生產單克隆抗體的方法和組合物的製作方法

2023-07-01 00:29:06

專利名稱：生產單克隆抗體的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明總的來說涉及免疫學。本發明進一步涉及生產單克隆抗體的方法和組合物，和體外生產這種抗體的方法。
背景技術：
將所需試劑導入特異性靶細胞長時間以來對科學家來說已是一種挑戰。試劑特異性靶向的挑戰是使生物靶細胞得到足夠量的試劑或正確試劑，而不使生物其餘部分過多暴露於所述試劑。遞送特異性試劑的非常希望的靶是免疫系統。免疫系統是包括很多具有不同活性的不同類型細胞的複雜的身體反應系統。一部分免疫系統的活化通常由於系統的其他相關部分不需要的活化而引起各種反應。目前，沒有通過靶向免疫系統特異性成分產生特別希望的反應的令人滿意的方法或組合物。
免疫系統是包括各式各樣成分的複雜的身體相互作用系統，所述成分包括細胞和細胞因子，它們與來自身體內部和身體外部的刺激相互作用。除直接作用以外，免疫系統的反應也受到身體其他系統的影響，包括神經、呼吸、循環和消化系統。
免疫系統的一個眾所周知方面是它對侵入生物、體內細胞改變或由接種疫苗呈遞的外來抗原產生反應的能力。對免疫系統的這種活化產生反應的一些第一類型細胞是吞噬細胞和天然殺傷細胞。吞噬細胞除其他細胞外包括單核細胞、巨噬細胞和多形核嗜中性白細胞。這些細胞通常與外來抗原結合，內在化它並常常破壞它。它們也產生介導其他免疫反應的可溶分子，所述免疫反應如炎症反應。天然殺傷細胞可以識別並破壞某些病毒感染的胚胎和腫瘤細胞。免疫反應的其他因子包括補體途徑，它能夠獨立應答外來抗原或與細胞或抗體一起作用。
對於接種很重要的免疫系統的一個方面是免疫系統對特定病原體或外來抗原的特異性反應。反應的一部分包括對於所述外來抗原的「記憶」的確立。第二次接觸後，記憶功能允許對外來抗原產生更快和通常更大的反應。淋巴細胞與其他細胞和因子一起在記憶功能和反應中起著重要作用。
通常，人們認為對抗原的反應包括體液反應和細胞反應。體液免疫反應是由非細胞因子介導的，該因子是由細胞釋放的且發現在血漿或細胞內流體中可能游離或可能不游離。免疫系統體液反應的主要成分是由B淋巴細胞產生的抗體介導的。由細胞相互作用產生細胞介導的免疫反應，所述細胞包括抗原呈遞細胞和B淋巴細胞(B細胞)和T淋巴細胞(T細胞)。
免疫反應能力的最廣泛利用的一個方面是單克隆抗體的生產。20世紀70年代中期單克隆抗體(Mab)技術的來臨提供了有價值的新治療和診斷工具。研究人員和臨床醫師首次可以使用能夠與預定抗原部位結合和具有各種免疫效應功能的無限量均一抗體。目前，生產單克隆抗體的技術是本領域熟知的。
這些單克隆抗體被認為在醫學和診斷學中擁有巨大前景。不幸的是，由於單克隆抗體治療中所固有的問題，基於這些蛋白的治療產品的開發受到了限制。例如，大多數單克隆抗體是從小鼠得到的，且因此，不能很好固定人補體。當用於人時，它們也缺乏其他重要的免疫球蛋白功能特徵。
使用單克隆抗體最大的缺點是非人單克隆抗體當注射給人患者時具有免疫原性的事實。注射外來抗體後，患者增加的免疫反應可能相當強烈。免疫反應導致外來抗體的迅速消除，從而在初步治療後，基本上消除抗體的治療效用。不幸的是，一旦免疫系統對外來抗體起反應而致敏，用相同或不同非人抗體的隨後治療可能無效或甚至危險。
小鼠可以容易地用外來抗原免疫以產生許多高親和力抗體。然而，由於小鼠抗體在人體中的呈遞，鼠抗體導入人將引起人抗小鼠抗體(HAMA)反應的產生。在患者中使用鼠抗體通常限於數天或數周的期限。更長的治療時間段可能引起過敏反應。此外，一旦患者中發展了HAMA，它就常常阻止用於診斷或治療目的的鼠抗體的未來的使用。
為克服HAMA反應的問題，研究人員已嘗試了修飾非人抗體的幾個方法，以使得它們像人的。這些方法包括小鼠/人嵌合、人源化和靈長類動物源化(primatization)。製備更像人抗體的早期工作使用組合兔和人抗體。抗體的蛋白亞單位，兔Fab片段和人Fc片段通過蛋白二硫鍵相連形成新人工蛋白分子或嵌合抗體。
已經使用重組分子生物技術來產生嵌合抗體。使用重組DNA技術構建編碼小鼠抗體可變輕鏈和重鏈結構域和人抗體輕鏈(LC)和重鏈(HC)恆定結構域的DNA序列之間的基因融合，以允許嵌合抗體表達。這些嵌合抗體含有很多非人胺基酸序列並且對人具有免疫原性。暴露於這些嵌合抗體的患者產生人-抗嵌合體抗體(HACA)。HACA針對鼠V區，且還可以針對重組嵌合抗體中存在的新V區/C區(恆定區)接頭。
為了克服嵌合抗體的免疫原性呈現的一些限制，使用分子生物學技術來產生人源化或重構抗體。編碼鼠單克隆抗體的抗原結合部分或互補決定區(CDRs)的DNA序列通過分子學方式嫁接到編碼人抗體重鏈和輕鏈構架的DNA序列上。人源化Mabs比嵌合Mabs含有更大百分比的人抗體序列。包含大約90％人抗體和10％小鼠抗體的最終產物在人抗體上含有小鼠結合部位。為了保留正確的形狀和由此保留對靶抗原的結合親和力，它還含有來自小鼠Mab向人源化Mab構架的某些胺基酸置換。
在實踐中，用鼠CDRs簡單置換人CDRs不足以產生保留原始鼠抗體特異性的有效人源化抗體。有在人可變區中包含少量決定性鼠抗體殘基的另外需求。這些殘基的特性取決於原始鼠抗體和受體人抗體兩者的結構。正是這些鼠抗體殘基的存在有助於在患者中產生HACA反應，從而引起單克隆抗體的迅速清除和過敏反應的擔憂。
將另一個技術，稱作重修表面(resurfacing)技術，用於人源化小鼠抗體。重修表面包括在一種方法中用人抗體表面替換小鼠抗體表面，所述方法比其他人源化技術更快和更有效。這個技術提供了通過僅僅人源化重組體Fv V區表面上可接近的那些胺基酸，使鼠單克隆抗體重設計以類似人抗體的方法。鼠單克隆抗體的重修表面可以維持重構形式的原始小鼠單克隆抗體的抗體親抗原性，因為保留了天然的構架-CDR相互作用。這些抗體也有由於它們的小鼠來源而具有抗原性的問題。
其他技術使用靈長類動物，而不是小鼠的序列來人源化Mabs。這個方法的基本原理稱作靈長類動物源化，是靈長類動物抗體可變區中的大部分序列與人的序列無法區分。治療類風溼性關節炎和嚴重哮喘的靈長類動物源化抗CD4 Mabs正在開發。然而，這些Mabs對於患者的免疫系統仍然是外來蛋白並引起免疫反應。
在避免對外來蛋白的免疫反應的努力中，各種製備僅含有人抗體成分的人Mabs的方法正在開發。一個方法是分離天然產生抗所需抗原的抗體的人B細胞克隆並使其在三體瘤(trioma)細胞培養系統中生長。因為人抗體僅僅抗對宿主是外來的抗原，所以人B細胞無一產生抗人抗原的抗體。因此，這個方法對產生抗人蛋白抗原的Mabs無用。
產生人Mabs的兩個其他方法是噬菌體展示和轉基因小鼠的使用。噬菌體展示技術利用人製備抗任何可能結構的抗體的能力。這個技術使用來自很多個體的抗體基因來產生大的噬菌體抗體文庫，每個噬菌體都在其表面展示功能性抗體可變結構域。從這個文庫，根據它們結合所需抗原的能力選擇單個可變結構域。通過分子生物學技術，將具有所需結合特徵的抗體可變結構域和能最好地滿足潛在人治療產物的恆定結構域組合產生Mab。這個技術仍缺乏抗原特異性。噬菌體文庫無法含有針對任何和所有所需抗原的每個結合區。它還可能含有缺乏特異性的結合區。因此，這個技術可能需要相當大的工程以使抗體親和力增加至有效水平。
轉基因小鼠也用於產生「人」抗體。轉基因小鼠是通過用人免疫球蛋白基因座取代小鼠免疫球蛋白基因座而產生的。這個方法可能提供優於噬菌體展示技術的優點，因為它利用小鼠體內親和力成熟機構。
產生人或人樣Mabs的所有當前技術都不足以提供對所述抗原是抗原特異性的物種特異性抗體。嵌合抗體具有保留鼠抗體特異性和刺激人Fc依賴性補體固定和細胞介導的細胞毒性的優點。然而，這些嵌合抗體的鼠可變區仍可以引起HAMA反應，因此限制了嵌合抗體作為診斷和治療劑的價值。
疫苗可能針對任何外來抗原，無論其來自另一種生物、改變的細胞，還是正常「自身」細胞中誘導的外來屬性。外來抗原的施用途徑可以幫助確定產生的免疫反應類型。例如，將抗原遞送至黏膜表面，如經口接種活脊髓灰質炎病毒，刺激免疫系統以產生黏膜表面的免疫反應。注射抗原到肌肉組織常常促進長效IgG反應的產生。
疫苗通常可以分為兩個類型，全疫苗和亞單位疫苗。全疫苗可以由已被滅活或減毒或殺死的病毒或微生物產生。活減毒疫苗具有模擬足以觸發類似於對野生型生物的反應的免疫反應的自然感染的優點。這種疫苗通常提供高水平的保護，尤其是如果通過自然途徑施用，且一些疫苗可能僅需要一劑即可給予免疫性。一些減毒疫苗的另一個優點是它們提供群體成員間人到人的傳遞。然而，這些優點與幾個缺點相抵。一些減毒疫苗具有有限的保存期限和在熱帶環境中不易貯藏。還有一種可能性，即苗將回復到毒性野生型生物，從而引起有害甚至危及生命的疾病。減毒疫苗的使用在免疫缺陷狀態，如AIDS和妊娠中禁忌。
殺死的疫苗是更安全的，因為它們無法回復毒力。它們在運輸和貯藏過程中通常更穩定並適於在無免疫應答的患者中使用。然而，它們比活減毒疫苗低效，從而通常需要一劑以上。另外，它們不提供群體成員間人到人的傳遞。
亞單位疫苗的生產需要關於疫苗應針對的微生物或細胞的表位的知識。設計亞單位疫苗中的其他考慮是亞單位的大小和亞單位多好地代表了全部微生物菌株或細胞。由於在生產全細菌疫苗中遭遇的問題和與使用它們相關的副作用，開發細菌疫苗的當前焦點已轉變為亞單位疫苗的生產。這種疫苗包括基於Vi莢膜多糖的傷寒疫苗和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的Hib疫苗。
因為與減毒疫苗的使用相關的安全考慮和殺死的疫苗的低功效，本領域需要增強疫苗功效的組合物和方法。本領域還需要增強免疫系統的組合物和方法，它們刺激體液和細胞介導的反應。本領域進一步需要免疫反應的選擇性調節和操縱免疫系統的各種成分以產生所需的反應。另外，對於更迅速的活化反應，需要可以促進和擴大免疫反應的方法和組合物。對用僅一劑就能提供保護的疫苗接種人和動物群體的能力的需要增加。
需要的是將特異性試劑的遞送僅靶向至靶細胞的組合物和方法。這種組合物和方法應該能把治療劑有效遞送至靶細胞。還需要的是在體外和體內系統兩者中都可以使用的組合物和方法。
還有對單克隆抗體的組合物和生產它們的改進方法的普遍需要。有對生產對預定抗原具有親和力的人抗體的方法的具體需要。這些人免疫球蛋白應該以適於治療和診斷製劑的方式容易地和經濟地生產。
發明概述本發明包括製備物種特異性抗原特異性單克隆抗體的組合物和方法，所述單克隆抗體優選IgG單克隆抗體。本發明進一步包括複製免疫系統元件的載體，所述免疫系統元件特別是免疫突觸的抗原呈遞細胞(APC)元件。優選的載體任選包含將負載抗原的II類主要組織相容性(MHC)蛋白、共刺激蛋白B7和結構蛋白胞內粘著蛋白(I-CAM)結合在膠態金屬載體表面上。這種載體複製三維方向(3-Dorientation)的APC(圖3)，從而產生能夠活化CD4+T細胞以使免疫的B細胞抗體反應成熟的合成抗原呈遞細胞(sAPC)。
本發明進一步包括載體，其包括合成的CD4+T細胞(sTc)和合成的生發中心(sGC)。在一個實施方案中，合成的CD4+T細胞包含與CD40配體和細胞因子結合的膠態金屬載體。在另一個實施方案中，合成的生發中心包含與B淋巴細胞刺激物結合的膠態金屬載體；增加B細胞抗體對體外免疫的反應效率和特異性的BlyS和CD30L/受體系統。雖然不希望受任何具體理論的限制，在一個實施方案中，抗原與B細胞生長因子的物理並列通過表面IgM抗原受體提高了人TNF抗原的攝取和誘導更強的B細胞反應。在相同B細胞上並列這些信號進一步提高了體外引起抗原特異性B細胞反應的能力。
本發明包括製備合成的免疫成分元件的方法。在此教導了製備模擬免疫系統成分功能的載體組合物的方法。本發明還包括治療免疫系統相關疾病和病理的方法。接種方法也包括在本發明中。
附圖簡述

圖1提供了免疫突觸的示意圖。
圖2提供了活化的CD4+T細胞引起的初次抗體應答分化的示意圖。
圖3A提供了膠態金合成抗原呈遞細胞的示意圖。圖3B提供了膠態金合成T細胞的示意圖。圖3C提供了膠態金合成生發中心的示意圖。
圖4提供了單一顆粒sAPC不能形成功能性免疫突觸的示意圖。
圖5提供了產生多個顆粒膠態金sAPC的示意圖。
圖6提供了描繪多個細胞因子與相同膠態金顆粒結合的圖。
圖7是靶向巨噬細胞(圖7A)、樹突細胞(圖7B)和B細胞(圖7C)的EGF鏈黴抗生物素蛋白金的一系列照片。
圖8提供了對各種體外刺激起反應的細胞的免疫反應性的圖。
圖9A提供了膠態金顆粒自動裝配到EIA板的固體支持體上的示意圖。1＝EIA板；2＝抗人TNF的鼠Mab；3＝人TNF(藍方框)；4＝與鏈黴抗生物素蛋白TNF結合的32nm膠態金；5＝生物素化的BSA；6＝17nm鏈黴抗生物素蛋白膠態金；7＝生物素化的人IL-6；8＝綴合鹼性磷酸酶的兔抗人IL-6。
圖9B提供了與IL-1或TNF結合的膠態金顆粒自動裝配到四臂PEG-硫醇主鏈的示意圖(Sun Bio，Inc.)。
圖10A提供了圖9A中顆粒產生的免疫反應性信號的圖。
圖10B提供了圖9B中顆粒產生的免疫反應性信號的圖。
圖11提供了膠態金/TNF結合裝置的示意圖。
圖12提供了離子強度對凍幹後的膠態金TNF載體穩定性的作用的圖。
圖13提供了在低離子強度溶液中TNF結合膠態金的模型的示意圖。
圖14提供了在高離子強度溶液中TNF結合膠態金的模型的示意圖。
發明詳述參考在此包括的下列具體實施方案的詳細說明可以更容易理解本發明。儘管已經參考其某些實施方案的詳情描述了本發明，但並不意味應認為這種詳情作為本發明範圍的限制。在此提及的參考文獻全文以其全部內容併入此處作為參考，包括美國臨時申請序號60/526,360。
本發明包括產生抗原特異性、物種特異性IgG單克隆抗體的方法和組合物。本發明包括包含複製抗原呈遞細胞(APC)、T細胞和體液免疫反應生發中心元件的天然存在和/或合成載體的方法和組合物。
本發明包括模擬免疫反應任何元件或階段的載體。免疫反應是由各種類型細胞識別外來抗原發起的，主要是巨噬細胞或其他抗原呈遞細胞。這引起淋巴細胞活化，尤其是特異性識別特定外來抗原的淋巴細胞，並導致免疫反應發展和可能的外來抗原消除。覆蓋針對外來抗原消除的免疫反應的是引起輔助功能、刺激物功能、抑制因子功能和其他反應的複雜相互作用。免疫系統的反應能力必須在刺激和抑制的多個部位小心地控制，否則反應將不發生、過度反應或在消除後不停止。
對外來抗原起反應的識別期由外來抗原與免疫細胞上特異性受體的結合組成。這些受體通常在接觸抗原前就存在。識別還可以包括通過巨噬細胞樣細胞或通過血清或體液內因子識別進行的與抗原的相互作用。
在活化期，淋巴細胞經歷至少兩次重大改變。它們增殖，從而引起抗原特異性淋巴細胞克隆的擴展和反應的擴大，且抗原刺激的淋巴細胞子代分化為效應細胞或存活的、易於對再次暴露於抗原起反應的記憶細胞。有提高這個反應的許多擴大機制。
在效應期，活化的淋巴細胞執行可以引起抗原消除或建立疫苗反應的功能。這種功能包括細胞反應，如調節、輔助、刺激物、抑制因子或記憶功能。許多效應功能需要細胞和細胞因子的聯合參與。例如，抗體與外來抗原結合併通過血液嗜中性白細胞和單核吞噬細胞提高它們的吞噬作用。補體途徑被活化，並可能參與除觸發其他身體反應如發熱之外的微生物的裂解和吞噬作用。
在對抗原的免疫反應中，免疫細胞通過直接的細胞與細胞的接觸或間接的細胞與細胞(因子介導的)通訊而彼此相互作用。例如，T細胞、巨噬細胞、樹突細胞和B細胞之間的相互作用是有效免疫反應必需的。抗原呈遞細胞(APC)通過將加工的抗原和其他活化信號呈遞給B和T細胞而活化它們。活化的T細胞輔助控制免疫反應並參與外來生物的除去。輔助T細胞引起細胞變成更好的效應細胞，如輔助細胞毒性T細胞前體發育為殺傷細胞，輔助B細胞產生抗體，和輔助增加其他細胞，如巨噬細胞的功能。活化的B細胞分裂並產生抗原特異性抗體和記憶B細胞。包含在免疫反應中的細胞還分泌細胞的因子或細胞因子，它們提高吞噬細胞的功能、刺激炎性反應和影響各種細胞。
這些細胞的反應還包括反饋環。巨噬細胞和其他單核吞噬細胞，或APCs活躍吞噬抗原以呈遞給B和T細胞並且淋巴細胞的細胞因子可以提高這種活性。巨噬細胞還產生細胞因子，所述細胞因子除別的活性外可刺激T細胞增殖和分化，徵募其他炎性細胞，特別是嗜中性白細胞，和負責很多炎症的全身效應，如發熱。一個這種細胞因子，稱為白細胞介素-12，對細胞介導的免疫的發展特別重要。
樹突細胞也是APCs，其啟動免疫反應。有許多不同類型的樹突細胞，包括皮膚的淋巴樣樹突細胞和郎格漢斯細胞。它們遍及身體，且尤其是在脾、淋巴結、扁桃體、淋巴集結和胸腺中可以發現它們。它們是不規則形狀的細胞，其不斷伸展和收縮樹狀(樹狀的)突起。它們在免疫系統中的作用之一是誘導和調節B和T細胞活化和分化。它們是細胞毒性T細胞發育、B細胞引起的抗體形成和一些多克隆反應如氧化性有絲分裂發生的有力輔助細胞。它們還刺激T細胞釋放細胞因子白細胞介素-2。
接種疫苗的重要武器是B淋巴細胞或B細胞提供的對抗原的反應。B細胞代表約5至15％的循環淋巴細胞。B細胞產生免疫球蛋白，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，其可以釋放到體液、隨附著的蛋白分泌或插入B細胞的表面膜中。這種固定的免疫球蛋白充當特異性抗原受體。在對抗原的反應中，這些免疫球蛋白受體在B細胞上特異性部位交聯。這個過程被稱為加帽，隨後是免疫球蛋白的內在化和降解。在APCs中，所述APCs可能包括B細胞，抗原片段與MHC結合併最終在APC表面上表達。
B漿細胞產生並分泌可以結合外來蛋白、多糖、脂質或胞外或細胞結合形式的其他化學物質的抗體分子。單個漿細胞產生的抗體對於一個抗原是特異性的。分泌的抗體結合抗原並觸發促進它們破壞的機制。
1975年，Kohler和Milstein(Kohler，G.，和Milstein，C.，Nature(London).1975.volume 256pp-495)描述了從免疫的小鼠脾臟分離的產生抗體的B細胞與攻擊性增殖的小鼠骨髓瘤細胞融合的方法。此生成的雜交細胞即雜交瘤具有兩個親本細胞的特徵。在它繼續生長和增殖過程中，它產生並分泌大量抗體。通過一系列系統的細胞稀釋，可以分離產生單一特異性的抗體-單克隆抗體(Mab)的遺傳單一的雜交瘤細胞。
最普通程序要求單克隆抗體的產生從免疫動物開始。排入局部淋巴結或脾的抗原活化原初 B細胞以產生IgM抗體。這些活化的B細胞用抗原活化的CD4+T細胞呈遞以誘導類別轉換。類別轉換的特徵是抗體產生類型由IgMs至IgGs的改變(Kuby，J.，Immunology Third Edition 1997.eds Allen D.，pp-205-213)。分泌抗體的B細胞淋巴細胞分離自免疫的動物的淋巴結或脾，並與物種特異性骨髓瘤細胞融合。然後允許融合細胞生長而產生抗原特異性IgG抗體。在篩選過程中，根據它們的治療潛力選擇陽性融合克隆。
用外來抗原可以容易地免疫小鼠以產生廣譜的高親和力抗體。然而，由於外來蛋白在體內的呈遞，將鼠抗體引入人引起人抗小鼠抗體(HAMA)的產生。鼠抗體在患者中的使用通常限於數天或數周。而且，一旦HAMA在患者中發展，它常常妨礙鼠抗體的其他診斷或治療目的的未來應用。
這個技術在動物中的早期成功激勵科學家們在20世紀80年代擴展這個觀念並試圖生產人單克隆抗體。然而，從動物外推到人充滿了困難。第一個障礙是抗原特異性B細胞的缺乏。標準單克隆抗體方法要求這些細胞從已免疫的動物收穫，這種方法通常不適用於人。由於下列事實，這個問題更加複雜，(i)沒有活化的B細胞的現成來源；(ii)外周血中存在的免疫活性B細胞的貧乏，和(iii)不能從人受試者獲得淋巴結或脾。這些因素激勵開發各種體外策略以產生人單克隆抗體。雖然最初的結果顯示了巨大的前景，但是不能完全重建體內抗體反應事件的順序最終引起該技術失敗，並且這個技術方法基本上已經被棄用。
體外生產抗體的第一個障礙是原初人B細胞淋巴細胞轉化至活化的B細胞的轉化率相對低。過去，解決這項挑戰被證明是困難的，即使當使用回憶抗原如破傷風毒素(Butler等人，J.Immuol.1983.volume 130PP-165)來誘導人外周血B細胞淋巴細胞的初次抗體應答時也如此。本發明包括製備活化引起抗體產生途徑的載體的方法。本發明還包括天然存在或合成的載體的組合物。這種載體包含結合多個B細胞配體的膠態金平臺。
已經描述過受體/配體對交聯以加強生物學反應的許多實例(Carroll，K.，Prosser，E.，和Kennedy，R.Hybridoma 1991.10229-239)。本發明包括增加對體外免疫的B細胞抗體反應效率和特異性的膠態金屬的載體。不希望被任何特定理論限制，據信抗原與B細胞生長因子的物理並列可以提高抗原通過表面IgM抗原受體的攝取，並誘導更強的B細胞反應。還有改善的抗原加工和呈遞。相同B細胞上並列具有這些信號提高了體外引發抗原特異性B細胞反應的能力。
在一個實施方案中，成分特異性免疫刺激分子和/或MHC蛋白和/或抗原可以與膠態金屬平臺直接結合或可以通過結合基團成員與膠態金屬平臺結合。這種結合基團可以包括免疫成分上存在的或被合成地添加到其上的游離巰基或吡啶基。本發明的優選實施方案包括膠態金屬作為能夠與結合基團成員結合的平臺，成分特異性免疫刺激劑或MHC蛋白或抗原與所述平臺結合以產生合成的APC。在可供選擇的優選實施方案中，結合基團是鏈黴抗生物素蛋白/生物素，且成分特異性免疫刺激劑是細胞因子。本發明的實施方案也可以包括以稍不特異的方法結合抗原、或MHC蛋白或成分特異性免疫刺激劑，其中不使用結合配偶體，如使用聚陽離子或蛋白。照此，本發明預期使用本領域技術人員已知的相互作用分子，如聚陽離子元件，包括但不限於聚賴氨酸、硫酸魚精蛋白、組蛋白或脫唾液酸糖蛋白。
結合對的成員包括本領域技術人員已知的任何這種結合對，包括但不限於抗體-抗原對、酶-底物對；受體-配體對；和鏈黴抗生物素蛋白-生物素。新的結合配偶體可以是特別設計的。結合配偶體的基本要素是結合對之一與另一個結合對成員之間特異性結合，從而結合配偶體能夠特異連接。結合成員的另一個所需要素是每個成員都能夠結合或被結合到整合分子或靶向分子。
本發明的組合物包含膠態金屬、抗原和成分特異性免疫刺激劑。可選擇地，本發明的組合物包含膠態金屬、MHC蛋白、抗原和成分特異性免疫刺激劑。成分特異性免疫刺激劑可以包括可以用於治療應用的生物活性劑，或者成分特異性免疫刺激劑可用於檢測方法。在另外的實施方案中，一個或多個成分特異性免疫刺激劑與膠態金屬混合、締合或直接或間接結合。混合、締合和結合包括共價和離子鍵和允許衍生的PEG或衍生的聚-1-賴氨酸、成分特異性免疫刺激劑和其他成分彼此之間和與膠態金屬顆粒之間長期或短期締合的其他更弱或更強締合。
在又一個實施方案中，該組合物也可以包括與膠態金屬混合、締合或結合的一個或多個靶向分子。靶向分子可以直接或間接與金屬顆粒結合。間接結合包括通過分子如聚賴氨酸或其他整合分子的結合，或與同時結合靶向分子和金屬溶膠或與金屬溶膠結合的另一個分子的分子的任何締合。
特別感興趣的是檢測劑，如可用於顯現或檢測螯合的膠態金屬載體的染料或放射性材料。預期螢光、化學發光、熱敏、不透明的、珠子、磁性和振動材料也可以用作與本發明組合物中膠態金屬締合或結合的可檢測劑。
體外原初人B細胞產生初次抗體應答僅代表人抗體反應體外重建的第一步。來自免疫的人B細胞的初級抗體反應引起IgM抗體分泌。稱為抗原呈遞細胞(APCs)的第二類淋巴樣細胞也使抗原內在化。一旦被內在化，這些細胞將蛋白抗原加工為片段，該片段然後在結合兩個主要組織相容性複合體(MHCs)之一的細胞表面上表達。這些細胞對於抗體類別轉換很重要。
在此介紹了免疫系統反應的當前學說。本發明不局限於在此描述的機制，而是可以在多個方法中起作用，不被在此描述的任何特定理論所限制。依賴於微環境，表達與II類MHC分子結合的抗原的APCs活化CD4+T細胞的兩個亞型之一。這些細胞亦稱為輔助T細胞，執行必要的輔助功能以促進細胞或體液(抗體)免疫反應。TH1CD4+細胞促進細胞免疫反應，而CD4+細胞的TH2亞型與分泌IgM的B細胞相互作用以啟動類別轉換過程。
APC活化CD4+TH2T細胞隨著被稱為免疫突觸的兩細胞半裂(bicellular cleft)形成而發生(Wulfing C，Sumen C，Sjaastad MD，Wu LC，Dustin ML，Davis MM.Nat Immunol 2002.3142-7)。免疫突觸的形成包括APC上信號傳導和結構配體與T細胞上它們各自的受體的相互作用和重排以形成允許這兩個細胞之間聯繫和信號傳導的三維(3-D)橋(圖1)。APC和T細胞之間的抗原信號傳導通過MHC/抗原複合體與T細胞受體複合體的結合而發生，同時免疫突觸的結構完整性由APC上的ICAM(胞內粘附分子)、LFA-3和CD72分別與T細胞上的LFA-1、CD2和CD5受體的相互作用來維持。免疫突觸的成功形成引起CD4+T細胞表達被稱為CD40配體的B細胞刺激分子。
免疫突觸的形成可以發信號使T細胞變成有活性或無活性的(無反應性的)。哪個反應被啟動取決於APC上B7分子提供給T細胞的共刺激信號強度。B7分子可以與T細胞上的B7受體分子CD28或CTLA4相互作用。這些B7受體在它們在T細胞表面上的密度以及它們對B7分子的親和力方面不同。CD28對B7的親和力比CTLA4更低，但是在T細胞表面上以高得多的密度存在。B7與CD28受體的結合向T細胞發送活化信號，而CTLA4結合B7誘導T細胞無反應性(Kuby，J.，Immunology Third Edition 1997.eds Allen D.，PP.213-218)。因此，免疫突觸中呈遞過多B7將確保T細胞被活化。活化的CD4+/CD40+T細胞與分泌IgM的B細胞形成突觸。T細胞上CD40配體與B細胞上CD40受體的相互作用引起分泌IgM的B細胞經歷類別轉換以產生IgGs(圖2)。
本發明包括製備能夠活化CD4+T細胞的sAPCs、以及能使免疫的B細胞或無限增殖化B細胞的抗體反應成熟的合成CD4+T細胞(sTc)和合成生發中心(sGC)的方法。本發明的組合物包含能夠活化T細胞的膠態金屬載體和引起免疫的或無限增殖化B細胞成熟的載體。例如，載體可能具有與膠態金屬載體表面締合的負載抗原的II類主要組織相容性(MHC)蛋白、共刺激蛋白B7和結構蛋白胞內粘附分子(ICAM)。這個載體複製三維方向APC(圖3)並且起著能夠活化CD4+T細胞以使免疫的B細胞的抗體反應成熟的合成抗原呈遞細胞(sAPC)的作用。sAPC的一個實施方案包括膠態金屬單個顆粒上的全部成分。sAPC的另一個實施方案包括與膠態金的單獨顆粒結合的免疫突觸的組成蛋白，其在體外自動裝配形成sAPC。
包括合成抗原呈遞細胞(sAPC)的本發明方法和組合物包含容易得到和可以「從冰箱中拉出」並用於操縱人抗體反應的組合物。因此本發明包括疾病和免疫相關機能障礙和病理的治療方法。膠態金屬組合物對變量提供控制，該變量負責啟動、維持和調節免疫反應(下調或上調)，如顆粒大小、每個顆粒結合的蛋白量、蛋白在顆粒上運動的靈活性，以及顆粒的三維裝配，確保sAPC的可重複控制。
本發明的載體組合物可用於體外生產單克隆抗體。這種單克隆抗體可用在多種疾病的治療方法中。本發明的載體組合物還可以用於製備改善的疫苗組合物。
在疫苗療法中，使用特別設計用來刺激人免疫系統細胞和體液反應的合成免疫原的組合物。通過產生用於呈遞抗原和刺激特異細胞的特異性合成細胞免疫元件，能夠實現更可預測和有效的疫苗反應。
本發明包括聯合疫苗和DNA疫苗。聯合疫苗的實例是百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)毒素及其表面的菌毛血凝素。在DNA疫苗接種中，給患者施用編碼蛋白抗原的核酸，該核酸然後被轉錄、翻譯和以一些形式表達，以產生對抗原的強烈、長期的體液和細胞介導的免疫反應。
通過使用佐劑可以非特異性地增強疫苗產生的免疫反應。這些是化合物或載體成分，如脂質體、乳劑或微球體的異質組，具有幾個不同的作用機理。本發明的方法包括使用疫苗來預防疾病和治療癌症。
除癌症之外，許多疾病是由免疫系統介導的，且本發明包括這種疾病的治療方法，其通過施用包含能夠刺激免疫系統及其成分的膠態金屬載體的有效量組合物來實現。該疾病包括克羅恩病、銀屑病、炎性腸病、成人呼吸窘迫症候群、變態反應、溼疹、鼻炎、蕁麻疹、過敏反應、移植排斥(如腎臟、心臟、胰腺、肺臟、骨和肝臟移植)、風溼性疾病、系統性紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、血清陰性的脊椎關節炎疹、Sjogren氏症候群、系統性硬化病、多發性肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、獲得性免疫缺損症候群、手足口病、Hashimoto氏甲狀腺炎、Graves氏病、Addison氏病、多內分泌自身免疫病、肝炎、硬化性膽管炎、原發性膽汁性肝硬變、惡性貧血、乳糜瀉、抗體介導的腎炎、腎小球性腎炎、Wegener氏肉芽腫病、微觀多動脈炎、結節性多動脈炎、天皰瘡、皰疹樣皮炎、白癜風、多發性硬化、腦脊髓炎、Guillain-Barre症候群、重症肌無力、Lambert-Eaton症候群、鞏膜、鞏膜外層、葡萄膜炎、慢性黏膜皮膚念珠菌病、Bruton氏症候群、嬰兒期一過性低丙種球蛋白血症、骨髓瘤、X連鎖高IgM症候群、Wiskott-Aldrich氏症候群、共濟失調-毛細血管擴張症、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少症、自身免疫性嗜中性白細胞減少症、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症、澱粉樣變性、慢性淋巴細胞性白血病或非何杰金氏淋巴瘤。
本方法通過靶向用於活化的特殊免疫成分來增強疫苗有效性。使用包含與膠態金屬和抗原締合的成分特異性免疫刺激劑的組合物。疫苗當前可得的疾病實例包括但不限於霍亂、白喉、嗜血桿菌屬、A型肝炎、B型肝炎、流行性感冒、麻疹、腦膜炎、流行性腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌性肺炎、脊髓灰質炎、狂犬病、風疹、破傷風、結核、傷寒、水痘-帶狀皰疹、百日咳和黃熱病。
施用途徑和用於將抗原遞送至免疫系統的載體組合是設計所需免疫反應中的有效工具。本發明包括方法和組合物，其包含各種載體或與遞送試劑締合的載體，所述遞送試劑如可以提供長期釋放免疫刺激性載體組合物的脂質體、微膠囊或微球體。這些遞送系統作用就象容納載體和向免疫系統緩慢釋放它的內部貯庫。例如，脂質體可以充滿包含載體的組合物，所述載體包含與膠態金屬締合的抗原和成分特異性免疫刺激劑。
抗原/成分特異性免疫刺激劑/金屬複合物緩慢從脂質體釋放並被免疫系統識別為外來的，和成分特異性免疫刺激劑所針對的特殊成分活化免疫系統。成分特異性免疫刺激劑的存在更迅速活化免疫反應級聯，且免疫反應更迅速和更特異地產生。
本發明中預期的其他方法和組合物包括使用抗原/成分特異性免疫刺激劑/膠態金屬複合物，其中膠態金屬顆粒具有不同的大小。成分特異性免疫刺激劑的順序施用可以通過使用這些不同大小的膠態金屬顆粒以一劑施用來完成。一劑將包括與抗原複合的四個獨立的成分特異性免疫刺激劑，且每個都具有不同大小的膠態金屬顆粒。因此，同時施用將提供免疫成分的順序活化以產生更有效疫苗和對群體的更大保護。順序活化的這種單劑施用的其他類型可以通過不同大小膠態金屬顆粒和脂質體組合或充滿不同大小膠態金屬顆粒的脂質體來提供。
如上所述的這種疫苗接種系統的使用在提供可以以一劑施用的疫苗中很重要。一劑施用在治療動物群體如家畜或野生動物群體中很重要。一劑施用在治療保健不力的群體如窮人、無家可歸的、鄉村居民或沒有充分保健的發展中國家的人中很重要。在所有國家中，很多人無法使用預防型保健，如接種疫苗。傳染病，如結核的重現增加了對可以一次給予並仍提供持久有效保護的疫苗的需要。本發明的組合物和方法提供了這種有效保護。
在此使用的術語「膠態金屬」包括任何不溶於水的金屬顆粒或金屬化合物以及非金屬來源的膠體，如分散在液體或水中的膠態炭(水溶膠)。可用於本發明的膠態金屬實例包括但不限於周期表IIA、IB、IIB和IIIB族的金屬，以及過渡金屬，特別是VIII族金屬。優選金屬包括金、銀、鋁、釕、鋅、鐵、鎳和鈣。其他合適的金屬還可以包括下列所有它們的各種氧化態鋰、鈉、鎂、鉀、鈧、鈦、釩、鉻、錳、鈷、銅、鎵、鍶、鈮、鉬、鈀、銦、錫、鎢、錸、鉑和釓。優選金屬以離子形成(優選來源於合適的金屬化合物)提供，例如Al3+、Ru3+、Zn2+、Fe3+、Ni2+和Ca2+離子。優選的金屬是銀，特別是在硼酸鈉緩衝液中，其具有大約0.1％至0.001％的濃度，和最優選大約0.01％溶液。另一個優選金屬是金，特別是Au3+形式。特別優選形式的膠態金是HAuCl4(OmniCorp，South Plainfield，NJ)。這種膠態銀溶液的顏色是黃色的，且膠體顆粒可以是1至100納米。這種金屬離子可以單獨或以與其他無機離子的複合體存在。
本發明中可以使用任何抗原。本發明中有用的抗原實例包括但不限於白細胞介素-1(「IL-1」)、白細胞介素-2(「IL-2」)、白細胞介素-3(「IL-3」)、白細胞介素-4(「IL-4」)、白細胞介素-5(「IL-5」)、白細胞介素-6(「IL-6」)、白細胞介素-7(「IL-7」)、白細胞介素-8(「IL-8」)、白細胞介素-10(「IL-10」)、白細胞介素-11(「IL-11」)、白細胞介素-12(「IL-12」)、白細胞介素-13(「IL-13」)、脂質A、磷脂酶A2、內毒素、葡萄球菌腸毒素B、百日咳毒素、破傷風毒素和其他毒素、I型幹擾素、II型幹擾素、腫瘤壞死因子(TNF-α或b)、轉化生長因子-β(「TGF-β」)、淋巴毒素、移動抑制因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(「CSF」)單核細胞-巨噬細胞CSF、粒細胞CSF、血管上皮生長因子(「VEGF」)、血管生成素、轉化生長因子(「TGF-α」)、熱激蛋白、表皮生長因子(「EGF」)、血型的碳水化合物部分、Rh因子、成纖維細胞生長因子和其他炎性和免疫調節蛋白、核苷酸、DNA、RNA、mRNA、有義、反義、癌細胞特異性抗原；如MART、MAGE、BAGE、和熱激蛋白(HSPs)；突變體p53；酪氨酸酶；粘蛋白，如Muc-1、PSA、TSH、自身免疫抗原；免疫治療藥如AZT；和血管生成和抗血管生成藥如血管抑素(angiostatin)、內皮抑素(endostatin)、鹼性成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子和前列腺特異性抗原和促甲狀腺素。
成分特異性免疫刺激劑可以是作用於免疫系統任何分子或化合物，例如增加APC刺激B細胞產生抗體的能力的任何分子。成分特異性免疫刺激劑的實例包括但不限於抗原、膠態金屬、佐劑、受體分子、核酸、免疫原性蛋白和輔助細胞因子/免疫刺激劑、藥物、化療劑和載體。
本發明中可以使用任何類型的藥劑。例如，抗炎藥如類固醇和非類固醇抗炎藥、可溶受體、抗生素、止痛劑、COX-2抑制劑。特別感興趣的化療劑包括下列非限制性實例，紫杉醇、紫杉醇、紫杉烷(taxanes)、長春滅瘟鹼、長春新鹼、阿黴素、無環鳥苷、順鉑、氨甲蝶呤、光輝黴素和他克林。
這些成分特異性免疫刺激劑可以單獨或聯合使用。它們可以以游離狀態或以複合物使用，如與膠態金屬組合。
本發明中有用的成分特異性免疫刺激劑實例包括但不限於白細胞介素-1(「IL-1」)、白細胞介素-2(「IL-2」)、白細胞介素-3(「IL-3」)、白細胞介素-4(「IL-4」)、白細胞介素-5(「IL-5」)、白細胞介素-6(「IL-6」)、白細胞介素-7(「IL-7」)、白細胞介素-8(「IL-8」)、白細胞介素-10(「IL-10」)、白細胞介素-11(「IL-11」)、白細胞介素-12(「IL-12」)、白細胞介素-13(「IL-13」)、脂質A、磷脂酶A2、內毒素、葡萄球菌腸毒素B和其他毒素、I型幹擾素、II型幹擾素、腫瘤壞死因子(「TNF-α」)、Flt-3配體、轉化生長因子-β(「TGF-β」)淋巴毒素、移動抑制因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(「CSF」)、粒細胞-巨噬細胞CSF、粒細胞CSF、血管上皮生長因子(「VEGF」)、血管生成素、轉化生長因子(「TGF-α」)、熱激蛋白、血型的碳水化合物部分、Rh因子、成纖維細胞生長因子和其他炎性和免疫調節蛋白、核苷酸、DNA、RNA、mRNA、有義、反義、癌細胞特異性抗原；如MART、MAGE、BAGE、和熱激蛋白(HSPs)；突變體p53；酪氨酸酶；自身免疫抗原；免疫治療藥，如AZT；和血管生成和抗血管生成藥，如血管抑素、內皮抑素、鹼性成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子(VEGF)和前列腺特異性抗原和促甲狀腺激素。
對本發明有用的佐劑包括但不限於熱殺死的丁酸分枝桿菌(M.Butyricum)和結核分枝桿菌(M.Tuberculosis)。核苷酸的非限制性實例是DNA、RNA、mRNA、有義和反義。免疫原性蛋白的實例包括但不限於KLH(Keyhole Limpet Cyanin)、甲狀腺球蛋白和含有佐劑和在基因中編碼的抗原部分的融合蛋白。
成分特異性免疫刺激劑可以使用已知的基因療法以它們的核酸形式遞送，且在翻譯後產生它們的作用。活化免疫成分如抗原的另外元件可以同時或順序遞送，從而使得細胞翻譯的成分特異性免疫刺激劑和外部添加的元件協同工作以特異性靶向免疫反應。
特別優選的實施方案提供了使用包含試劑的載體組合物活化免疫反應的方法，該試劑包含與成分特異性免疫刺激劑結合的特異性抗原。這種方法有效並可以在體外或體內使用。在此使用的成分特異性免疫刺激劑意思指對於免疫系統的成分如B或T細胞是特異性的，而且能夠影響所述成分，從而使得該成分在免疫反應中具有活性的試劑。成分特異性免疫刺激劑可能能夠影響免疫系統的幾個不同成分，且這種能力可以用於本發明的方法和組合物中。該試劑可以是天然存在的或可以通過分子生物學技術或蛋白受體操作來產生或修飾。
免疫反應中成分的活化可以引起免疫反應其他成分的刺激或抑制，從而導致免疫反應的全面刺激或抑制。為便於表達，在此描述了免疫成分的刺激，但是應當理解術語刺激預期了所有免疫成分的反應，包括但不限於刺激、抑制、排斥和反饋活性。
受影響的免疫成分可以具有多種活性，從而引起抑制和刺激或反饋機制的啟動或抑制。本發明不限於在此詳述的免疫反應實例，而是預期免疫系統所有方面的成分特異性作用。
免疫系統每個成分的活化可以是同時的、順序的或其任何組合。在本發明方法的一個實施方案中，多個成分特異性免疫刺激劑同時施用。在這個方法中，用多個分開的製劑同時刺激免疫系統，每個製劑包含含有成分特異性免疫刺激劑的載體組合物。優選，該載體組合物包含與膠態金屬締合的成分特異性免疫刺激劑。更優選，該組合物包含與同一大小顆粒或不同大小顆粒的膠態金屬和抗原締合的成分特異性免疫刺激劑。最優選，該組合物包含與同一大小顆粒或不同大小顆粒的膠態金屬、抗原和PEG或PEG衍生物(優選硫醇-PEG(PEG(SH)n))或衍生聚-1-賴氨酸(優選聚-1-賴氨酸硫醇(PLL(SH)n)))締合的成分特異性免疫刺激劑。
成分特異性免疫刺激劑為單個免疫成分提供特異性刺激的上調的影響。例如，白細胞介素-1β(IL-1β)特異性刺激巨噬細胞，而TNF-α(腫瘤壞死因子α)和Flt-3配體特異性刺激樹突細胞。熱殺死的丁酸分枝桿菌和白細胞介素-6(IL-6)是B細胞的特異性刺激物，且白細胞介素-2(IL-2)是T細胞的特異性刺激物。包含這種成分特異性免疫刺激劑的載體組合物分別提供巨噬細胞、樹突細胞、B細胞和T細胞的特異性活化。例如，當施用包含成分特異性免疫刺激劑IL-1β的載體組合物時，巨噬細胞被活化。優選組合物是與膠態金屬締合的IL-1β，且最優選組合物是與膠態金屬和抗原締合的IL-1β，以為所述抗原提供特異性巨噬細胞反應。載體組合物可以進一步包含靶向分子、整合分子、PEGs或衍生的PEGs。
免疫反應的許多元件可能是對抗原的有效免疫反應必需的。同時刺激的方法的實施方案是施用四個分開的成分特異性免疫刺激劑的組合物製劑，所述成分特異性免疫刺激劑包含1)用於巨噬細胞的IL-1β，2)用於樹突細胞的TNF-α和Flt-3配體，3)用於B細胞的IL-6和4)用於T細胞的IL-2。每個成分特異性免疫刺激劑載體組合物可以以本領域技術人員已知的任何途徑施用，並且可以使用相同途徑或不同途徑，這取決於期望的免疫反應。
在本發明方法和組合物的另一個實施方案中，單個免疫成分順序活化。例如，這個順序活化被分為兩個階段，致敏階段(primer phase)和免疫階段。該致敏階段包括刺激APCs，優選巨噬細胞和樹突細胞，而免疫階段包括刺激淋巴細胞，優選B細胞和T細胞。在兩個階段的每一個內，單個免疫成分的活化可以是同時的或順序的。對於順序活化，優選活化方法是施用引起巨噬細胞，隨後是樹突細胞，繼之以B細胞，之後是T細胞活化的載體組合物。最優選方法是聯合順序活化，包括施用引起巨噬細胞和樹突細胞同時活化，隨後是B細胞和T細胞同時活化的載體組合物。這是啟動免疫系統幾個途徑的多個成分特異性免疫刺激劑的方法和組合物的實例。
試劑與金屬溶膠結合的一個方法包括下列步驟，儘管僅僅為了清楚目的，公開的方法提及單一試劑TNF與金屬溶膠膠態金的結合。使用允許膠態金溶膠中的顆粒和蛋白溶液中TNF之間相互作用的裝置。該裝置的示意圖在圖11顯示。這個裝置通過將混合室減至小體積，使未結合的膠態金顆粒與待結合的蛋白TNF的相互作用最大化。這個裝置使大體積金溶膠與大體積TNF的相互作用能夠在小體積T形連接器中發生。相反，向大體積膠態金顆粒添加小體積蛋白不是確保蛋白與金顆粒均一結合的優選方法。向大體積蛋白添加小體積膠態金的相反方法也不是。實際上，膠態金顆粒和蛋白TNF通過從兩個大儲庫抽出膠態金顆粒和TNF蛋白的單個蠕動泵被施加到T形連接器中。為進一步確保適當的混合，一字排列式混合器就位於T形連接器的下遊。混合器有力地混合膠態金顆粒和TNF，兩者都以大約1L/分鐘的優選流速通過連接器流動。
在與試劑混合前，使用1N NaOH將金溶膠的pH調至pH 8-9。調節金溶膠pH的優選方法使用100mM TRIS，以調節膠態金溶膠pH至pH 6。重構高度純化凍幹的重組人TNF。稀釋TNF的優選方法是在用100mM TRIS調至pH 6的水中。在將溶膠或TNF添加至它們各自的儲庫之前，用夾關閉連接容器和T形連接器的管。將等體積膠態金溶膠和TNF溶液添加到合適儲庫中。溶液中活化劑的優選濃度為約0.01至15μg/ml，並可以根據試劑與金屬溶膠顆粒的期望比率而改變。溶液中TNF的優選濃度為0.5至4μg/ml，且對於TNF-膠態金組合物的最優選TNF濃度是0.5μg/ml。
一旦將溶液適當加載到它們各自的儲庫，則打開蠕動泵，將試劑溶液和膠態金溶液抽取到T形連接器中，通過一字排列式混合器，通過蠕動泵和進入收集瓶。在收集瓶中攪拌混合溶液以溫育另外一小時。
在包含PEG(無論衍生與否)的組合物中，製備這種組合物的方法包括下列步驟，儘管僅僅為了清楚目的，公開的方法提及將PEG硫醇添加至金屬溶膠組合物中。可以使用下列步驟製備任何PEG、衍生的PEG組合物或任何大小的PEG組合物或包含幾個不同PEGs的組合物。15分鐘溫育後，將硫醇衍生的聚乙二醇(PEG)溶液添加至膠態金/TNF溶膠。本發明預期使用具有任何衍生基團的任何大小的PEG，儘管優選的衍生的PEGs包括mPEG-OPSS/2,000、mPEG-OPSS/5,000、mPEG-OPSS/10,000、mPEG-OPSS/12,000、mPEG-OPSS/20,000、mPEG-OP(SS)2/2,000、mPEG-OP(SS)2/3,400；mPEG-OP(SS)2/8,000、mPEG-OP(SS)2/10,000、硫醇-PEG-硫醇/2,000、mPEG-硫醇5,000和mPEG-硫醇10,000、mPEG-硫醇12,000、mPEG-硫醇20,000(Sun-BIO Inc.)。優選的PEG是mPEG-硫醇5000，其在水中濃度為150μg/ml，pH 5-8。因此，將10％v/v的PEG溶液添至膠態金-TNF溶液中。將金/TNF/PEG溶液溫育另外15分鐘。
在優選方法中，TNF和PEG-硫醇部分同時與膠態金納米顆粒(nanoparticle)結合。在這個方法中，使用100mM TRIS鹼將膠態金納米顆粒pH調至6.0。類似地，使用100mM TRIS溶液將水的pH調至6.0。TNF和PEG-硫醇(20,000)分別在後一溶液中稀釋至5和15μg/ml的終濃度。膠態金納米顆粒和TNF/PEG-硫醇溶液都加載到它們各自的儲庫並通過T形連接器和一字排列式混合器結合，其中使用蠕動泵通過T形連接器抽取每種溶液。結合15分鐘後，將人血清清蛋白(在水中為200μg/ml)添加至膠態金/TNF/PEG-硫醇溶液並溫育另外15分鐘。
使膠態金/TNF/PEG溶液順序超濾通過50-100K MWCO滲濾柱體。用ELISA測量50-100K保留物和滲透物的TNF濃度，以確定與金顆粒結合的TNF量。
滲濾後，添加冷凍保護劑如甘露糖醇20mg/ml；和/或人血清清蛋白5mg/ml的組合物並將樣品在-80℃冷凍。將樣品凍幹至乾燥並在真空下密封，隨後重構和分析重構的樣品中存在的游離和與膠態金結合的TNF的量。
本發明的組合物可施用於體外和體內系統。體內施用可以包括直接應用於靶細胞或這種施用途徑，包括但不限於適於經口、直腸、經皮、眼(包括玻璃體內或intracameral)、鼻、局部(包括口腔和舌下)、陰道或腸胃外(包括皮下、肌內、靜脈內、真皮內、氣管內和硬膜外)施用的製劑。優選方法包括經口或注射途徑施用本發明有效量的包含載體的組合物。
該製劑可以方便地存在於單位劑型中並可以用傳統製藥技術製備。通過使金屬溶膠載體和藥物載體或賦形劑締合而製備藥物製劑組合物。通常，製劑的製備方法是組合物與液體載體或細碎的固體載體或兩者均勻和密切締合，然後，如果需要，使產品成形。
通過下列實施例進一步闡明本發明，不應將實施例解釋為以任何方式強加於其範圍的限制。相反，應明確地認識到，可以求助於各種其他實施方案、改動和其等同方案，在閱讀這裡的說明書之後，本領域技術人員可得到這些實施方案、改動和其等同方案的提示，但不背離本發明精神和/或所附權利要求的範圍。
實施例實施例1膠態金的製備使用Frens和Horisberger描述的反應製備膠態金溶膠(Frens，G.Nature Phys.Sci.1972，241，20-22，和Horsiberger，M.Biol.Cellulaire.1979.36253-258)。在這個反應中，通過添加檸檬酸鈉使HAuCl4形式的離子金還原成Au0納米顆粒。一般，將2.5ml 4％氯金酸(水中)溶液添至1L去離子水中。有力攪拌溶液並加熱至滾沸。通過添加1％檸檬酸鈉溶液啟動還原反應。顆粒大小受添加至反應的檸檬酸鹽量的控制。例如通過分別添加40、15和7.5ml檸檬酸鹽溶液形成17、32和64nm顆粒。添加檸檬酸鹽後，允許溶液沸騰和混合另外45分鐘。冷卻後，使溶膠通過0.22μm滅菌過濾器過濾並在室溫下貯藏直到使用。
膠態金溶膠的生產已從1.0L按比例增大到10L。使用UV-VIS波長掃描、動態光散射和差速離心技術檢查這些顆粒的平均粒度和均一性。製備的顆粒具有在它們預測大小10％以內常規測量的平均粒度並顯示出1.03-1.12或更低的多分散性測量值。
實施例2增加免疫活性B細胞的數目為了增加用於免疫的免疫活性B細胞的數目，從全血或棕黃層單元分離II類MHC限制的表面IgM+/sIgD+人B細胞。包被了抗IgM、抗IgD和抗CD19抗體的磁珠分離B細胞群。用細胞因子白細胞介素-7處理sIgM+/sIgD-不成熟B細胞，以募集另外的B細胞(Sudo，T.，Ito，M.，Ogawa，Y.，Iizuka，M.，Kodoma，H.，Kunisasa，T.，Hayashi，S.C.，Ogawa，M.，Sakai，K.，Nishikawa，S.，Nishkawa，S.C.J.Exp.Med.1989.170333-338)。已表明這種處理使這些B細胞成熟，如通過sIgM+/sIgD-B細胞表型轉換為sIgM+/sIgD+B細胞顯示的。使用FACS分離法純化這些分離的細胞至接近均一性。
TNF與載體如KLH或甲狀腺球蛋白(參見下面的討論)綴合提高人TNF的抗原性。TNF:KLH抗原與含有B細胞靶向/活化劑如白細胞介素-6(IL-6)的膠態金顆粒表面結合。IL-6是已知刺激抗體從免疫的B細胞合成的細胞因子。在相同金顆粒上具有兩個部分確保了B細胞接受KLH:TNF抗原信號以及IL-6信號以活化抗體反應。
實施例3初次抗體應答的鑑別對治療抗體的生產關鍵的是類別轉換過程。來自免疫的人B細胞的初次抗體應答引起IgM抗體分泌。稱為抗原呈遞細胞(APCs)的第二類淋巴樣細胞也使抗原內在化。一旦被內在化，這些細胞就將蛋白抗原加工為片段，該片段在結合兩個主要組織相容性複合體(MHCs)之一的細胞表面上表達。
依賴於微環境，表達與II類MHC分子結合的抗原的APCs活化CD4+T細胞的兩個亞型之一。這些細胞亦稱輔助T細胞，執行必要的輔助功能以促進細胞或體液(抗體)免疫反應。TH1CD4+細胞促進細胞免疫反應，而CD4+細胞的TH2亞型與分泌IgM的B細胞相互作用以啟動類別轉換過程。
APC活化CD4+TH2T細胞隨著被稱為免疫突觸的兩細胞半裂形成而發生。免疫突觸的形成包括APC上信號傳導和結構配體與T細胞上它們各自受體的相互作用和重排以形成允許這兩個細胞之間聯繫和信號傳導的三維(3-D)橋(圖1)。APC和T細胞之間的抗原信號傳導通過MHC/抗原複合體與T細胞受體複合體的結合而發生，同時免疫突觸的結構完整性由APC上的ICAM、LFA-3和CD72分別與T細胞上的LFA-1、CD2和CD5受體的相互作用來維持。免疫突觸的成功形成引起CD4+T細胞表達被稱為CD40配體的B細胞刺激分子。
免疫突觸的形成可以發信號使T細胞變成有活性或無活性的(無反應性的)。哪個反應被啟動取決於APC上B7分子提供給T細胞的共刺激信號強度。B7分子可以與T細胞上的B7受體分子CD28或CTLA4相互作用。這些B7受體在它們在T細胞表面上的密度以及它們對B7分子的親和力方面不同。CD28對B7的親和力比CTLA4更低，但是在T細胞表面上以高得多的密度存在。B7與CD28受體的結合向T細胞發送活化信號，而CTLA4結合B7誘導T細胞無反應性(Kuby，J.，Immunology Third Edition 1997.eds Allen D.，pp-213-218)。因此，免疫突觸中呈遞過多B7將確保T細胞被活化。
在這個過程中，免疫的人B細胞經歷免疫球蛋白基因重排，以產生高度特異性的高親和力IgG抗體。
這個載體最初從MHC、B7和ICAM蛋白在膠體金顆粒表面上裝配。免疫突觸的呈遞是三維方向的，以允許這個載體成功觸發CD4+T-細胞以以MHC限制性方式表達CD40配體。
還任選使用表達CD40配體的sTc，聯合各種細胞因子和其多個分子對治療性mAb發出關鍵親和力成熟信號的合成生發中心來啟動這個過程。
實施例4具有間隔臂的sAPC/sTc/sGC的產生這個sAPC建立在用於結合生物素化形式的MHC、B7和ICAM蛋白的鏈黴抗生物素蛋白膠態金顆粒上。這個單個顆粒sAPC具有更大的柔性，因為組成蛋白通過形成生物素-抗生物素蛋白橋的生物素化間隔臂與膠態金顆粒間接結合。類似地，可以使用與它們各個成分與膠態金屬系鏈的類似策略產生sTc和sGCs。
實施例5自動裝配的APCs/sTcs/sGCs開發了自動裝配的合成APCs。每個APC蛋白與不同膠態金顆粒結合產生免疫突觸蛋白的複雜基質。為指導這個sAPC裝配，製備定點分子支架以更好三維定向各種顆粒。圖5所示的是這個自動裝配的sAPC的表示。每個顆粒亞單位製劑允許單個顆粒結合多個試劑。為了闡明的目的，II類MHC分子與還結合鏈黴抗生物素蛋白的32nm膠態金顆粒結合。sAPC剩餘的兩個亞單位B7和ICAM與17nm顆粒結合。如同MHC顆粒，ICAM亞單位含有鏈黴抗生物素蛋白-停靠位點。為了裝配這個顆粒，使用生物素化人血清清蛋白將ICAM和MHC顆粒連接在一起。為完成載體的裝配，使用二硫醇化的聚乙二醇將MHC和B7顆粒連接在一起。
在這個模型中，免疫突觸的形成通過T細胞受體/膜重排而發生。這個載體也可以與固體支持體臺如EIA板結合。這個支架允許兩個膠態金靶向的抗原和sAPCs存在於相同基質中。結果，原初B細胞免疫後，sAPC可以活化CD4細胞以表達CD40配體並因而誘導類別轉換。
通過改變與CD40L/細胞因子或BLYS/CD30L的結合配偶體，產生了自動裝配的合成T細胞或合成生發中心。
實施例6蛋白與膠態金顆粒的結合蛋白與膠態金顆粒的結合受到膠態金溶膠和蛋白溶液pH的影響。在最適pH下，蛋白與膠態金顆粒表面結合併防止它們被鹽沉澱。通過溶膠顏色從紅色變為黑色容易地證明了膠態金的鹽誘導沉澱作用。測定描述的每個蛋白的pH結合最適值，所述蛋白包括MHC、B7、ICAM、IL-6和KLH:TNF抗原。例如，如下所述步驟概述了MHC分子與膠態金顆粒結合的方法。類似步驟將用於確定每個其他蛋白的結合條件。
通過用1N NaOH將1ml等分試樣的膠態金的pH從4調至11測定MHC與膠態金結合的pH結合最適值。將100μl等分試樣的每種金溶液置於微量離心管並與1ng MHC蛋白溫育30分鐘。然後向每管添加100μl 10％NaCl溶液。pH結合最適值定義為允許MHC蛋白與膠態金顆粒結合，同時防止鹽誘導的沉澱作用的pH。
除確定pH結合最適值之外，對每個蛋白進行飽和結合分析。對於這個試驗，膠態金顆粒pH將被如上所述調至pH結合最適值。隨後向100μl等分試樣的膠態金中添加遞增量的(0.025-5ng蛋白)MHC蛋白。結合30分鐘後，將各個等分試樣以10,000rpms離心以與結合膠態金的蛋白分開。分析上清液和膠態金沉澱中每個級分中存在的MHC蛋白相對量。
實施例7
結合的MHC蛋白的質量的定量為了定量與每個金顆粒結合的MHC蛋白的質量，開發定量EIAs進行MHC和B7蛋白的測量。ICAM的EIAs已經可從市場上買到。通過開發每個蛋白的競爭性結合的EIA來定量測量MHC和B7蛋白。使用pH 9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液將市場上可買到的B7和MHC蛋白的抗體(兩個抗體都可從Research Diagnostics，Inc.得到)包被在EIA板上。產生MHC和B7參考標準物，以提供1.56ng/ml至500ng/ml的劑量範圍。將這些標準物添加至含有MHC或B7蛋白的特異性抗體的EIA板。將結合膠態金的樣品添加至EIA板中的其他指定孔中。
各種蛋白的濃度通過建立樣品中存在的蛋白或標準物和生物素化形式分子對抗體位點的競爭性結合反應來測定。用鏈黴抗生物素蛋白鹼性磷酸酶檢測生物素化配體。添加底物後，樣品中存在的分析物的質量和顯色的顏色量之間產生相反的關係。
實施例8多個蛋白與相同顆粒的結合為了增加體外免疫的效率和特異性，需要多個化學性質不同的蛋白結合到單個膠態金顆粒表面上。證明了三個不同蛋白細胞因子(IL-1、IL-6和TNF)與相同膠態金顆粒的結合。每個細胞因子在特殊的pH下與膠態金結合。
如上面所證明的，分別確定了IL-1在6至8的pH下結合膠態金，而IL-6在8至11的pH下結合。將在水中含0.25ng/ml三種細胞因子的溶液與膠態金溶膠在pH 8下混合。取出樣品並將剩餘溶液pH調至11。每個pH改變前，收集另外的樣品。將兩個樣品離心，且將生成的膠態金沉澱重懸於PBS中。
為證明相同金顆粒上存在全部三種細胞因子，向包被了TNF的單克隆抗體的EIA板添加各種沉澱。結合後，洗滌板，並使指定孔與綴合鹼性磷酸酶的兔抗IL-1、IL-6或TNF溫育。洗滌後，向每孔添加底物以啟動顯色。圖6中呈現的數據表明由於pH結合最適值重疊，pH 8時，IL-1和TNF都存在於顆粒上。然而，極少的IL-6信號可以被檢測到。增加pH到11允許IL-6結合這些顆粒。
實施例9嵌合載體靶向特異細胞使EGF和鏈黴抗生物素蛋白與相同32nm膠態金顆粒結合。樣品被分成三個等分試樣以進行第二/靶向分子的結合。一個樣品與生物素化IL-1結合，另一個與生物素化GM-CSF結合，且第三個與生物素化IL-6結合。結合生物素化配體後，將樣品離心以除去任何游離試劑，並將膠態金沉澱添加至Ficoll分離的人白細胞。培養8天後，用數字攝影術證明各種膠態金載體的攝取。
通過使用生物素化IL-1、生物素化GM-CSF或生物素化IL-6進行靶向，使EGF鏈黴抗生物素蛋白金靶向巨噬細胞(圖7A)、樹突細胞(圖7B)和B細胞(圖7C)。每個圖中的黑色染色(用紅色箭標突出顯示)代表各種膠態金載體的攝取。
如在圖7中可以看到的，各種膠態金/細胞因子嵌合體不同地靶向免疫系統的各種細胞元件。黑色染色(用箭標突出顯示)代表膠態金顆粒，其已被各種免疫細胞內在化和聚集。這些數據表明IL-1將膠態金EGF靶向巨噬細胞，而GM-CSF將嵌合體靶向樹突細胞，且IL-6將載體靶向B細胞。
實施例10人淋巴細胞的免疫這些載體可用於從分離的淋巴細胞產生初次免疫反應。通過密度離心從全血收集白細胞。用甲狀腺球蛋白綴合的TNF/IL-6膠態金載體處理這些細胞。細胞每2天接受膠態金載體脈衝，共八天。最後脈衝後，將細胞培養另外5天。收集上清液並用直接EIA檢測人抗人TNF(IgM/IgD和IgG聯合)抗體的存在。如圖8中可以看到的，嵌合cAU甲狀腺球蛋白TNF具有最高的免疫密度。
實施例11免疫人B細胞和樹突細胞以表達II類MHC使用增加體外人淋巴細胞免疫效率的兩個不同方法。首先，TNF與免疫原性載體，如甲狀腺球蛋白、鑰孔血藍蛋白或鼠血清清蛋白偶聯提高TNF的免疫原性。使用標準EDC/NHS和戊二醛(gluteraldehyde)方法進行載體TNF綴合。其次，它們與含有細胞特異性靶向試劑的膠態金顆粒偶聯增加這些抗原的特異性。為將抗原遞送靶向於B細胞，使載體抗原複合體與包含IL-6的膠態金顆粒結合。為將載體抗原遞送靶向於樹突細胞，使載體抗原複合體與包含GM-CSF的膠態金顆粒結合。
這些載體最初用於免疫原初MHC限制的人B細胞和樹突細胞，以產生II類MHC抗原。這些相同的載體後來用於從新的或複製組的原初B細胞誘導初次抗體應答。免疫方案包括用各種載體順序免疫B細胞和樹突細胞。結果，B細胞和樹突細胞遇到載體一次，而TNF抗原遇到三次。
實施例12B細胞產生II類MHC蛋白為引起人B細胞產生II類MHC蛋白，將106個表面IgM+/IgD+人B細胞鋪在24孔板上並在1.5ml AIM V培養基中培養。鋪平板後二十四小時，用與IL-6靶向的膠態金載體結合的THYRO:TNF抗原脈衝細胞。兩天後，用IL-6載體靶向的KLH:TNF載體脈衝細胞。培養另外兩天後，用第三個載體TNF抗原MSA:TNF免疫細胞。將細胞溫育另外三至七天並通過FACS分析檢測II類MHC表達的存在。可供選擇地，可以用膠態金抗原同時脈衝細胞。
類似的步驟用於脈衝樹突細胞以表達II類MHC蛋白。用與GM-CSF靶向的膠態金載體結合的TNF載體抗原免疫這些細胞。使用包被了抗CD34的磁珠從外周血分離樹突細胞前體。體外擴展這些細胞，這通過在補充了1000ng/ml GM-CSF和100ng/ml IL-4的AIMV無血清培養基中培養它們來實現。通過用於探測CD1a和空II類MHC分子的FACS分析證實它們成熟後，用10ng/ml TNF脈衝使細胞分化為成熟樹突細胞。用GM-CSF靶向的膠態金TNF抗原免疫這些成熟的樹突細胞。檢測負載抗原的II類MHC蛋白複合物，這通過FACS或用鏈黴抗生物素蛋白綴合的藻紅蛋白(Research DiagnosticInc.)檢測系統檢測的生物素化抗原肽的原位分析來實現。
實施例13用於II類MHC抗原分離方法的發展分離MHC的方法使用「一般的」非MHC相容性血液樣品。這些MHC分子用於限定膠態金顆粒上蛋白的pH和飽和最適值。一旦限定了，這些方法就適於從免疫的MHC限制的血液庫中純化負載抗原的MHC。
使用Sette描述的方法進行一般的和負載抗原的人II類MHC的分離(Sette等人，J.Immunol.1992.148844)。簡言之，將來自非HLA匹配的人全血的棕黃層以108個細胞/ml的最小密度冷凍，並進行超聲處理以破裂細胞。使這些細胞懸浮於含2％Renex、150mM NaCl、5mM EDTA和2mM PMSF的50mM TRIS-HCl、pH 8.5的緩衝液中。通過離心除去大的微粒，包括核(10000×g 20分鐘)。然後將細胞溶解產物在通過使抗人II類MHC分子的鼠抗體(ResearchDiagnostics Inc.)與蛋白A/G瓊脂糖珠結合製備的親和柱上分級分離。使溶解產物通過該柱至少5次，以使MHC蛋白與固定的抗體的結合最大化。用含10mM TRIS-HCl pH 8.0/0.1％Renex的10柱體積緩衝液洗滌該柱，隨後用含1％正辛基葡糖苷(n-ocytlglucoside)的5柱體積PBS另外洗滌。使用具有1％正辛基葡糖苷，pH 11.5的50mM二乙胺鹽水緩衝液從柱洗脫II類MHC蛋白。洗脫後，立即通過添加2M甘氨酸、pH 2.0中和每個級分。使含II類MHC分子的級分等分試樣並以25μg等分試樣凍幹。
實施例14人B7.1分子的產生用重組DNA技術製備人共刺激分子B7.1。基因作為市場上可買到的瞬時表達載體系統(InVivogen Inc.)的一部分來提供。為構建體提供允許從質粒構建體分離活性基因的合適限制位點。使用限制性內切酶NcoI和NheI從pORF宿主質粒分離人B-7.1基因。這個雙酶切消化導致兩個線性化DNA片的形成。一個基因片段由B-7.1基因(893bp)組成，而另一個片段(3210bp)組成p-ORF質粒的輔助基因。在1％瓊脂糖凝膠上分級分離基因片段並用溴化乙錠染色顯色。從凝膠切下條帶並使用QuiaQuick凝膠提取樹脂純化。將純化的線性化基因插入杆狀病毒表達系統(CloneTech Inc.)，所述表達系統在強CMV啟動子的控制下。根據廠家說明書和條件，將杆狀病毒整合的基因轉染入SF9昆蟲細胞系。106個B7轉染的NOS細胞將在生物反應器中擴展。用親和層析處理培養基和細胞溶解產物，其中使用預先固定在A蛋白/G瓊脂糖凝膠柱的抗人B7.1蛋白的鼠單克隆抗體(Research DiagnosticsInc)。
實施例15合成的抗原呈遞細胞的產生單個顆粒sAPC為使初次抗體應答成熟，有能力的sAPC必須誘導引起抗體類別轉換的CD4T細胞/B細胞相互作用。通過結合膠態金單個顆粒上免疫突觸蛋白開發第一個sAPC。檢測這個載體以及鏈黴抗生物素蛋白膠態金核心上建立的一個載體活化CD4+T細胞的能力。
一旦分離了免疫突觸的成分並將其純化至均一，它們就與膠態金顆粒結合以開發單個顆粒sAPC。使用兩個策略開發這些APCs。第一個策略包括免疫突觸成分(即負載肽的MHC、B7和ICAM分子)與膠態金顆粒的直接結合。儘管不希望受限制，但人們相信每毫升金將結合250ng每種蛋白/毫升膠態金溶膠。
第一個支架裝配在EIA板表面上。該材料包括包被了人TNF的單克隆抗體的EIA板；32nm TNF/鏈黴抗生物素蛋白膠態金嵌合體；生物素化BSA17nm鏈黴抗生物素蛋白膠態金載體；生物素化人IL-6、綴合鹼性磷酸酶的兔抗人IL-6。將各種成分裝配入支架，如圖9A描繪的。這個研究的對照簡單地為32nm顆粒，無支架構建於其上的TNF停靠位點。如圖10A表示，當全部支架分子塊料存在時，產生強信號。僅通過省去TNF停靠位點，不形成支架，且結果無信號產生。
免疫突觸蛋白與膠態金單個顆粒的直接結合導致顆粒表面上蛋白的嚴格定向。為了增加sAPC上這些蛋白運動的靈活性，開發可替換的單個顆粒sAPC。這種單個顆粒sAPC是在結合生物素化形式的MHC、B7和ICAM蛋白的鏈黴抗生物素蛋白膠態金平臺上開發的。該蛋白通過經由間隔臂連接蛋白的生物素殘基與鏈黴抗生物素蛋白金顆粒結合。
使用幾個生物素化試劑如NHS-生物素(Pierce Chemical Co.)使蛋白生物素化。這個試劑在蛋白和生物素部分之間放置1.35nm的間隔臂。可供選擇地，使用NHS-LC-LC-生物素使蛋白生物素化。這個試劑在蛋白和生物素殘基之間放置3.05nm的間隔壁。這種間隔臂促進蛋白運動以促進配體結合。這個增添的靈活性提高了蛋白完成適當的三維定向和與CD4+T細胞形成有功能的免疫突觸的能力。
實施例16自動裝配的sAPC的產生多顆粒sAPC在免疫突觸形成過程中將具有自動定向的靈活性。靈活性是裝配用於將顆粒連接在一起的部分的直接結果。接頭可以是烷、蛋白和聚乙二醇(PEG)，以允許最大的載體功能性。
使用包含四個末端游離硫醇的四臂聚乙二醇(10,000MW)主鏈裝配第二個支架(圖9B中所示)。這個接頭用於連接與IL-1或TNF結合的膠態金單個顆粒。連接後，將製劑離心並使用僅用IL-1單克隆抗體包被的EIA板測定兩種蛋白。結合後，洗滌板並使用連接IL-1或TNF多克隆抗體的酶進行檢測。類似地，圖9B中描述的載體只有在在接頭存在下才對兩種蛋白產生信號(圖10B)。沒有接頭時，僅觀察到背景色。
為進一步增加sAPC的靈活性，將成分蛋白裝配在不同膠態金顆粒上。將這些顆粒裝配入支架系統，以產生能夠誘導CD4+T細胞活化的sAPC。溶液中可以使用多顆粒sAPC，或如圖9A和9B所示提供EIA板上固體支持體。
MHC、B7和ICAM蛋白與如前所述的不同膠態金顆粒結合。通過各種支架分子物理地連接顆粒。「連接」分子的功能是提供免疫突觸形成中膠態金單個顆粒的更大靈活性。無論sAPC作為獨立顆粒還是作為與固體表面結合的部分基質提供，都發生這個靈活性。
第一個添加物由修飾的二硫醇烷部分組成。烷二硫醇的功能是通過形成硫醇-金鍵使膠態金單個顆粒結合在一起。在生物傳感器開發中，已使用這些部分在玻璃載玻片表面上建立自動裝配的金結構(Mirkin，C.A，Letsinger，R.，Mucic，R.C.，和Storhoff，J.J.Nature.1996.382 607-609)。硫醇基允許烷部分直接與膠態金顆粒表面結合。市場上可買到的烷硫醇試劑的實例包括1，5戊烷二硫醇、1，6己烷二硫醇和癸烷二硫醇(Sigma Chemical Company)。
作為烷二硫醇的替換物，也使用各種大小的2、3和4臂聚乙二醇(SunBio，Walnut Creek，CA)。這些聚合物的每個臂都具有游離硫醇基，其用於通過形成金-硫醇結合而結合膠態金單個顆粒。這些試劑提供在水中完全溶解度的另外優點。
免疫突觸的多個蛋白部分與膠態金單個顆粒或多個顆粒結合使得能夠產生合成的抗原呈遞細胞(sAPC)，所述抗原呈遞細胞能夠驅動引起免疫人B細胞中類別轉換的細胞事件。
實施例17sAPC刺激CD4+T細胞以表達CD40配體測試單個顆粒和自動裝配的sAPCs誘導MHC限制的CD4+T細胞表達CD40配體的能力。隨後，將0.1至10μg負載抗原的MHC(在sAPC上呈遞)添加至在AIM V培養基中生長的106個II類限制的CD4+T細胞中。該刺激發生在IL-4和IL-10存在下，其驅動CD4+T細胞的TH2亞型產生。sAPC刺激4、12和24小時後，收集CD4細胞並用FITC標記的小鼠抗人CD40配體抗體染色並用FACS進行分析。
在CD4+T細胞活化過程中，如前文所述免疫新的一組MHC限制的B淋巴細胞(即未用於分離MHC的細胞)，以產生抗原特異性IgM抗體。使用以前描述的靶向的TNF抗原免疫MHC限制的B細胞。檢測抗原特異性IgMs和從它們各自的細胞產生CD40配體後，將活化的CD4+T細胞添加到分泌IgM的B細胞。通過檢測人抗人TNFIgGs來監控類別轉換。使IgG陽性克隆與如下所述的K6H6/B5小鼠人異源骨髓瘤(heteromyeloma)細胞系融合。
實施例18抗體檢測和B細胞的無限增殖化組合來自陽性孔的所有細胞，離心一次，用PBS洗滌，並與2×106個小鼠/人異源骨髓瘤K6H6/B5細胞組合。異源骨髓瘤細胞系K6H6/B5(可通過ATCC得到)是這些人淋巴細胞的理想融合配偶體，因為這些癌細胞是抗體的非分泌者且可以獲得，沒有專利限制。使用用PEG的標準融合方案融合人和骨髓瘤細胞。使用傳統的HAT/HT選擇方案選擇成功融合的細胞。使用直接ELISA檢測生長的克隆的TNF特異性人IgG抗體的產生。將顯示抗原識別的那些克隆按比例增加至T-75瓶中，在這點冷藏所有克隆並如下所述檢測它們的上清液中的中和抗體的活性。
實施例19TNF生物活性的中和使用充分表徵的WEHI 164生物測定法檢測TNF抗體中和TNF生物活性的能力。簡言之，TNF劑量依賴性抑制這些細胞的體外增殖。為了這個生物測定，將5000個WEHI細胞鋪平板在24孔組織培養簇中。向板中指定孔添加TNF(15.6pg/ml至500pg/ml)。為了測定人單克隆抗體中和TNF作用的能力，在1μg每種TNF單克隆抗體存在下，製備相同標準劑量範圍的TNF標準物。將各種處理的細胞培養5天，並使用Coulter計數器確定細胞數目。
實施例20離子強度對結合膠態金的TNF的凍幹穩定性的影響將如圖11所示的膠態金結合裝置用於將TNF與如前所述的膠態金納米顆粒結合。結合後，將30K PEG-硫醇以50μg/ml添加至pH 9的去離子水溶液中。
為了檢測離子強度對TNF-膠態金鍵穩定性的影響，向容納TNF溶液的容器中添加各種量的鹽(1×標準磷酸緩衝鹽水形式；PBS)。PBS終濃度從0至0.325％的標準PBS變化。結合和滲濾後，向樣品中添加冷凍保護劑(甘露糖醇20mg/ml；人血清清蛋白5mg/ml)。隨後將樣品等分試樣為1ml樣品並在-80℃冷凍。冷凍後，將樣品凍幹至乾燥並在真空下密封。
隨後，用1ml去離子水重構樣品，並用1％PEG-1450/水溶液稀釋十倍。將樣品離心，以使結合膠態金的TNF與游離TNF分離。用EIA分析膠態金沉澱和上清液兩者的TNF濃度。這些研究的數據在表I中示出。
表1.在不存在鹽的情況下製備的凍幹膠態金TNF的釋放特徵總TNF百分比膠態金沉澱 68上清液 32表I表明32％的TNF是從凍幹後載體中釋放的。在重複研究中，我們觀察到多達50％的蛋白是凍幹後釋放的。
實施例21增加離子強度對凍幹的膠態金-TNF藥物穩定性的影響通過添加0.25×溶液(77.25毫滲透壓摩爾/kg)來修飾在3mMTRIS溶液中預先稀釋至0.5μg/ml TNF終濃度的TNF溶液。溶液如上文所述結合。結合後，添加如上文所述的30K PEG-硫醇和冷凍保護劑並在-80℃冷凍樣品。如上文所述凍幹樣品，隨後重構和分析重構的樣品中存在的游離和與膠態金結合的TNF的量。這些研究的數據在圖12中示出。
如在圖2可以看出的，增加離子強度顯著提高凍幹過程中載體的穩定性。鹽效應是劑量依賴性的。如表II所示，在添加到TNF的鹽量降低時，凍幹後更多蛋白被釋放。
表II.鹽濃度對載體凍幹後TNF釋放的影響鹽濃度 0 4.519.346.577.25(毫滲透壓摩爾/kg)釋放百分比 40 30 10 6 6在不存在鹽的情況下結合TNF導致一部分TNF結合在離子雙層中，而不是直接結合在金顆粒上(圖13)。凍幹過程中，溶劑化離子層的水喪失，且因此重構後，這些載體釋放與離子云結合的一部分TNF。通過添加鹽來增加離子強度，離子層收縮/破壞(圖14)並允許全部TNF直接與顆粒表面結合。凍幹後，這個製劑的全部TNF與顆粒表面結合。
上面引用的全部專利、出版物和摘要的全部內容都在此併入作為參考。應該理解前文僅僅涉及本發明的優選實施方案，而且其中可以進行許多改動或變更，而不背離下列權利要求中限定的本發明的精神和範圍。
權利要求
1.一種載體組合物，其包含合成的APC，其中合成的APC包含膠態金屬、抗原和成分特異性免疫刺激劑。
2.權利要求1的載體組合物，其中所述成分特異性免疫刺激劑包括抗原、膠態金屬、佐劑、受體分子、核酸、免疫原性蛋白、輔助細胞因子/免疫刺激劑、藥物、化療劑或載體。
3.權利要求1的載體組合物，其中所述成分特異性免疫刺激劑包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、脂質A、磷脂酶A2、內毒素、葡萄球菌腸毒素B、I型幹擾素、II型幹擾素、腫瘤壞死因子(TNF-α)、Flt-3配體、轉化生長因子(TGF-β)、淋巴毒素、移動抑制因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(CSF)、單核細胞-巨噬細胞CSF、粒細胞CSF、血管上皮生長因子(VEGF)、血管生成素、轉化生長因子(TGF-α)、熱激蛋白、血型的碳水化合物部分、Rh因子、成纖維細胞生長因子、炎性和免疫調節蛋白、核苷酸、DNA、RNA、mRNA、有義、反義、多核苷酸、癌細胞特異性抗原、突變體p53、酪氨酸酶、粘蛋白、自身免疫抗原、免疫治療藥、血管生成或抗血管生成藥。
4.權利要求3的成分特異性免疫刺激劑，其中所述癌細胞特異性抗原是MAGE、BAGE或MART。
5.權利要求3的成分特異性免疫刺激劑，其中所述粘蛋白是MUC-1、PSA或TSH。
6.權利要求1的載體組合物，其中所述膠態金屬包括膠態金、膠態銀、膠態鐵、膠態鋁或膠態鉑。
7.權利要求1的載體組合物，進一步包含藥物可接受成分，所述成分包括賦形劑、緩衝液或載體。
8.權利要求1的載體組合物，進一步包含佐劑，其中所述佐劑包括脂質體、乳劑、微球體、可生物降解的聚合物和聚苯乙烯、明礬、熱殺死的丁酸分枝桿菌和結核分枝桿菌、百日咳毒素和破傷風毒素、或LPS和葡萄球菌腸毒素B。
9.權利要求1的載體組合物，其中所述載體進一步包含共刺激蛋白。
10.權利要求1的載體組合物，其中所述載體進一步包含主要組織相容性複合體。
11.權利要求1的載體組合物，其中所述載體進一步包含生發中心。
12.權利要求1的載體組合物，其中所述載體進一步包含結構蛋白。
13.權利要求1的載體組合物，進一步包含靶向分子、整合分子、PEG、衍生的PEG、聚-L-賴氨酸或衍生的聚-L-賴氨酸、生物素-抗生物素蛋白、雙功能PEG或雙功能聚合物。
14.權利要求13的載體組合物，其中所述雙功能PEG包含硫醇和生物素。
15.權利要求13的載體組合物，其中所述聚-L-賴氨酸包含硫醇和生物素。
16.權利要求1的載體組合物，其中合成的APC是凍幹的並且在施用前被貯藏一段時間。
17.一種體外生產單克隆抗體的方法，其包括a)將抗原、成分特異性免疫刺激劑與膠態金屬混合或結合以形成合成的APC；和b)體外刺激來自人的免疫細胞以活化免疫細胞，以產生對合成的APC的初次反應；其中合成的APC包含抗原、成分特異性免疫刺激劑和膠態金屬；和c)使活化的免疫細胞無限增殖化；和d)選擇產生單克隆抗體的細胞。
18.權利要求17的方法，進一步包含主要組織相容性複合體。
19.權利要求17的方法，進一步包含生發中心。
20.一種包含完全人蛋白的抗原特異性、人特異性單克隆抗體，其由下述方法製備a)體外刺激來自人的免疫細胞以活化免疫細胞，以產生對合成的APC的初次反應；其中合成的APC包含抗原、成分特異性免疫刺激劑和膠態金屬；和b)使活化的免疫細胞無限增殖化；和c)選擇產生單克隆抗體的細胞。
21.一種影響免疫反應的方法，其包括施用包含至少一種膠態金屬顆粒、抗原和至少一種成分特異性免疫刺激劑的組合物。
22.一種增強疫苗功效的方法，其包括施用包含至少一種膠態金屬顆粒、抗原和至少一種成分特異性免疫刺激劑的組合物。
23.一種治療疾病和免疫相關機能障礙和病理的方法，其包括給人或動物施用治療有效量的包含合成的APC的載體組合物，其中所述合成的APC包含至少一種膠態金屬、抗原和成分特異性免疫刺激劑。
24.權利要求23的方法，其中所述膠態金屬顆粒具有不同的大小。
25.權利要求24的方法，其中施用成分特異性免疫刺激劑、抗原和不同大小的膠態金屬顆粒包括將成分特異性免疫刺激劑、抗原和不同大小的膠態金屬顆粒作為一劑同時施用。
26.權利要求23的方法，其中該方法在治療疾病中用於刺激或抑制免疫成分，其中所述疾病是癌症、實體腫瘤癌、克羅恩病、乳腺癌、銀屑病、炎性腸病、成人呼吸窘迫症候群、變態反應、鼻炎、溼疹、蕁麻疹、過敏反應、移植排斥、風溼性疾病、系統性紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、血清陰性的脊椎關節炎疹、Sjogren氏症候群、系統性硬化病、多發性肌炎、皮肌炎、I型糖尿病、獲得性免疫缺損症候群、Hashimoto氏甲狀腺炎、Graves氏病、Addison氏病、多內分泌自身免疫病、肝炎、硬化性膽管炎、原發性膽汁性肝硬變、惡性貧血、乳糜瀉、抗體介導的腎炎、腎小球性腎炎、Wegener氏肉芽腫病、微觀多動脈炎、結節性多動脈炎、天皰瘡、皰疹樣皮炎、銀屑病、白癜風、多發性硬化、腦脊髓炎、Guillain-Barre症候群、重症肌無力、Lambert-Eaton症候群、鞏膜、鞏膜外層、葡萄膜炎、慢性黏膜皮膚念珠菌病、Bruton氏症候群、嬰兒期一過性低丙種球蛋白血症、骨髓瘤、X連鎖高IgM症候群、Wiskott-Aldrich氏症候群、共濟失調-毛細血管擴張症、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少症、自身免疫性嗜中性白細胞減少症、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症、澱粉樣變性、慢性淋巴細胞性白血病或非何杰金氏淋巴瘤。
27.權利要求23的方法，進一步包含主要組織相容性複合體。
28.一種多顆粒自動裝配的合成的APC，其包含至少兩個膠態金屬、抗原和至少一個成分特異性免疫刺激劑，其中所述多顆粒合成的APC是使用支架分子裝配的，且其中所述支架分子包括生物素化的間隔臂、烷接頭、蛋白、聚乙二醇、衍生的PEG、多臂PEG或硫醇化聚-L-賴氨酸。
29.權利要求28的多顆粒自動裝配的合成的APC，其中所述膠態金屬顆粒具有不同的大小。
30.權利要求28的多顆粒自動裝配的合成的APC，進一步包含靶向分子和整合分子。
31.權利要求28的方法，進一步包含主要組織相容性複合體。
全文摘要
本發明包括製備單克隆抗體的組合物和方法。本發明進一步包括複製免疫系統成分的載體，所述免疫系統成分特別是免疫突觸的抗原呈遞細胞(APC)元件。另外，本發明可以進一步包括合成的T細胞。
文檔編號A61K48/00GK1925843SQ200480041234
公開日2007年3月7日 申請日期2004年12月2日 優先權日2003年12月2日
發明者L·塔馬金, G·F·帕茨奧蒂 申請人:細胞免疫科學公司