一種檢測和鑑定分枝桿菌菌種的方法及其專用試劑盒的製作方法

2023-06-30 09:12:51

專利名稱:一種檢測和鑑定分枝桿菌菌種的方法及其專用試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測和鑑定分枝桿菌菌種的方法及其專用試劑盒。
背景技術：
在微生物分類中，分枝桿菌屬於原核生物界，厚壁菌門，裂殖菌綱，放線菌目，分枝桿菌科，分枝桿菌屬。分枝桿菌屬內菌種繁多，Bergey’s manual of systemativebacteridogy(伯傑系統細菌學手冊)所確認的分枝桿菌有54種。分枝桿菌屬內除結核分枝桿菌複合群菌種(結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌)和麻風分枝桿菌外，其它菌種統稱為非結核分枝桿菌(NTM)。對人類致病的NTM有20餘種，其中慢生長分枝桿菌包括堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、瘰癧分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、施氏分枝桿菌，還有過去通常認為非致病性的戈登分枝桿菌、不產色分枝桿菌、土地分枝桿菌、次要分枝桿菌、亞洲分枝桿菌也可見病例報導；快生長分枝桿菌包括偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌，甚至過去認為的腐物寄生菌，如恥垢分支桿菌現已報導病例不下數10例，且偶有AIDS播散性感染，微黃分枝桿菌也偶爾可引起肺部和關節感染。近年來，在世界範圍內由結核分枝桿菌(MTB)及NTM引起的結核病及非結核分枝桿菌病發病率明顯升高。
目前，結核病臨床實驗室分枝桿菌細菌學檢測、鑑定方法有1、塗片染色鏡檢見到抗酸桿菌，報告抗酸染色陽性(+～++++)，不能確定所見抗酸分枝桿菌為MTB還是NTM，需經分枝桿菌菌種鑑定方可確定。
2、分離培養採用改良羅氏等固體培養基，見到菌落生長，報告分枝桿菌培養陽性(+～++++)，採用Bactec-TB960培養系統或Bact ALERT 3D培養系統，儀器判定為陽性後，取培養物塗片抗酸染色，陽性者報告分枝桿菌培養陽性。分枝桿菌培養陽性不能確定其是MTB還是NTM，需經分枝桿菌菌種鑑定方可確定。
3、分枝桿菌菌種鑑定(1)、MTB與NTM鑑別主要依據PNB培養基上生長試驗，(-)判定為MTB，(+)判定為NTM。
(2)、分枝桿菌菌種鑑定依掘生長特性，多種鑑別培養基上生長試驗和多種生化反應等近20項試驗指標綜合分析判定結果。
該分枝桿菌菌種鑑定方法具有以下缺點a、鑑定方法繁雜，需進行近20項試驗。b、鑑定試驗所需細菌培養物量較大，通常在取得初代分離培養物後需傳代培養，用傳代培養物進行試驗。初代分離培養物→傳代培養物→鑑定試驗→報告結果，快速生長分枝桿菌需3～4周，緩慢生長分枝桿菌需8～12周。c、結果準確度差同一菌種不同菌株間，伯傑系統細菌學手冊報導約15％生物學表型存在異質性，使菌種難以明確鑑定或鑑定錯誤。
用於分枝桿菌基因檢測及鑑定的商品化試劑盒主要分為以下二類
1、用於結核分枝桿菌複合群檢測及鑑定的試劑盒(李國利，結核病分子生物學檢測方法的理論與實踐，見肖和平主編.結核病防治新進展.上海復旦大學出版社，2004.128-135；衛生部臨床檢驗中心.附錄3有關PCR試劑、儀器廠家試劑、儀器說明.臨床基因擴增診斷實驗室技術人員培訓班資料彙編104-106，109-111，118-120)(1)、德國Roche公司生產的Amplicor試劑盒(Amplicor mycobacteriumtuberculosis)以16S rRNA基因(16S rDNA)為靶基因設計分枝桿菌屬特異性引物擴增分枝桿菌，以擴增片段內部結核分枝桿菌複合群特異序列設計雜交探針，採用PCR-微孔板雜交法。
(2)、國內多家公司生產螢光PCR試劑盒以結核分枝桿菌複合群特異的IS6110為靶基因序列設計引物及探針，分別採用Taqman技術和分子信標(molecular beacon)技術。
上述兩類試劑盒用於檢測鑑定臨床樣品中結核分枝桿菌複合群，不能檢出、鑑定NTM。螢光PCR需螢光PCR儀，價格較貴。
2、用於分枝桿菌菌種鑑定的試劑盒(Tortoli E，Nanetti A，Piersimoni C，et al.Performance assessment of new multiplex probe assay for identification ofmycobacteria.J clin Microbiol，2001，391079-1084；Miller N，Infante S and ClearyT.Evaluation of the LipA MYCOBACTERIA assay for identification of mycobacterialspecies from BACTEC 12 B bottles.J Clin Microbiol，2000，381415-1919)(1)、美國gen-probe公司生產的Accuprobe Mycobaterium試劑盒以16S rRNA為靶序列，設計結核分枝桿菌複合群、鳥分枝桿菌複合群、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和戈登分枝桿菌6種吖啶酯(acridinium ester，AE)標記的cDNA探針，採用液相雜交技術-雜交保護試驗(Hybridization protect assay，HPA)。HPA的基本原理及方法為AE是一種化學發光物質，AE標記的群或種特異性探針在液相中與經處理後待測分枝桿菌釋放的rRNA進行雜交；加入選擇試劑，與靶序列互補雜交的探針與未雜交的游離探針在選擇試劑作用下水解速度相差了百萬倍，游離探針迅速水解破壞，失去化學發光特性，而雜交後的探針受到保護，在一定時間內不被水解破壞，產生化學發光，通過化學發光檢測儀檢測其相對發光值判定結果。
該試劑盒的優點在於方法簡便、快速，2小時內報告結果。其局限性在於只適用於對分枝桿菌培養物進行鑑定；試劑盒僅包括6種探針，只能鑑定試劑盒所包括探針的結核分枝桿菌複合群、鳥分枝桿菌複合群、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和戈登分枝桿菌菌種，臨床可見的其他致病性分枝桿菌菌種必須通過其他方法鑑定；試驗需化學發光檢測儀以及試劑盒售價較貴。
(2)、比利時Innogenetics公司生產的LipA(Line Probe assay)Mycobacteria試劑盒以PCR擴增和反向核酸分子雜交為原理，採用16S-23S rDNA內轉錄間隔區(ITS)為靶基因序列設計了14條分枝桿菌寡核苷酸探針，以橫向線狀縱向水平排列固定於硝酸纖維素膜上，製備LipA測試條，與用生物素標記的分枝桿菌屬引物擴增的PCR產物雜交，再與鹼性磷酸酶標記的鏈親和素結合，顯色，根據與相應探針雜交線條判定分枝桿菌菌種或複合群。
該試劑盒具有方法簡便、快速，3小時～4小時報告結果的優點，但僅適用於對分枝桿菌培養物進行鑑定，且由於針對某一菌種有的使用了2～3條探針，因此14條探針僅能對結核分枝桿菌複合群、堪薩斯分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、戈登分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、瘰癧分枝桿菌和龜分枝桿菌，共8種分枝桿菌進行鑑定。8種以外的分枝桿菌需通過其他方法鑑定至種。
分枝桿菌菌種鑑定在NTM病與結核病的診斷、鑑別診斷、治療和流行病學調查等方面具有重要意義1、診斷塗片抗酸染色鏡檢和分枝桿菌分離培養是結核病的主要確診方法，但由於方法學的限制，即使是塗片或/和培養陽性也難以確定其是MTB還是NTM，因此，需進行分枝桿菌菌種鑑定，使結核病的診斷更趨於科學。
2、鑑別診斷NTM病與結核病臨床症狀及肺部X線表現極為相似，難以鑑別，必須依靠菌種鑑定結果，才能明確診斷。
3、治療NTM與MTB對藥物敏感性不同，多數NTM對抗結核藥物天然耐藥，不同NTM菌種對藥物敏感性亦不同，NTM病與結核病治療方案應有所不同。
4、流行病學在流行病學調查上有重要價值。
目前國內外研究及使用較多的分枝桿菌檢測、鑑定的靶基因主要是插入序列(insertion sequence，IS)，蛋白質編碼基因序列，16S rRNA基因(16S rDNA)序列和16S-23S rRNA基因(16S-23S rDNA)內轉錄間隔區(internal transcribed spacer，ITS)序列。這些基因序列大致可分為兩類一類是僅存在於結核分枝桿菌複合群菌種高度保守的特異性序列，如IS6110，IS1081，蛋白質編碼基因MTP40，MPB70和MPB64，可選擇用於結核分枝桿菌複合群的檢測和鑑定，其中IS6110是檢測、鑑定結核分枝桿菌複合群試劑盒最常採用的基因序列。另一類是分枝桿菌屬菌種共有的既高度保守又有種間多態性的序列，如分枝桿菌屬菌種共有的蛋白質編碼基因序列(65KD蛋白、32KD蛋白、dnaj蛋白和RNA聚合酶β亞單位編碼基因)，16S rDNA和16S-23S rDNA ITS序列，可選擇用於分枝桿菌菌種的檢測和鑑定。
16S rDNA是在基因水平上細菌分類鑑定的傳統的靶基因序列。現已完成50餘種分枝桿菌菌種16S rDNA的全部或部份核苷酸測序，通過分析比較發現，它們既含有分枝桿菌屬特異核苷酸序列，又含有種水平上的特異可變區，分枝桿菌16S rDNA含有兩個可變區，既位於126～267位核苷酸的A可變區和位於430～500位核苷酸的B可變區。A可變區核苷酸種間變異高於B可變區，分枝桿菌菌種鑑定多在A可變區水平上進行。但某些臨床上重要的致病性NTM，如堪薩斯分枝桿菌、胃分支桿菌、瘰癧分枝桿菌和猿猴分枝桿菌之間，蘇加分枝桿菌和馬爾摩分枝桿菌之間，海分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌之間，龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌之間在此水平上序列完全相同，只能將其鑑定至複合群水平，不能鑑定至種。
近年來，16S-23S rDNA ITS序列作為一種新的在基因水平上細菌分類鑑定的靶基因序列為人們所採用。對50餘種分枝桿菌16S-23S rDNA ITS測序結果分析表明，分枝桿菌16S-23S rDNA ITS序列依菌種不同其鹼基排列順序及長度均變異較大，核苷酸序列長度從200多bp～400多bp。在整個核苷酸序列內含2個分枝桿菌屬保守片段和數個高度可變的種特異序列，其種間多態性明顯高於16S rDNA，與16S rDNA相比較，更適於菌種的鑑定。除海分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌間序列完全一致不能鑑別外，能將堪薩斯分枝桿菌、胃分支桿菌、瘰癧分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌鑑定至種。

發明內容本發明的目的是提供一種簡便、快速、準確檢測及鑑定分枝桿菌菌種的方法及其專用試劑盒。
本發明所提供的分枝桿菌菌種檢測及鑑定試劑盒，包括分枝桿菌屬特異引物和分枝桿菌菌種檢測晶片；所述分枝桿菌菌種檢測晶片包括分枝桿菌菌種檢測探針；所述分枝桿菌菌種檢測探針由分枝桿菌屬特異探針，結核分枝桿菌複合群特異探針和以下分枝桿菌種特異探針組成堪薩斯分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、瘰癧分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、蟾蜍-施氏分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產色分枝桿菌、胃分支桿菌、次要分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、施氏分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、淡黃分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、母牛分枝桿菌、金色-迪氏-楚布分枝桿菌、新金色分枝桿菌特異探針；所述分枝桿菌屬特異引物為具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列的兩個寡核苷酸；所述分枝桿菌屬特異探針是至少具有序列表中序列3的核苷酸序列的寡核苷酸；所述結核分枝桿菌複合群特異探針是至少具有序列表中序列5和/或序列7的核苷酸序列的寡核苷酸；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列9和/或序列10的核苷酸序列的寡核苷酸；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列12的核苷酸序列的寡核苷酸；所述猿猴分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列14和/或序列16的核苷酸序列的寡核苷酸；所述瘰癧分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列18的核苷酸序列的寡核苷酸；所述戈登分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列20的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蘇加分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列22的核苷酸序列的寡核苷酸；所述鳥分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列24的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胞內分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列26的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列28和/或序列30的核苷酸序列的寡核苷酸；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列32的核苷酸序列的寡核苷酸；所述土地分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列34的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述不產色分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列36的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胃分支桿菌特異探針是至少具有序列表中序列38的核苷酸序列的寡核苷酸；所述次要分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列40的核苷酸序列的寡核苷酸；所述亞洲分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列42的核苷酸序列的寡核苷酸；所述施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列44的核苷酸序列的寡核苷酸；所述偶然分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列46的核苷酸序列的寡核苷酸；所述龜分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列48和/或序列50的核苷酸序列的寡核苷酸；所述膿腫分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列52的核苷酸序列的寡核苷酸；所述恥垢分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列54的核苷酸序列的寡核苷酸；所述草分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列56的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淡黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列58的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淺黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列60的核苷酸序列的寡核苷酸；所述迪氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列62的核苷酸序列的寡核苷酸；所述母牛分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列64的核苷酸序列的寡核苷酸；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列66的核苷酸序列的寡核苷酸；所述新金色分枝桿菌是至少具有序列表中序列68和/或序列70和/或序列72的核苷酸序列的寡核苷酸。
上述分枝桿菌屬特異引物、分枝桿菌菌種檢測晶片、分枝桿菌菌種檢測探針均屬於本發明的保護範圍。
本發明所提供的利用上述試劑盒檢測分枝桿菌的方法，是以待測分枝桿菌樣品的基因組DNA為模板，利用所述分枝桿菌屬特異引物進行PCR擴增，將得到的PCR擴增產物與所述分枝桿菌菌種檢測晶片進行雜交，根據雜交信號確定待測分枝桿菌的種。
所述待測分枝桿菌樣品為塗片抗酸染色陽性的分枝桿菌培養物或塗片抗酸染色陽性的痰標本。
所述雜交為導流雜交。
導流雜交技術使傳統的核酸分子雜交法二維平面分子間相互作用，提升到三維平面分子間相互作用，使傳統核酸分子雜交過程中分子被動滲入膜孔相互作用通過導流變為主動相互作用，提高了核酸分子間雜交效率，縮短了各操作步驟時間，操作簡便且節約試劑，降低試驗成本。
本發明具有以下特點1、設計的1對分枝桿菌屬引物，經研究試驗能擴增所試51種分枝桿菌菌種。
2、經研究試驗篩選，選擇分枝桿菌屬特異探針、結核分枝桿菌複合群特異探針和各種NTM種特異探針27種，製備檢測晶片。根據雜交信號，對分枝桿菌進行鑑定。該探針涵蓋了結核分枝桿菌複合群和臨床可見的各種致病性NTM菌種，同時為擴大鑑定範圍，還涵蓋了偶見致病性NTM菌種及自然界廣泛分布的腐物寄生NTM菌種，探針數量多。其優勢在於(1)、用於檢測、鑑定結核分枝桿菌複合群根據顯示分枝桿菌屬探針、結核分枝桿菌複合群探針雜交信號，檢測、鑑定結核分枝桿菌複合群。
(2)、用於檢測、鑑定各種NTM菌種根據顯示分枝桿菌屬探針，相應NTM種探針雜交信號，可檢測、鑑定堪薩斯分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、瘰癧分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產色分枝桿菌、胃分支桿菌、次要分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、施氏分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、淡黃分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、母牛分枝桿菌、金色-楚布分枝桿菌、新金色分枝桿菌。
(3)、用於檢測、鑑定結核分枝桿菌複合群與NTM菌種混合感染根據顯示分枝桿菌屬探針、結核分枝桿菌複合群探針、相應NTM種探針雜交信號，能檢測、鑑定結核分枝桿菌複合群與NTM菌種混合感染。
(4)、用於檢測、鑑別結核分枝桿菌複合群與NTM當檢測、鑑定膜晶片探針涵蓋之外的NTM菌種時，則顯示分枝桿菌屬探針雜交信號，能將其鑑定為NTM，但不能鑑定至種水平。
3、經研究試驗，建立了待測標本DNA模板製備方法-高溫裂解法。
(1)、固體培養基上分枝桿菌培養物取培養物少許加裂解液，煮沸、離心取上清用於PCR擴增。
(2)、液體培養基內分枝桿菌培養物取培養液離心後，沉澱加裂解液煮沸、離心取上清用於PCR擴增。
(3)、病人痰標本液化處理痰標本，洗滌後沉澱加裂解液煮沸、離心取上清用於PCR擴增。
本發明的試劑盒不僅能用於分枝桿菌培養物的鑑定，而且能從病人痰標本中直接檢測、鑑定結核分枝桿菌複合群及NTM菌種。
4、採用PCR-導流雜交技術，經研究試驗優化、確定最佳PCR擴增及導流雜交檢測條件，檢測分枝桿菌敏感性達102～103/ml菌細胞懸液，寡核苷酸探針特異性強，僅與相應分枝桿菌雜交，分枝桿菌菌種鑑定準確度高。
5、與傳統膜核酸分子雜交技術相比，導流雜交技術操作更為簡便、快速，雜交過程1～1.5小時。整個檢測過程從PCR擴增到雜交完成僅需約3.5小時～4小時。且節約試劑，降低試驗成本。
具體實施方式本發明以16S-23S rDNA ITS為靶基因序列，採用分枝桿菌屬共有的靶基因序列設計分枝桿菌屬特異引物及屬特異寡核苷酸探針，用所設計引物PCR擴增含有菌種變異區的基因片段。以菌種變異區設計一系列種或群特異寡核苷酸探針，按一定順序排列固定於尼龍膜載體上，製備檢測晶片(膜晶片)。本發明採用一種新型的核酸分子雜交技術方法，即PCR-導流雜交(flow-through hybridization)法，雜交檢測過程採用導流雜交儀，雜交過程可隨時根據需要調節作用溫度，其基本原理及操作方法為
1、在凱普導流雜交儀(HybriMax)內安裝入膜晶片(15孔模具)；2、在檢測孔內加入0.8ml雜交液作用2～3min，導流，預雜交；3、加入待測含生物素標記變性單鏈PCR擴增產物雜交液0.5ml作用5～10min，導流，單鏈靶核酸分子通過膜孔時，與固定於膜孔內相應寡核苷酸探針雜交結合，形成探針生物素標記靶核酸分子複合物；4、加入洗滌劑0.8ml，導流，未雜交結合分子穿過膜被洗滌清除，洗滌三次；5、加入阻斷劑0.5ml，導流，再加入阻斷劑0.5ml作用3～5min，導流，阻斷膜晶片上空白點；6、加鏈親和素-鹼性磷酸酶結合物(SA-AP)0.5ml作用3min，導流，SA-AP分子通過膜孔時，與探針-生物素標記靶核酸分子複合物結合；7、加入洗滌劑0.8ml，導流，未結合分子穿過膜被洗滌清除，洗滌四次；8、加入酶底物(NBT/BCIP溶液)0.5ml作用5～10min，導流，底物顯色；9、加入洗滌劑0.8ml，導流，終止顯色反應，洗滌二次；10、取出膜晶片，用蒸餾水漂洗後，自然乾燥。根據與相應屬、複合群、種特異探針雜交信號，鑑定分枝桿菌。
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
實施例1、分枝桿菌菌種檢測及鑑定試劑盒本試劑盒利用PCR技術和導流雜交技術原理，PCR擴增產物與固定分枝桿菌屬、結核分枝桿菌複合群和各種NTM菌種特異寡核苷酸探針的低密度膜晶片雜交，對分枝桿菌培養物，包括固體培養基和液體培養基培養物進行分枝桿菌菌種鑑定；也可直接從塗片抗酸染色(+)痰標本中檢測並鑑定分枝桿菌菌種。
一、試劑盒組成本發明的分枝桿菌菌種檢測及鑑定試劑盒由下述PCR試劑和導流雜交試劑組成，具體成分如下(一)PCR試劑
其中，裂解液由以下成分組成20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5％(V/V)TritonX-100，0.5％(V/V)NP-40溶液。
10倍PCR混合液由以下成分組成100mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，500mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，0.1mmol/L EGTA-Na2，0.2％(0.2g/100ml)BSA，1％(V/V)TritonX-100，各2mmol/L dATP、dUTP、dGTP、dCTP，各2μmol/L引物I、引物II，1.5U Taq DNA聚合酶/3μl 10倍PCR混合液，0.5U UNG酶/3ul 10倍PCR混合液。
其中，分枝桿菌屬特異引物I序列5』-ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC-3』5』端生物素標記；分枝桿菌屬特異引物II序列5』-GATGCTCGCAACCACTATCCA-3』陽性對照品滅活的106/ml結核分支桿菌菌細胞懸液。
陰性對照品滅菌去離子水。
上述PCR試劑在-20℃保存。
(二)導流雜交試劑
其中，溶液10.3mol/L NaCl，0.03mol/L檸檬酸三鈉，0.1％(0.g/100ml)SDS，用NaOH調pH至7.0。
溶液2阻斷劑(Surmodics公司產品)。
溶液30.1mol/L Tris-HCl(pH7.5)，0.15mol/L NaCl，0.1％(V/V)Tween-20。
溶液40.1mol/L Tris-HCl(pH9.5)，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2。
酶標記液由以下成分組成AP穩定劑(Surmodics公司產品)13000倍稀釋鏈親和素-鹼性磷酸酶結合物(streptavidin-Alkaline Phosphate Conjugate，SA-AP(Amershum公司產品))。
NBT溶液由以下成分組成75mg/ml NBT溶液，70％二甲基甲醯胺溶液配製。
BCIP溶液由以下成分組成50mg/ml BCIP溶液，二甲基甲醯胺溶液配製。
該試劑盒包括膜晶片A，膜晶片A′，膜晶片B，膜晶片B′，膜晶片C和膜晶片C′中的至少一種膜晶片A的分枝桿菌菌種檢測探針是表1中的探針編號為1a、2a、3a、4a、5a、6a、7a、8a、9a、10a、11a、12a、13a、14a、15a、16a、17a、18a、19a、20a、21a、22a、23a、24a、25a、26a、27a、28a、29a的29個寡核苷酸探針。
膜晶片A′的分枝桿菌菌種檢測探針是表1中的探針編號為1a′、2a′、3a、4a′、5a′、6a′、7a′、8a′、9a′、10a′、11a′、12a′、13a′、14a′、15a′、16a′、17a′、18a′、19a′、20a′、21a′、22a′、23a′、24a′、25a′、26a′、27a′、28a′、29a′的29個寡核苷酸探針。
膜晶片B′的分枝桿菌菌種檢測探針是表1中的探針編號為1a′、2b′、3b′、4a′、5b′、6a′、7a′、8a′、9a′、10a′、11b′、12a′、13a′、14a′、15a′、16a′、17a′、18a′、19a′、20b′、21a′、22a′、23a′、24a′、25a′、26a′、27a′、28a′、29b′的29個寡核苷酸探針。
膜晶片B的分枝桿菌菌種檢測探針是表1中的探針編號為1a、2b、3b、4a、5b、6a、7a、8a、9a、10a、11b、12a、13a、14a、15a、16a、17a、18a、19a、20b、21a、22a、23a、24a、25a、26a、27a、28a、29b的29個寡核苷酸探針。
膜晶片C的分枝桿菌菌種檢測探針是表1中的探針編號為1a、2a、3a、4a、5a、6a、7a、8a、9a、10a、11a、12a、13a、14a、15a、16a、17a、18a、19a、20a、21a、22a、23a、24a、25a、26a、27a、28a、29c的29個寡核苷酸探針。
膜晶片C′的分枝桿菌菌種檢測探針是表1中的探針編號為1a′、2b′、3b′、4a′、5b′、6a′、7a′、8a′、9a′、10a′、11b′、12a′、13a′、14a′、15a′、16a′、17a′、18a′、19a′、20 b′、21a′、22a′、23a′、24a′、25a′、26a′、27a′、28a′、29c′的29個寡核苷酸探針。
表1.分枝桿菌菌種檢測探針
膜晶片按照下述方法製備取5』端氨基修飾寡核苷酸探針定量溶解於NaHCO3(PH8.4)溶液內，分別取5～l0pmol按順序排列點於乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)活化處理過BiodyneC尼龍膜(Pall公司產品)上，待乾燥用NaOH溶液浸泡後，蒸餾水洗滌，乾燥後封存，4℃保存備用。
上述導流雜交試劑在4℃保存。
二、適用儀器各種型號的PCR擴增儀、Hybrimax醫用核酸分子快速雜交儀、電泳儀、水平電泳槽、凝膠支架板和梳子。
三、標本要求(1)改良羅氏等固體培養基培養物塗片抗酸染色(+)的分枝桿菌培養物。
(2)Bactec-T960 MGIT液體培養瓶或BacT ALERT 3D結核分枝桿菌液體培養瓶陽性培養物塗片抗酸染色(+)的分枝桿菌培養物。
(3)塗片抗酸染色(+)痰標本3～5ml，如當日不處理，置-20℃保存，保存期1個月。
四、操作方法(一)、樣品處理1、固體培養基培養物處理取固體培養基表面生長分枝桿菌物少許至1.5ml離心管內，加入裂解液50μl混勻，95℃～100℃加熱15～20min，12000rpm離心5min，取上清液為PCR反應模板。
2、液體培養基培養物處理取液體培養瓶內陽性培養物1～1.5ml至1.5ml離心管內，12000rpm離心10min，儘量除盡上清液，沉澱加入裂解液50μl混勻，95℃～100℃加熱15～20min，12000rpm離心5min，取上清液為PCR反應模板。
3、痰標本處理(1)、視痰液粘稠度向痰液中加入等量至2倍量液化劑，振蕩後室溫放置30～60min，中間振蕩數次，使之充分液化至清亮。液化劑自備，配製方法如下4％NaOH溶液及2.94％枸櫞酸三鈉溶液高壓滅菌後備用。使用前根據用量取4％NaOH溶液及2.94％枸櫞酸三鈉溶液等量混後，加入N-乙醯-L半胱氨酸終濃度5mg/ml，24h內使用。
(2)、取液化後痰液1ml至1.5ml離心管內，12000rpm離心10min，小心傾去上清液。
(3)、沉澱中加入1ml滅菌生理鹽水，振蕩混勻，12000rpm離心10min，小心傾去上清液。
(4)、重複步驟(3)，離心後用吸頭儘量吸盡全部上清液。
(5)、沉澱中加入50μl裂解液，充分振蕩混勻，95℃～100℃加熱15min，12000rpm離心5min，取上清液為PCR反應模板。
4、陽性和陰性對照品處理取陽性和陰性對照品，待融化後混勻，取5μl分別加至1.5ml離心管內，加入裂解液45μl混勻，95℃～100℃加熱15～20min，12000rpm離心5min，取上清液為PCR模板。
(二)、PCR擴增根據樣品數取10倍PCR混合液管，每管分別加滅菌去離子水24μl混勻，加DNA模板3μl混勻，稍離心後PCR擴增。每一批次同時擴增陽性對照和陰性對照各一份。
擴增條件先37℃ 10min；然後94℃ 5min；再94℃ 45sec，59℃ 45sec，72℃ 45sec共35循環；最後72℃ 7min。
(三)、瓊脂糖凝膠電泳1、試劑自備。
(1)50×Tris-冰乙酸(TAE)電泳緩衝液Tris 242.38克，冰乙酸57.1ml，1M EDTA(PH8.0)50ml，加蒸餾水溶解、定容至1000ml。使用前50倍稀釋(1×TAE電泳緩衝液)。
(2)10mg/ml溴化乙錠(EB)水溶液，置4℃避光保存。
(3)載樣緩衝液0.25％溴酚藍、40％蔗糖水溶液，置4℃保存。
2、方法(1)取瓊脂糖2克，加1×TAE緩衝液100ml，置微波爐內加熱或水浴煮沸溶解。加入10mg/ml EB水溶液10μl(終濃度5μg/ml)，輕輕混勻。
(2)用膠布條將電泳支持板兩端封住，放上梳子，梳子底邊應離開支持板表面1mm左右，待凝膠溶液冷卻至60℃左右，倒入，厚度約2～3mm。待凝膠完全凝固後，小心取出梳子，去掉膠布條，將其放入電泳槽內。倒入1×TAE電泳緩衝液，沒過凝膠2～3mm。EB為致癌劑，操作時應戴一次性手套。
(3)取PCR擴增產物5μl，加入載樣緩衝液1μl混勻後，加入凝膠樣品孔內。
(4)接通電源，在5V/cm左右電壓下電泳(樣品孔位於負極端)。
(5)電泳結束後關閉電源，取出凝膠，用紫外檢測儀或凝膠成像儀觀察結果。紫外線對人體眼睛和皮膚有損害，應使用防紫外線眼鏡和玻璃擋板防護。
3、結果陽性和陰性對照品應分別(+)和(-)。臨床樣品(+)擴增產物進行導流雜交。
(四)、導流雜交每個檢測樣品佔用分隔室一孔，以下試劑用量為單孔用量。
1、實驗前準備
(1)將雜交檢測試劑平衡至室溫。
(2)溶液1在使用前預熱至49℃。
(3)檢測樣品準備PCR產物98℃加熱變性5min立即至冰浴至少2～5min，在0.5ml溶液1內加入15～20μl變性PCR產物。
(4)NBT/BCIP顯色工作液配製根據用量配製NBT/BCIP顯色工作液。計算依據1ml用量1ml溶液4內加入4.5μl NBT溶液，混勻，再加入3.5μl BCIP溶液，混勻，24h內使用。
2、雜交儀準備(1)打開雜交儀的電源。
(2)在雜交儀後部的廢液出口安裝好廢液缸。
(3)根據控制板指示，選定[Manual Mode]，按[Enter]鍵進入溫度設定界面，輸入溫度49℃後，按[Enter]鍵確認並進行升溫。
(4)用蒸餾水充滿反應室，放置好金屬多孔板並打開水泵，排出多孔板上面的水份後，關閉水泵。
(5)用鑷子將膜晶片放置在金屬多孔板上。
(6)將相對應孔數的塑料薄膜放置在膜晶片上。
(7)在塑料薄膜上面放置矽膠封圈和分隔室。
(8)固定好壓扣蓋，固定時應對準反應室尾部兩個孔按下向前推到底。
(9)開泵排走殘留在膜上的水份後關泵。
3、雜交(1)在雜交儀準備好條件下，於49℃(±1℃)進行雜交。
(2)在檢測孔內加入0.8ml預熱的溶液1，蓋上蓋板孵育2～3min，開泵排出溶液，然後關泵。
(3)在檢測孔內加入0.5ml已準備好的檢測樣品，蓋上蓋板孵育5～10min，開泵排出溶液。
(4)在開著泵的條件下，用預熱的溶液1洗膜3次，每次0.8ml。在第二次洗膜後，按〔ESC〕鍵進入溫度修改界面，輸入溫度36℃後，按〔Enter〕鍵確認。不必降至36℃就進行第三次洗膜。
(5)在檢測孔內加入0.5ml溶液2，開泵排出溶液，關泵，再加入0.5ml溶液2，蓋上蓋板孵育5min，開泵排出溶液，關泵。
(6)溫度為36℃(±1℃)時，在檢測孔內加入0.5ml酶標記液，蓋上蓋板孵育3～5min，開泵排出溶液。
(7)在開著泵的條件下，用溶液3洗膜4次，每次0.8ml。
(8)關掉水泵。
(9)在檢測孔內加入0.5ml NBT/BCIP顯色工作液，蓋上蓋板顯色5～10min，開泵排出溶液。
(10)在開著泵的條件下，用溶液1洗膜2次，每次0.8ml。
(11)關掉水泵，打開壓扣蓋，取出分隔室，用鑷子取出雜交膜置蒸餾水內漂洗後，放在吸水紙上。
(四)、結果分析肉眼觀察，藍紫色斑點為陽性雜交信號，根據雜交信號分析判定結果。
五、局限性本試劑盒用於結核分枝桿菌複合群及29種NTM菌種檢測及鑑定。結核分枝桿菌複合群及29種NTM菌種以外的臨床極為罕見的分枝桿菌僅能初步鑑定為NTM，而不能鑑定至種。
六、試劑規格PCR試劑34人份/盒，導流雜交試劑30人份/盒。
七、保存條件PCR試劑保存於-20℃，避免多次反覆凍融。導流雜交試劑保存於4℃。有效期8個月。
實施例2、利用實施例1的試劑盒檢測分枝桿菌分枝桿菌及非分枝桿菌標準參考菌株來源於中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)和中國普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)。
分枝桿菌臨床分離菌株固體培養基培養物分別來自上海市肺科醫院(上海)，北京市結核病胸部腫瘤研究所(北京1)，北京市昌平區疾病控制中心(北京2)，深圳市疾病控制中心(深圳)，廣州市胸科醫院(廣州)，福建省南平市疾病控制中心(福建)。
液體培養基培養物分別來自瀋陽市胸科醫院(瀋陽)，重慶市胸科醫院(重慶)和解放軍總醫院第二附屬醫院(北京3)。
痰標本來自北京市肺科醫院(北京4)，北京1和北京3。
利用實施例1的試劑盒(包括膜晶片A，膜晶片A′，膜晶片B，膜晶片B′，膜晶片C和膜晶片C′)按照實施例1的方法，檢測表2中的51種分枝桿菌及10種非分枝桿菌標準參考菌株，表3中的分枝桿菌臨床分離株。膜晶片A，膜晶片A′，膜晶片B，膜晶片B′，膜晶片C和膜晶片C′的檢測結果均和標準參考菌株情況相符，並且與菌株的16S-23S rDNA ITS測序鑑定結果相符。
其中膜晶片A的檢測結果如表2和表3所示表2分枝桿菌及非分枝桿菌標準參考菌株PCR擴增及與特異探針雜交結果
表3 分枝桿菌臨床分離株(固體培養基培養物)鑑定結果
利用實施例1的試劑盒(包括膜晶片A，膜晶片A′，膜晶片B，膜晶片B′，膜晶片C和膜晶片C′)按照實施例1的方法，檢測液體培養基培養物和痰標本。膜晶片A、膜晶片A′、膜晶片B、膜晶片B′、膜晶片C和膜晶片C′的檢測結果均和菌株的16S-23S rDNA ITS測序鑑定結果相符液體培養基培養物81份(瀋陽)，試劑盒鑑定69份是結核分枝桿菌，12份是胞內分枝桿菌；液體培養基培養物2份(重慶)，試劑盒鑑定1份是膿腫分枝桿菌，1份是偶然分枝桿菌；液體培養基培養物5份(北京3)，試劑盒鑑定1份是胞內分枝桿菌，4份是膿腫分枝桿菌；抗酸染色陽性痰標本(+～++++)110份(北京1、北京3、北京4)，試劑盒鑑定102份是結核分枝桿菌，2份是胞內分枝桿菌，2份是瘰癧分枝桿菌，4份是膿腫分枝桿菌。
序列表16073210121121212DNA213人工序列220
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213人工序列220
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actatccata agtcaaagac cacac 252105221122212DNA213人工序列220
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40070ttctccgtag agcgaaggtc 2021071
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40072gacaacagca accgcctgac 202107321125212DNA213人工序列220
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40073ggcgacaaca gcaaccgcct gaccc 25
權利要求
1.分枝桿菌菌種檢測及鑑定試劑盒，包括分枝桿菌屬特異引物和分枝桿菌菌種檢測晶片；所述分枝桿菌菌種檢測晶片包括分枝桿菌菌種檢測探針；所述分枝桿菌菌種檢測探針由分枝桿菌屬特異探針，結核分枝桿菌複合群特異探針和以下27種分枝桿菌種特異探針組成堪薩斯分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、瘰癧分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、蟾蜍-施氏分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產色分枝桿菌、胃分支桿菌、次要分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、施氏分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、淡黃分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、母牛分枝桿菌、金色-迪氏-楚布分枝桿菌、新金色分枝桿菌特異探針；所述分枝桿菌屬特異引物為具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列的兩個寡核苷酸；所述分枝桿菌屬特異探針是至少具有序列表中序列3的核苷酸序列的寡核苷酸；所述結核分枝桿菌複合群特異探針是至少具有序列表中序列5和/或序列7的核苷酸序列的寡核苷酸；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列9和/或序列10的核苷酸序列的寡核苷酸；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列12的核苷酸序列的寡核苷酸；所述猿猴分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列14和/或序列16的核苷酸序列的寡核苷酸；所述瘰癧分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列18的核苷酸序列的寡核苷酸；所述戈登分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列20的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蘇加分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列22的核苷酸序列的寡核苷酸；所述鳥分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列24的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胞內分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列26的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列28和/或序列30的核苷酸序列的寡核苷酸；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列32的核苷酸序列的寡核苷酸；所述土地分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列34的核苷酸序列的寡核苷酸；所述不產色分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列36的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胃分支桿菌特異探針是至少具有序列表中序列38的核苷酸序列的寡核苷酸；所述次要分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列40的核苷酸序列的寡核苷酸；所述亞洲分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列42的核苷酸序列的寡核苷酸；所述施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列44的核苷酸序列的寡核苷酸；所述偶然分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列46的核苷酸序列的寡核苷酸；所述龜分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列48和/或序列50的核苷酸序列的寡核苷酸；所述膿腫分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列52的核苷酸序列的寡核苷酸；所述恥垢分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列54的核苷酸序列的寡核苷酸；所述草分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列56的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淡黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列58的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淺黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列60的核苷酸序列的寡核苷酸；所述迪氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列62的核苷酸序列的寡核苷酸；所述母牛分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列64的核苷酸序列的寡核苷酸；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列66的核苷酸序列的寡核苷酸；所述新金色分枝桿菌是至少具有序列表中序列68和/或序列70和/或序列72的核苷酸序列的寡核苷酸。
2.根據權利要求
1所述的試劑盒，其特徵在於所述分枝桿菌屬特異探針是序列表中序列3或序列4；所述結核分枝桿菌複合群特異探針是下述1)至4)中的任一種1)序列表中序列5和/或序列7；2)序列表中序列6和/或序列7；3)序列表中序列5和/或序列8；4)序列表中序列6和/或序列8；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是下述5)至6)中的任一種5)序列表中序列9和/或序列10；6)序列9和/或序列11；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是序列表中序列12或序列13；所述猿猴分枝桿菌特異探針是下述7)至10)中的任一種7)序列表中序列14和/或序列16；8)序列表中序列15和/或序列16；9)序列表中序列14和/或序列17；10)序列表中序列15和/或序列17；所述瘰癧分枝桿菌特異探針是序列表中序列18或序列19；所述戈登分枝桿菌特異探針是序列表中序列20或序列21；所述蘇加分枝桿菌特異探針是序列表中序列22或序列23；所述鳥分枝桿菌特異探針是序列表中序列24或序列25；所述胞內分枝桿菌特異探針是序列表中序列26或序列27；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是下述11)至14)中的任一種11)序列表中序列28和/或序列30；12)序列表中序列29和/或序列30；13)序列表中序列28和/或序列31；14)序列表中序列29和/或序列31；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是序列表中序列32或序列33；所述土地分枝桿菌特異探針是序列表中序列34或序列35；所述不產色分枝桿菌特異探針是序列表中序列36或序列37；所述胃分支桿菌特異探針是序列表中序列38或序列39；所述次要分枝桿菌特異探針是序列表中序列40或序列41；所述亞洲分枝桿菌特異探針是序列表中序列42或序列43；所述施氏分枝桿菌特異探針是序列表中序列44或序列45；所述偶然分枝桿菌特異探針是序列表中序列46或序列47；所述龜分枝桿菌特異探針是下述15)至18)中的任一種15)序列表中序列48和/或序列50；16)序列表中序列48和/或序列51；17)序列表中序列49和/或序列50；18)序列表中序列49和/或序列51；所述膿腫分枝桿菌特異探針是序列表中序列52或序列53；所述恥垢分枝桿菌特異探針是序列表中序列54或序列55；所述草分枝桿菌特異探針是序列表中序列56或序列57；所述淡黃分枝桿菌特異探針是序列表中序列58或序列59；所述淺黃分枝桿菌特異探針是序列表中序列60或序列61；所述迪氏分枝桿菌特異探針是序列表中序列62或序列63；所述母牛分枝桿菌特異探針是序列表中序列64或序列65；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是序列表中序列66或序列67；所述新金色分枝桿菌是是下述19)至22)中的任一種19)序列表中序列68和/或序列70和/或序列72；20)序列表中序列69和/或序列70和/或序列72；21)序列表中序列68和/或序列71和/或序列73；22)序列表中序列69和/或序列71和/或序列73。
3.分枝桿菌菌種檢測晶片，包括分枝桿菌屬特異探針，結核分枝桿菌複合群特異探針和以下分枝桿菌種特異探針堪薩斯分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、瘰癧分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、蟾蜍-施氏分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產色分枝桿菌、胃分支桿菌、次要分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、施氏分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、淡黃分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、母牛分枝桿菌、金色-迪氏-楚布分枝桿菌、新金色分枝桿菌種特異探針；所述分枝桿菌屬特異探針是至少具有序列表中序列3的核苷酸序列的寡核苷酸；所述結核分枝桿菌複合群特異探針是至少具有序列表中序列5和/或序列7的核苷酸序列的寡核苷酸；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列9和/或序列10的核苷酸序列的寡核苷酸；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列12的核苷酸序列的寡核苷酸；所述猿猴分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列14和/或序列16的核苷酸序列的寡核苷酸；所述瘰癧分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列18的核苷酸序列的寡核苷酸；所述戈登分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列20的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蘇加分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列22的核苷酸序列的寡核苷酸；所述鳥分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列24的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胞內分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列26的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列28和/或序列30的核苷酸序列的寡核苷酸；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列32的核苷酸序列的寡核苷酸；所述土地分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列34的核苷酸序列的寡核苷酸；所述不產色分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列36的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胃分支桿菌特異探針是至少具有序列表中序列38的核苷酸序列的寡核苷酸；所述次要分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列40的核苷酸序列的寡核苷酸；所述亞洲分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列42的核苷酸序列的寡核苷酸；所述施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列44的核苷酸序列的寡核苷酸；所述偶然分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列46的核苷酸序列的寡核苷酸；所述龜分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列48和/或序列50的核苷酸序列的寡核苷酸；所述膿腫分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列52的核苷酸序列的寡核苷酸；所述恥垢分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列54的核苷酸序列的寡核苷酸；所述草分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列56的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淡黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列58的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淺黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列60的核苷酸序列的寡核苷酸；所述迪氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列62的核苷酸序列的寡核苷酸；所述母牛分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列64的核苷酸序列的寡核苷酸；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列66的核苷酸序列的寡核苷酸；所述新金色分枝桿菌是至少具有序列表中序列68和/或序列70和/或序列72的核苷酸序列的寡核苷酸。
4.根據權利要求
3所述的分枝桿菌菌種檢測晶片，其特徵在於所述分枝桿菌屬特異探針是序列表中序列3或序列4；所述結核分枝桿菌複合群特異探針是下述1)至4)中的任一種1)序列表中序列5和/或序列7；2)序列表中序列6和/或序列7；3)序列表中序列5和/或序列8；4)序列表中序列6和/或序列8；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是下述5)至6)中的任一種5)序列表中序列9和/或序列10；6)序列9和/或序列11；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是序列表中序列12或序列13；所述猿猴分枝桿菌特異探針是下述7)至10)中的任一種7)序列表中序列14和/或序列16；8)序列表中序列15和/或序列16；9)序列表中序列14和/或序列17；10)序列表中序列15和/或序列17；所述瘰癧分枝桿菌特異探針是序列表中序列18或序列19；所述戈登分枝桿菌特異探針是序列表中序列20或序列21；所述蘇加分枝桿菌特異探針是序列表中序列22或序列23；所述鳥分枝桿菌特異探針是序列表中序列24或序列25；所述胞內分枝桿菌特異探針是序列表中序列26或序列27；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是下述11)至14)中的任一種11)序列表中序列28和/或序列30；12)序列表中序列29和/或序列30；13)序列表中序列28和/或序列31；14)序列表中序列29和/或序列31；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是序列表中序列32或序列33；所述土地分枝桿菌特異探針是序列表中序列34或序列35；所述不產色分枝桿菌特異探針是序列表中序列36或序列37；所述胃分支桿菌特異探針是序列表中序列38或序列39；所述次要分枝桿菌特異探針是序列表中序列40或序列41；所述亞洲分枝桿菌特異探針是序列表中序列42或序列43；所述施氏分枝桿菌特異探針是序列表中序列44或序列45；所述偶然分枝桿菌特異探針是序列表中序列46或序列47；所述龜分枝桿菌特異探針是下述15)至18)中的任一種15)序列表中序列48和/或序列50；16)序列表中序列48和/或序列51；17)序列表中序列49和/或序列50；18)序列表中序列49和/或序列51；所述膿腫分枝桿菌特異探針是序列表中序列52或序列53；所述恥垢分枝桿菌特異探針是序列表中序列54或序列55；所述草分枝桿菌特異探針是序列表中序列56或序列57；所述淡黃分枝桿菌特異探針是序列表中序列58或序列59；所述淺黃分枝桿菌特異探針是序列表中序列60或序列61；所述迪氏分枝桿菌特異探針是序列表中序列62或序列63；所述母牛分枝桿菌特異探針是序列表中序列64或序列65；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是序列表中序列66或序列67；所述新金色分枝桿菌是是下述19)至22)中的任一種19)序列表中序列68和/或序列70和/或序列72；20)序列表中序列69和/或序列70和/或序列72；21)序列表中序列68和/或序列71和/或序列73；22)序列表中序列69和/或序列71和/或序列73。
5.用於分枝桿菌菌種檢測的探針，由分枝桿菌屬特異探針，結核分枝桿菌複合群特異探針和分枝桿菌種特異探針組成；所述分枝桿菌種特異探針由以下探針組成堪薩斯分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、瘰癧分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、蟾蜍-施氏分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產色分枝桿菌、胃分支桿菌、次要分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、施氏分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、淡黃分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、母牛分枝桿菌、金色-迪氏-楚布分枝桿菌、新金色分枝桿菌種特異探針；所述分枝桿菌屬特異探針是至少具有序列表中序列3的核苷酸序列的寡核苷酸；所述結核分枝桿菌複合群特異探針是至少具有序列表中序列5和/或序列7的核苷酸序列的寡核苷酸；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列9和/或序列10的核苷酸序列的寡核苷酸；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列12的核苷酸序列的寡核苷酸；所述猿猴分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列14和/或序列16的核苷酸序列的寡核苷酸；所述瘰癧分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列18的核苷酸序列的寡核苷酸；所述戈登分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列20的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蘇加分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列22的核苷酸序列的寡核苷酸；所述鳥分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列24的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胞內分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列26的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列28和/或序列30的核苷酸序列的寡核苷酸；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列32的核苷酸序列的寡核苷酸；所述土地分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列34的核苷酸序列的寡核苷酸；所述不產色分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列36的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胃分支桿菌特異探針是至少具有序列表中序列38的核苷酸序列的寡核苷酸；所述次要分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列40的核苷酸序列的寡核苷酸；所述亞洲分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列42的核苷酸序列的寡核苷酸；所述施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列44的核苷酸序列的寡核苷酸；所述偶然分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列46的核苷酸序列的寡核苷酸；所述龜分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列48和/或序列50的核苷酸序列的寡核苷酸；所述膿腫分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列52的核苷酸序列的寡核苷酸；所述恥垢分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列54的核苷酸序列的寡核苷酸；所述草分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列56的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淡黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列58的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淺黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列60的核苷酸序列的寡核苷酸；所述迪氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列62的核苷酸序列的寡核苷酸；所述母牛分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列64的核苷酸序列的寡核苷酸；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列66的核苷酸序列的寡核苷酸；所述新金色分枝桿菌是至少具有序列表中序列68和/或序列70和/或序列72的核苷酸序列的寡核苷酸。
6.根據權利要求
5所述的探針，其特徵在於所述分枝桿菌屬特異探針是序列表中序列3或序列4；所述結核分枝桿菌複合群特異探針是下述1)至4)中的任一種1)序列表中序列5和/或序列7；2)序列表中序列6和/或序列7；3)序列表中序列5和/或序列8；4)序列表中序列6和/或序列8；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是下述5)至6)中的任一種5)序列表中序列9和/或序列10；6)序列9和/或序列11；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是序列表中序列12或序列13；所述猿猴分枝桿菌特異探針是下述7)至10)中的任一種7)序列表中序列14和/或序列16；8)序列表中序列15和/或序列16；9)序列表中序列14和/或序列17；10)序列表中序列15和/或序列17；所述瘰癧分枝桿菌特異探針是序列表中序列18或序列19；所述戈登分枝桿菌特異探針是序列表中序列20或序列21；所述蘇加分枝桿菌特異探針是序列表中序列22或序列23；所述鳥分枝桿菌特異探針是序列表中序列24或序列25；所述胞內分枝桿菌特異探針是序列表中序列26或序列27；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是下述11)至14)中的任一種11)序列表中序列28和/或序列30；12)序列表中序列29和/或序列30；13)序列表中序列28和/或序列31；14)序列表中序列29和/或序列31；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是序列表中序列32或序列33；所述土地分枝桿菌特異探針是序列表中序列34或序列35；所述不產色分枝桿菌特異探針是序列表中序列36或序列37；所述胃分支桿菌特異探針是序列表中序列38或序列39；所述次要分枝桿菌特異探針是序列表中序列40或序列41；所述亞洲分枝桿菌特異探針是序列表中序列42或序列43；所述施氏分枝桿菌特異探針是序列表中序列44或序列45；所述偶然分枝桿菌特異探針是序列表中序列46或序列47；所述龜分枝桿菌特異探針是下述15)至18)中的任一種15)序列表中序列48和/或序列50；16)序列表中序列48和/或序列51；17)序列表中序列49和/或序列50；18)序列表中序列49和/或序列51；所述膿腫分枝桿菌特異探針是序列表中序列52或序列53；所述恥垢分枝桿菌特異探針是序列表中序列54或序列55；所述草分枝桿菌特異探針是序列表中序列56或序列57；所述淡黃分枝桿菌特異探針是序列表中序列58或序列59；所述淺黃分枝桿菌特異探針是序列表中序列60或序列61；所述迪氏分枝桿菌特異探針是序列表中序列62或序列63；所述母牛分枝桿菌特異探針是序列表中序列64或序列65；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是序列表中序列66或序列67；所述新金色分枝桿菌是是下述19)至22)中的任一種19)序列表中序列68和/或序列70和/或序列72；20)序列表中序列69和/或序列70和/或序列72；21)序列表中序列68和/或序列71和/或序列73；22)序列表中序列69和/或序列71和/或序列73。
7.用於分枝桿菌菌種檢測的引物，是具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列的兩個寡核苷酸。
8.一種利用權利要求
1或2所述的試劑盒檢測分枝桿菌的方法，是以待測分枝桿菌樣品的基因組DNA為模板，利用所述分枝桿菌屬特異引物進行PCR擴增，將得到的PCR擴增產物與所述分枝桿菌菌種檢測晶片進行雜交，根據雜交信號確定待測分枝桿菌的種。
9.根據權利要求
8所述的方法，其特徵在於所述待測分枝桿菌樣品為塗片抗酸染色陽性的分枝桿菌培養物或塗片抗酸染色陽性的痰標本。
10.根據權利要求
8或9所述的方法，其特徵在於所述雜交為導流雜交。
專利摘要
本發明公開了一種檢測和鑑定分枝桿菌菌種的方法及其專用試劑盒。該分枝桿菌菌種檢測及鑑定試劑盒，包括分枝桿菌屬特異引物和分枝桿菌菌種檢測晶片；所述分枝桿菌菌種檢測晶片包括分枝桿菌菌種檢測探針；所述分枝桿菌菌種檢測探針由分枝桿菌屬特異探針，結核分枝桿菌複合群特異探針和27個分枝桿菌種特異探針組成。本發明所提供的利用上述試劑盒檢測分枝桿菌的方法，是以待測分枝桿菌樣品的基因組DNA為模板，利用所述分枝桿菌屬特異引物進行PCR擴增，將得到的PCR擴增產物與所述分枝桿菌菌種檢測晶片進行雜交，根據雜交信號判定待測分枝桿菌。
文檔編號C12Q1/04GK1995380SQ200610000496
公開日2007年7月11日 申請日期2006年1月5日
發明者李國利, 莊玉輝 申請人:中國人民解放軍總醫院第二附屬醫院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan