利用轉基因真菌生產人胰島素的方法
2023-06-30 17:25:06
專利名稱：利用轉基因真菌生產人胰島素的方法
技術領域：
本發明是利用轉基因真菌做為一種生物反應器來製造人胰島素的方法。所選用的真菌受體包括食用和藥用的高等擔子菌如蘑菇、靈芝等。這些高等真菌無毒，可以直接服用，同時也可以從它們的菌絲中分離胰島素成分製成注射用的人胰島素。
本發明的主要創新之點在於(1)人工合成胰島素基因，選用適合於高等真菌和植物中表達的密碼子來設計其DNA序列；(2)採用在真菌中高效表達的甘油醛磷酸脫氫酶基因的5端調控區的順序來驅動人胰島素的表達；(3)在受體真菌中引入來自透明顫菌(Vitreoscilla)的血紅蛋白基因。該基因的表達，促進需氧代謝的進行。大大提高了人胰島素生物合成的產量。
生物反應器是近年來許多生物技術研究部門十分關注的領域。諸如奶牛、奶山羊乳腺生物反應器生產人的生長因子。在植物生物反應器中利用馬鈴薯生產B肝疫苗的研究受到廣泛的重視。北京大學林忠平等人利用番茄生產多肽藥物亦已取得良好結果。利用可以食用的蘑菇、香菇、靈芝一類高等真菌生產多肽成分具有很大的應用潛力。因為這些高等真菌能夠完成對於多肽的摺疊、糖基化修飾等功能，且有生長迅速、易於培養、不產生毒性物質的優點。
人胰島素對於胰島素依賴的糖尿病患者的治療十分重要。
本項發明的技術要點如下(1)關於人胰島的DNA序列將人胰島素的兩個功能單位A鏈與B鏈的胺基酸順序，採用真菌常用的或植物偏愛的密碼子進行人工合成。A鏈與B鏈之間有一小的(含6個胺基酸)的連接片段。(2)關於啟動子的採用採用在真菌中表達量很高的甘油醛磷酸脫氫酶(gluceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GPD)基因的5端調控區。本專利申請人克隆了該基因的上遊區，並經實驗證實1400bp的序列可以驅動報告基因(GUS或GFP)在真菌中高水平表達。
(3)關於透明顫菌血紅蛋白基因的應用近年來的研究表明來自透明顫菌(Vitreoscilla)的血紅蛋白(hemoglobin)有很高的氧解離常數。將該基因導入細菌、真菌、酵母、高等動植物等各類生物後可以促進這些生物的需氧代謝。尤其在氧受限的條件下，此血紅蛋白基因的作用更加明顯。例如導入透明顫菌血紅蛋白(VHb)基因的(Acremanun chrysogenum)顯著增加了頭孢黴素C的產量。VHb基因還使紅色糖多孢菌增加紅黴素產量70％。VHb基因在靈芝中明顯提高了外源胰島素基因的表達量。
(4)本項發明在引入人胰島素基因的同時，採用真菌高效啟動子驅動的VHb基因。在我們的一種實驗中在外源基因表達載體上同時含有GPD啟動子驅動下的人胰島素基因和GPD啟動子調控下的VHb基因。
其餘的技術要點包括真菌菌絲體獲得原生質體、對真菌原生質體的遺傳轉化、真菌轉化中標記基因的選擇、轉化的真菌細胞的篩選，以及轉基因真菌的鑑定。目的基因產物人胰島素表達量的測定等。
關於本發明的實施方案在一個實施方案中關於人胰島素基因的合成。在以植物偏愛密碼子合成人胰島素A鏈(63個鹼基)和B鏈(90個鹼基)DNA序列的基礎上，依據真菌對密碼子使用的偏愛性又做了適當的更動。將A鏈與B鏈組成的人胰島素基因克隆於pGEM-11zf(+/-)載體上。見圖一人工合成的人胰島素基因的克隆。
在一個實施方案中我們將人胰島素基因置於甘油醛磷酸脫氫酶基因5』端調控之下。見圖二人工合成的人胰島素基因表達載體的構建流程圖(其中人胰島素基因處於香菇組成型啟動子PLeGPD的控制下)。
在一個實施方案中我們完成了香菇甘油醛磷酸脫氫酶LeGPD啟動子驅動下透明顫菌血紅蛋白基因(VHb)表達質粒的構建。見圖三透明顫菌血紅蛋白(Vhb)基因表達載體的構建流程圖(其中vhb處於香菇組成型啟動子PLeGPD的控制下)。
在一個實施方案中我們按圖四含vhb的人胰島素基因表達載體的構建流程圖(其中vhb及人胰島素基因均處於香菇組成型啟動子PLeGPD的控制下)構建了同時含有磨菇甘油醛磷酸脫氫酶啟動子(LeGPD)驅動的人胰島素基因(Ins)和透明顫菌血紅蛋白(VHb)基因的表達質粒。
在一個實施方案中我們採用下列程序進行真菌原生質體的製備和真菌遺傳轉化。其程序(藥用蕈菌靈芝的遺傳轉化)如下1、靈芝菌絲培養條件菌絲培養於CYM瓊脂培養基(1％麥芽糖，2％葡萄糖，0.2％酵母抽提物，0.2％胰蛋白腖，0.05％MgSO4·7H2O，0.46％KH2PO4，1％瓊脂)並在26℃下保溫3天，加入玻璃小球，每天振蕩2次使之分散，而後將菌絲置於0.6M甘露醇溶液中用於製備原生質體。
2、原生質體的製備和電激從200ml菌絲培養液收集菌體，無菌水洗滌，在含有1.5mg/ml融壁酶的1ml 0.6M甘露醇溶液溶液中緩慢搖動下30℃孵育4小時。以棉花過濾和離心(500xg，5分鐘)收集的方法得到原生質體。以0.6M甘露醇溶液洗原生質體2次。重懸浮於200μl緩衝液進行一次電激處理(電極距離0.4cm，1.0kV，25μF，400Ω)，質粒DNA濃度為1μg/μl。電激處理原生質體在4℃下放置15分鐘後混入1％低熔點膠中鋪在20ml含CYM的1％瓊脂糖板上26℃培養7天，在5-7天內在CYM板上可長出轉化體。參考文獻[1]Patel SM，Stark BC，Hwang KW，Dikshit KL，Webster DA.Cloning andexpression of Vitreoscilla hemoglobin gene in Burkholderia sp.strain DNT forenhancement ..of. 2，4-dinitrotoluene.degradation......Biotechnol.....Prog.2000，Jan-Feb；16(1)26-30.[2]Penttia M，Nevalainen H，Ratto M，Salminen E，Knowles J.A versatiletransformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei.Gene.1987，61155-164[3] T.Hirano，T.Sato，K.Yaegashi，H.Enei.Efficient transformation of the ediblebasidiomycete Lentinus edodes with a vector using a glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase promoter to hygromycin B resistance.Mol Gen Genet.2000，2631047-105權利要求
1.向真菌導入外源的人工合成的人胰島素基因，獲得能高效表達人胰島素的真菌。其中人工合成的胰島素基因的密碼子的採用，應包括不同生物偏愛的密碼子的改造。包括採用植物、真菌及其它物種的偏愛性的密碼子。
2.權利要求1中，人胰島素基因的合成包括其它完整人胰島素基因或和部分人胰島素基因序列的合成與應用，以及人胰島素基因與其它多肽序列的融合基因的合成與應用。
3.權利要求1中的人胰島素基因是置於一種在真菌中高效表達的啟動子的驅動之下。這種啟動子應包括所有可在真菌中調控人胰島素基因的DNA序列。
4.權利要求1中關於人胰島素基因的高效表達。在說明書中已提到採用一種來自細菌的血紅蛋白基因以促進真菌的需氧代謝，從而提高人胰島素的產量。所以導入的外源基因，除人胰島素基因的啟動子序列之外，還應包括另外的增強人胰島素表達的另外的外源基因的應用。
5.權利要求1中涉及導入外源基因的方法。除了在實施方案中提到的電激方法，還應包括其它方法，如基因槍法和通過PEG的應用、PH和Ca離子的調節等方法將外源基因導入真菌細胞。
6.權利要求1中，將外源基因導入真菌細胞，既包括菌絲體細胞及其原生質體，也包括直接將基因導入真菌的孢子和真菌的其它類型組織，如子實體。
全文摘要
本發明以蕈菌和絲狀真菌為生物反應器生產人胰島素。人胰島素基因的兩個功能單位由人工合成並置於高效表達的真菌專一性啟動子(如甘油醛磷酸脫氫酶基因的5端調控區)的驅動之下。同時有來自透明顫菌的血紅蛋白基因在該啟動子驅動下表達,使在氧受限的條件下胰島素表達量大增。本發明對於人胰島素大量製備和防治某些類型的糖尿病有重要意義。
文檔編號C12N15/17GK1376778SQ0110990
公開日2002年10月30日 申請日期2001年3月22日 優先權日2001年3月22日
發明者林忠平, 孫麗, 蔡華清, 胡鳶雷, 倪挺 申請人:林忠平