一種檢測早期癌症的試劑盒及方法

2023-06-16 16:00:01

專利名稱：一種檢測早期癌症的試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及醫學及藥學領域。更具體地涉及一種檢測早期癌症的試劑盒，適用於消化道癌的檢測，同時還涉及一種檢測的方法。
背景技術：
據統計，我國每年新患癌症的病人約160萬人，每年因癌症死亡的人數約130萬人。我國大、中城市居民的許多死亡原因中，癌症是第一位死因，在農村的各項死因中，癌症是第二位死因。對中、老年人來說癌症是多發病、常見病。按目前的醫療水平，對早期癌症病人的治療約有80％-90％以上可以治癒；但是，晚期的癌症病人，在治療後能生存5年以上的人，就比較少了。早期癌症病人治療後，不僅提高了生存率，同時也提高了病人的生存質量。癌症病人的死亡率隨之也降下來了。早期癌症病人的治療要比晚期癌症病人的治療節省許多人力、財力和時間。因此，癌症早期發現即早期診斷就顯得尤為重要。
癌症檢測主要是檢測腫瘤標誌物。腫瘤標誌物種類很多，目前發現的已有100多種，可分為酶類腫瘤標誌物，如ALP、LD等，激素類標誌物，如CT、hCG等，胚胎抗原，如AFP、CEA，特種蛋白類抗原，如CK、TPA、TPS，糖蛋白類抗原，如CA125、CA15-3、CA19-9等，血中癌基因蛋白，如ras基因蛋白、myc基因蛋白等。每種標誌物都有其檢測方法，但絕大多數都是檢測血液，因此是一種有損檢測方式，而檢測尿液中的L-巖藻糖只需以人的尿液作標本，對人無損傷，因此更容易被人們接受。已有的檢測L-巖藻糖的方法主要是利用L-巖藻糖脫氫酶催化L-巖藻糖脫氫還原NAD+或NADH，而NADH在340nm光波下有吸光度，根據其吸光度變化來測定L-巖藻糖的濃度(NODA SANGYOKAGAKU KBNKYUSHO專利號JP2084177；TADARA SHUZO COLTD(TAKI)專利號，DE3702159-A1，DE3702159-A，JP62175197A，DE3702159-C，AraKiE，et.al.RinshoByori1992 Aug，40(8)，86874，SaKaiT，et.al，Clinchem，1990 Mar；36(3)474-6)。測定NADH 340nm下的光吸收需紫外光度分析儀或專門的分析儀，而且需要專門的技術人員操作，使用起來不是很方便，檢測費用較高，不便於推廣。

發明內容
本發明的目的是在於提供一種檢測早期癌症的試劑盒，利用L-巖藻糖脫氫還原NAD+生成NADH後還原NBT而生成有色物質而顯色，而且在L-巖藻糖正常含量下不顯色，在癌變情況下，L-巖藻糖超出正常範圍可以顯色。檢測結果非常直觀，肉眼可見，檢測效果高，消化道癌陽性率可達85-90％。
本發明的另一個目的在於提供一種早期癌症試劑盒的檢測方法，方法易行，普通的醫務人員操作方便。
為了達到上述任務，本發明採用以下技術措施試劑盒組成由A-液、B-液、C-液組成。其中A-液由0.1-1mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-Cl)緩衝液(pH8.0-8.5)配製而成，每升內含0.663-6.63克氧化型輔酶I(NAD+)、0.1-1.0克氯化硝基四氮唑藍(NBT)，B-液是0.01-0.1mol/L甲基吩嗪甲基硫酸鹽(PMS)水溶液，C-液為L-巖藻糖脫氫酶(50-100U/ml)組成；檢測步驟為A、從新鮮豬肝中提取L-巖藻糖脫氫酶新鮮豬肝250克用組織搗碎機勻漿，然後加1L0.25mol/L蔗糖，25000g離心20min，棄沉澱取上清，加450ml飽和硫酸銨，放置15min後25000g離心20min，棄沉澱取上清，加400ml飽和硫酸銨，放置15min後25000g離心20min，棄上清去沉澱，用0.005mol/L磷酸鹽緩衝液(PBS)透析，取透析液上二乙胺基乙基(DEAE)纖維素柱(DE52)，用含0.05-0.15mol/L氯化鈉(NaCl)的0.005mol/L磷酸鹽緩衝液(PBS)梯度洗脫，收集0.1-0.15mol/L氯化鈉(NaCl)的洗脫部分經濃縮，測定L-巖藻糖脫氫酶，放置-70℃冰箱備用。
B、採用試劑盒中的A-液、B-液和C-液；C、檢測方法取病人尿液50-100μl，加入A-液10-50μl、B-液1-10μl、C-液50-100μl，37C保溫10-20min觀察反應顯色為藍色或藍紫色為陽性，陰性對照應為黃色。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果從豬肝中提取L-巖藻糖脫氫酶原料價格非常便宜且容易獲得，因而成本低。用尿液作檢測標本對病人無損傷，試劑盒使用起來操作非常簡單，結果觀察不需要任何儀器，肉眼就可以觀察，非常直觀，易於推廣。試劑成本低，價格便宜，適合於作普查或篩查。
檢測效果消化道癌(包括胰腺癌、食管癌、胃癌、腸癌和肝癌等)，陽性率可達85-90％。
具體實施例方式
1、L-巖藻糖脫氫酶的分離、提取從新鮮豬肝中提取L-巖藻糖脫氫酶新鮮豬肝250克用組織搗碎機勻漿，然後加1L0.25mol/L蔗糖，25000g離心20min，棄沉澱取上清，加450ml飽和硫酸銨，放置15min後25000g離心20min，棄沉澱取上清，加400ml飽和硫酸銨，放置15min後25000g離心20min，棄上清去沉澱，用0.005M磷酸鹽緩衝液(PBS)透析，取透析液上二乙胺基乙基(DEAE)纖維素柱(DE52)，用含0.05-0.15mol/L氯化鈉(NaCl)的0.005mol/L磷酸鹽緩衝液(PBS)梯度洗脫，收集0.1-0.15mol/L氯化鈉(NaCl)的洗脫部分經濃縮，測定L-巖藻糖脫氫酶，放置-70℃冰箱備用。
2、試劑盒組成A-液由0.1或0.3或0.5或0.7或0.9或1mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-Cl)緩衝液(pH為8.0或8.2或8.3或8.5配製而成，每升內含0.663或0.665或0.76或1.8或2.65或3.98或4.56或5.8或6.2或6.45或6.63克氧化型輔酶I(NAD+)、0.1或0.3或0.5或0.7或0.9或1克氯化硝基四氮唑藍(NBT)；B-液0.01或0.03或0.05或0.08或0.1mol/L甲基吩嗪甲基硫酸鹽(PMS)；C-液L-巖藻糖脫氫酶(50或55或60或68或74或88或95或100U/ml)組成；3、檢測方法取病人尿液50μl或75μl或100μl，分別加入A-液10μl或25μl或50μl，B-液1μl或5μl或10μl，C-液50μl或100μl，混勻後，37℃保溫10-20min，觀察反應結果顯色為藍色或藍紫色為陽性，陰性對照則為黃色。
4、臨床樣品的檢測用構建的試劑盒檢測來自湖北省腫瘤醫院、武漢大學中南醫院、武漢大學人民醫院、華中科技大學同濟醫院的腫瘤病人的尿液樣本。共檢測消化道癌58側(肝癌、食管癌、胃癌、腸癌、胰腺癌)、乳腺癌28側、宮頸癌25側、肺癌33側、淋巴癌10側，檢測結果列於表1。
表1、用癌症早期診斷試劑盒檢測腫瘤病人尿液標本的檢測結果

權利要求
1.一種檢測早期癌症的試劑盒，其特徵在於試劑盒中的A-液為0.1-1mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩衝液，pH8.0-8.5，每升內含0.663-6.63克氧化型輔酶I、0.1-1克氯化硝基四氮唑藍，B-液為0.01-0.1mol/L甲基吩嗪甲基硫酸鹽，C-液為L-巖藻糖脫氫酶50-100U/ml。
2.一種用於實現權利要求1所述的檢測早期癌症的試劑盒的方法，它包括下列步驟A、從豬肝中提取L-巖藻糖脫氫酶新鮮豬肝250克用組織搗碎機勻漿，然後加1L 0.25M mol/L蔗糖，25000g離心20min，棄沉澱取上清，加450ml飽和硫酸銨，放置15min後25000g離心20min，棄沉澱取上清，加400ml飽和硫酸銨，放置15min後25000g離心20min，棄上清去沉澱，用0.005M磷酸鹽緩衝液透析，取透析液上二乙胺基乙基纖維素柱，用含0.05-0.15mol/L氯化鈉的0.005mol/L磷酸鹽緩衝液梯度洗脫，收集0.1-0.15mol/L氯化鈉的洗脫經濃縮，測定L-巖藻糖脫氫酶，放置-70℃冰箱備用；B、採用試劑盒中的溶液；C、檢測取病人尿液50-100μl，分別加入A-液10-50μl、B-液1-10μl、C-液50-100μl，混勻後，37℃保溫10-20min，觀察反應結果顯色為藍色或藍紫色為陽性，陰性對照則為黃色。
全文摘要
本發明公開了一種檢測早期癌症的試劑盒及方法，該試劑盒包括A－液、B－液、C－液，其步驟是首先從豬肝中提取L－巖藻糖脫氫酶，置－70℃冰箱備用；其次是採用試劑盒中的溶液；然後是取病人尿液，分別加入A－液、B－液、C－液，保溫，觀察反應，檢測結果非常直觀，肉眼可見，檢測效果高，消化道癌陽性率可達85－90％。本發明方法易行，普通的醫務人員操作方便。
文檔編號G01N1/34GK1773261SQ20051001973
公開日2006年5月17日 申請日期2005年11月3日 優先權日2005年11月3日
發明者吳建國, 鄔開朗, 劉芳, 朱應, 祝成亮 申請人:武漢大學