化學工作站的對應的工作電極、對電極及參比電極連線埠。室溫下利用循環伏安法(CV)生成抗體-聚合物膜。實驗條件如下掃描範圍(0-0.8V)，掃描速度(100毫伏/秒)，掃描圈數(2圈)。
通過微晶片傳感器表面衝洗(10毫摩爾濃度的pH7.0磷酸緩衝溶液衝洗3次)、更換前述待聚合溶液(改變所含抗體的種類)及儀器控制，可以在同一微晶片傳感器的不同的電極位置固定上不同的抗體，從而製備出多通道的免疫微晶片傳感器。其中前述所共聚的抗體分別有透明質酸結合蛋白、層粘連蛋白抗體及IV型膠原抗體。
所生成的抗體-聚合物膜為CV，電化學交流阻抗譜，掃描電鏡，共聚焦螢光顯微鏡等表徵手段所證實。
3.抗體-聚合物膜表面非特異性的消除在已生成抗體-聚合物膜的微晶片傳感器表面的電解池內加入10納克/毫升的牛血清白蛋白溶液或稀釋100倍的正常人學清，與微晶片傳感器表面的抗體-聚合物膜在室溫下(25度左右)作用30分鐘。隨後微晶片傳感器表面以10毫摩爾濃度的pH7.0磷酸緩衝溶液衝洗3次。通過上述操作，即可有效消除抗體-聚合物膜的非特異性吸附問題。
該結果為CV所證實。
4.樣品的檢測在已消除非特異性吸附的微晶片傳感器表面加入50微升的1毫摩爾濃度的二茂鐵甲醇探針溶液(內含10毫摩爾濃度pH7.0磷酸緩衝液)，CV法測定各電極的原始響應。實驗參數如下，掃描範圍-0.3至0.5伏；掃描速度100毫伏/秒；掃描圈數1。隨後在探針溶液中加入0.5-1微升待測樣品，室溫下(25度左右)作用30分鐘，再測定各電極的響應。線性工作曲線通過線性標準加入法獲得，實際樣品的濃度可通過標準加入法或直接在工作曲線上擬合得到。測定結果表明，利用多通道電極陣列微晶片傳感器，對標準混合抗原溶液(3種肝纖維化標誌物透明質酸，IV-C膠原，層粘連蛋白)的相對標準誤差為0-13.6％；對實際血清樣品，與利用放免法所得到的結果對照，相對標準偏差為0-19.6％。對同一樣品連續測定5次，相對標準偏差為2.13％。利用多通道陣列電極微晶片傳感器對3種肝纖維化標誌物透明質酸，IV-C膠原，層粘連蛋白的檢測下限分別為1納克/毫升，0.5納克/毫升和1納克/毫升。
以上結果表明，本發明所研製的集成三電極體系的陣列電極微晶片傳感器可以成功的應用於實際樣品的高效、快速檢測。
權利要求
1.一種電極陣列微晶片傳感器，其特徵在於，它由電極陣列微晶片和檢測池組成，電極陣列微晶片是由工作電極陣列、對電極及參比電極組成，工作電極陣列相對平行，陣列中間是對電極，對電極中間是參比電極，工作電極與多通道一一相應，電極的引線引出端分別位於微晶片的四邊，密封電極引線後形成的檢測池位於微晶片表面。
2.如權利要求1所述的傳感器，其特徵在於，工作電極是圓盤電極，分為兩組，呈軸對稱平行分布在晶片兩側；對電極及參比電極亦呈軸對稱，分別獨立分布在微晶片內側。
3.如權利要求2所述的傳感器，其特徵在於，圓盤工作電極直徑為0.2-2毫米。
4.如權利要求2所述的傳感器，其特徵在於，工作電極為2-10對。
5.如權利要求1所述的傳感器，其特徵在於，作為電極陣列微晶片的基質材料是矽、普通玻璃、優質石英或者有機聚合物材料。
6.如權利要求1所述的傳感器，其特徵在於，對電極與參比電極的寬度為0.1-0.5毫米。
7.如權利要求1所述的傳感器，其特徵在於，電極陣列微晶片表面所形成的檢測池容積大小為10-50微升。
8.如權利要求1所述的傳感器，其特徵在於，各電極之間的距離為0.1-1毫米。
9.如權利要求1所述傳感器的製備方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(1)對基質進行第一次光刻，用脫膜工藝製作工作電極及對電極；(2)對基質進行第二次光刻，用脫膜工藝製作參比電極基底；(3)對基質劃片，然後將單片微晶片壓片、引線並封裝；(4)參比電極製作。
10.如權利要求1所述傳感器的應用，其特徵在於，將傳感器與控制設備相連接，對加入微晶片表面檢測池內的電解質或樣品進行分析、檢測。
全文摘要
本發明涉及電極陣列微晶片傳感器領域。具體的說，本發明設計了一種集成三電極體系的多通道陣列微晶片傳感器，它由電極陣列微晶片和檢測池組成；電極陣列微晶片是由工作電極陣列、對電極及參比電極組成。本發明首次實現了集成化多通道電極陣列晶片傳感器的微型化，微晶片表面所形成的電解池體積不大於50微升，微型化的實現增加了檢測靈敏度、準確性和檢測速度；同時降低生產成本和檢測成本。本發明可以應用於化工、生物、醫藥、環保等行業的樣品檢測分析，具有高通量、高靈敏度和低檢測限等諸多優點。
文檔編號G01N33/48GK1865959SQ20061002719
公開日2006年11月22日 申請日期2006年6月1日 優先權日2006年6月1日
發明者孔繼烈, 史綿紅, 餘紹寧, 周佳, 黃宜平 申請人:復旦大學, 上海伍鰲醫學科技有限公司