一種促凋亡重組卡介苗及其製備方法

2023-06-16 16:52:41 1

一種促凋亡重組卡介苗及其製備方法
【專利摘要】本發明屬於遺傳工程和結核病疫苗研究【技術領域】，具體為一種促凋亡重組卡介苗及其製備方法。其通過在大腸桿菌—分枝桿菌穿梭質粒pMV261中依次插入結核保護性抗原Ag85B和促細胞凋亡基因BAX先得到重組質粒，再將重組質粒電轉入BCG而獲得。與BCG相比，本發明所構建的重組卡介苗rBCG::Ag85B—BAX具有較強的誘導巨噬細胞發生凋亡的能力，有望提高機體對結核分枝桿菌的免疫力。另一方面，與BCG相比，本發明重組卡介苗誘導機體產生的細胞免疫以Th1為主導，更利於形成抗結核分枝桿菌的免疫保護力。因此，本發明的重組卡介苗rBCG::Ag85B—BAX有望成為新的有效抗結核疫苗，具有較大的研發潛力。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及遺傳工程和結核病疫苗研究【技術領域】，具體涉及一種促凋亡重組卡介 苗及其製備方法。 一種促凋亡重組卡介苗及其製備方法

【背景技術】
[0002] 全球三分之一的人口已經感染結核分枝桿菌。卡介苗（BCG)是目前唯一可用的抗 結核病疫苗。雖然BCG能有效預防嬰幼兒結核性腦膜炎和粟粒性肺結核，但BCG對成人肺 結核的預防保護效果為0-80%。儘管使用BCG已經90多年，每年仍有130萬人死於結核病。 而且耐多藥結核病（MDR-TB)、廣泛耐藥結核病（XDR-TB)和HIV-TB共感染使全球結核病防 治形勢更加嚴峻。
[0003] BCG對幼兒預防結核病具有明顯保護效果，而且價格低廉，安全性已得到多年實踐 證明，因此，將現有的BCG進行改造以獲得更好的保護效果是一條明智的策略。


【發明內容】

[0004] 為了克服現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種促凋亡重組卡介苗。與BCG 相比，本發明所構建的重組卡介苗具有較強的誘導巨噬細胞發生凋亡的能力，有望提高機 體對結核分枝桿菌的免疫力。
[0005] 本發明提供一種促凋亡重組卡介苗，其通過在大腸桿菌一分枝桿菌穿梭質 粒PMV261中依次插入結核保護性抗原Ag85B和促細胞凋亡基因 ΒΑΧ先得到重組質粒 PMV261-Ag85B - ΒΑΧ，再將重組質粒pMV261-Ag85B - ΒΑΧ電轉入BCG而獲得，記為 rBCG: :Ag85B-ΒΑΧ。
[0006] 本發明還提供一種促凋亡重組卡介苗的製備方法，包括以下步驟： (1) 分別PCR擴增ag85b和Bax基因； (2) 用同樣的核酸內切酶對&88513和質粒？1^261進行雙酶切，再用了4 0嫩連接酶進行 連接形成重組質粒PMV261-Ag85B ; (3 )將步驟（2 )獲得的重組質粒在進行測序正確後，轉化，克隆； (4)抽提步驟（3)獲得的重組質粒，用同樣的核酸內切酶對Bax和重組質粒pMV261- Ag85B雙酶切，再用T4 DNA連接酶進行連接形成重組質粒pMV261-Ag85B - ΒΑΧ。
[0007] (5)將步驟（4)獲得的重組質粒pMV261-Ag85B - ΒΑΧ通過電脈衝轉移系統轉入 BCG中，形成重組卡介苗rBCG: :Ag85B - ΒΑΧ。
[0008] 上述步驟（2)和步驟（4)中所述核酸內切酶是及和班III。
[0009] 上述步驟（2)和步驟（4)中所述核酸內切酶是班III和Sal I。
[0010] 本發明中，用重組卡介苗免疫C57BL/6小鼠，結果證實該重組卡介苗在刺激機體 產生IFN- γ、TNF- α和Thl免疫反應特徵性細胞因子IL-2方面均優於BCG ;刺激機體產生 Th2免疫反應特徵性細胞因子IL-4的量顯著低於BCG，而血清抗體亞型IgG2b/IgGl比例高 於BCG，表明與BCG相比，重組卡介苗在誘導機體產生以Thl為主導的細胞免疫方面更具有 潛力，利於形成抗結核分枝桿菌的免疫保護力。另一方面，重組卡介苗接種後只被特異的巨 噬細胞吞噬，因此分泌的促凋亡蛋白ΒΑΧ不會對其他組織細胞產生凋亡作用，從而保證了 該促凋亡重組卡介苗的安全性。因此，本發明的重組卡介苗有望成為新的有效抗結核疫苗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1重組質粒PMV261 - Ag85B-Bax構建模式圖；將目的基因 ag85b和bax酶切並 連接到大腸桿菌一結核分枝桿菌穿梭質粒PMV261中，構建重組質粒pMV261-Ag85B-Bax。
[0012] 圖2 酶切鑑定重組質粒PMV261-Ag85B - Bax (1. 5%瓊脂糖凝膠電泳)，泳道 1:DNA Marker； 泳道2: ag85b PCR產物；泳道3: bax PCR產物；泳道4:重組質粒 pMV261_ag85b_bax;泳道 5:重組質粒 pMV261_ag85b_bax 酶切驗證 ag85b;泳道 6:重組 質粒pMV261_ag85b_bax酶切驗證bax;泳道7:質粒pMV261。
[0013] 圖3以重組BCG菌液為模板PCR鑑定重組卡介苗rBCG: :Ag85B - Bax (1. 5%瓊 脂糖凝膠電泳）泳道1: DNA Marker;泳道2: ag85b PCR產物；泳道3: bax PCR產物；泳道 4:以rBCG :: Ag85B - Bax為模板PCR擴增的ag85b-bax融合基因產物；泳道5:以重 組質粒pMV261_ag85b_bax為模板擴增的ag85b -bax融合基因產物。
[0014] 圖 4 Western Blot 鑑定重組卡介苗 rBCG: :Ag85B - Bax 和 rBCG: : ASP- Bax。第一抗體：抗小鼠 bax單克隆抗體。泳道1:蛋白質Marker;泳道2:BCG;泳道3: 沖〇6::口]\^261;泳道4:沖〇6::4 8858-8&叉；泳道5:沖〇6::45?-8&叉。
[0015] 圖 5 Western Blot 鑑定重組卡介苗 rBCG: :Ag85B - Bax 和 rBCG: : ASP- Bax。第一抗體：抗Ag85B多克隆抗體。泳道1:蛋白質Marker;泳道2:BCG;泳道3: 沖〇6::口]\^261 ;泳道4:沖〇6::48858-8&叉；泳道5:沖〇6::45?-8&叉。
[0016] 圖6細菌刺激RAW264. 7細胞株60小時後細胞凋亡檢測。
[0017] 圖7細菌刺激RAW264. 7細胞株60小時後巨噬細胞早期凋亡率。
[0018] 圖8 ELISP0T檢測Ag85B、PH)刺激脾細胞36h分泌IFN- γ的陽性細胞頻率。
[0019] 圖9 ELISP0T檢測Ag85B、PH)刺激脾細胞36h分泌TNF- α的陽性細胞頻率。
[0020] 圖10 ELISA檢測Ag85B、ΡΗ)刺激脾細胞36h分泌IFN- γ水平。
[0021] 圖11 ELISA檢測Ag85B、PH)刺激脾細胞36h分泌TNF- α水平。
[0022] 圖12 ELISA檢測Ag85B、ΡΗ)刺激脾細胞36h分泌IL-2水平。
[0023] 圖13 ELISA檢測Ag85B、PH)刺激脾細胞36h分泌IL-4水平。
[0024] 圖14免疫後4周、12周外周血⑶4+T/⑶8+T變化。
[0025] 圖15免疫後4周、12周血清中IgG2b/IgGl。

【具體實施方式】
[0026] 下面結合附圖和實例對本發明進一步詳細闡述。
[0027] 一、重組卡介苗構建 1.重組質粒的構建 按照質粒構建模式圖（圖1)所示構建重組質粒。根據結核資料庫（http:// genolist. pasteur. fr/TubercuList/genome. cgi)公布的數據，編碼結核分枝桿菌基因 ag85b (Rvl886c)的喊基大小是978bp(base pair, bp,喊基對)，其中第 1 一120bp 是ag85b 信號膚（signal peptide, ASP);根據 NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov)的 GenBank 中公開發表的數據，編碼小鼠基因 bax的mRNA鹼基序列大小是579bp。再結合質粒載體 pMV261的多克隆位點（mutiple cloning site, MCS)用Pimer 5軟體分別設計正、反向引 物。限制性內切酶選取的原則是：該內切酶的編碼鹼基序列在質粒載體的多克隆位點中存 在而在目的基因編碼序列中不存在。將限制性內切酶的編碼序列分別加到正、反向引物中， 並添加2-3個保護鹼基，由Invitrogen公司合成引物。
[0028] 根據實驗探索，利用PCR擴增目的基因 ag85b和bax的退火溫度分別設置60°C和 65°C較合適。PCR擴增目的基因，通過瓊脂糖凝膠電泳，再用紫外分析儀檢測目的基因 DNA 片段擴增情況。根據Marker大小將目的基因 DNA電泳條帶從瓊脂糖凝膠上小心割下，用膠 回收試劑盒進行回收目的基因 DNA。
[0029] 用限制性內切酶EcoR I和Hind III分別對目的基因 ag85b、質粒pMV261雙酶切， 膠回收後再用T4 DNA連接酶（New England Biolabs，NEB, USA)連接目的基因和載體，經轉 化，克隆，酶切驗證和測序，重組質粒PMV261-Ag85B構建成功後，再用內切酶Hind III和 Sal I對促凋亡基因 bax、重組質粒pMV261-Ag85B進行雙酶切，然後用T4 DNA連接酶連接 bax和重組質粒pMV261-Ag85B，經轉化，克隆，測序，最終構建重組質粒pMV261-Ag85B- Bax〇
[0030] 2.酶切驗證重組質粒pMV261-Ag85B - Bax 如圖2所示，用EcoR I和Hind III對重組質粒pMV261-Ag85B - Bax雙酶切後，電泳 條帶顯示該重組質粒中含有目的基因 ag85b (978bp);經Hind III和Sal I對重組質粒 PMV261-Ag85B-Bax雙酶切後，電泳條帶顯示該重組質粒中含有目的基因 bax (579bp)。兩 個酶切結果初步表明重組質粒PMV261-Ag85B - Bax構建成功。將該陽性質粒送樣測序， 測序結果表明目的基因 ag85b和bax均連接到pMV261載體中，重組質粒pMV261-Ag85B- Bax構建成功。
[0031] 3.重組卡介苗鑑定 由於BCG生長緩慢，至少需要提前1一2周培養並製備感受態BCG。將測序正確的重組 質粒PMV261-Ag85B - Bax通過電脈衝轉移系統轉(簡稱電轉)入BCG，進一步構建重組卡介 苗。
[0032] 將電轉後的BCG菌液均勻塗布於含有50 μ g/ml Kana的7H10培養基平板上，置於 37°C培養箱中培養3-4周，直至長出肉眼可見的菌落。無菌條件下挑選單菌落分別接種到 盛有3ml含50 μ g/ml Kana的7H9培養基中，37°C靜置培養3-4周。按終濃度為25%甘 油濃度進行保種，並將菌種凍存於-80°C。離心收集剩餘菌液，取少量菌液離心後，棄上清再 加少量Milli-Q水煮沸5min，以此菌液為模板進行PCR驗證。其餘菌液離心收集後棄培養 基，加少量PBS重懸並利用超聲波進行破碎，離心取上清通過Western-Blot在蛋白水平鑑 定目的基因在重組卡介苗中的表達情況。
[0033] (1)基因水平鑑定重組卡介苗rBCG : : Ag85B - Bax 如圖3所示，煮沸裂解rBCG :: Ag85B - Bax，以此菌液為模板，退火溫度為60°C時PCR 擴增得到目的基因 ag85b (第2泳道)，退火溫度為65°C時PCR擴增得到目的基因 bax (第 3泳道)。更為重要的是，以煮沸菌液為模板，採用ag85b的上遊引物和bax的下遊引物， 退火溫度為64°C進行PCR擴增，得到了融合基因片段ag85b-bax (第4泳道）；以測序正確 的重組質粒pMV261-ag85b-bax為模板退火溫度為64°C經PCR擴增，也同樣得到融合基因 片段ag85b-bax (第5泳道），以上兩個PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳條帶顯示大小相同 (978bp+579bp=1557bp)，證明重組質pMV261-ag85b-bax已完整地轉化到BCG中，而且確認 了基因未發生斷裂。
[0034] (2) Western Blot 鑑定重組卡介苗 rBCG : : Ag85B -Bax 將重組質粒電轉到感受態BCG中構建重組卡介苗，在抗生素篩選作用下，挑取單菌落 接種到含相應抗生素的7H9培養基中，待重組卡介苗生長至對數期，保種並離心收集菌體， 利用超聲波細胞粉碎機破碎細菌，離心後取上清，經過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質樣 品，並將凝膠上分離的蛋白質樣品轉移到固相載體如硝酸纖維素（Nitrocellulose，NC)膜， 或聚偏二氟乙烯（polyvinylidine difluoride, PVDF)膜上。以固相載體上的蛋白質或多 肽作為抗原，與對應的抗體(第一抗體：抗小鼠 bax單克隆抗體）發生特異性免疫反應，洗滌 去除非特異性結合的第一抗體後，再與辣根過氧化物酶（HRP)標記的第二抗體發生結合，經 過底物顯色以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白質。如圖4所示，Western Blot 結果表明，該株重組卡介苗rBCG :: Ag85B - Bax實現了小鼠促凋亡基因 bax的表達。
[0035] 同理，將第一抗體更換為自製的抗Ag85B多克隆抗體，通過Western Blot檢測目 的基因 ag85b在重組卡介苗中是否實現過表達。如圖5所示，Western Blot結果表明，第4 泳道（rBCG :: Ag85B - Bax )實現了基因 ag85b的過表達；因為保護性抗原Ag85B的編碼 基因 ag85b既存在於H37Rv中，也存在於BCG中，所以可以看到圖5中第二泳道（BCG)和第 三泳道（rBCG: :pMV261)存在多個大小相近的條帶，顯示了抗原85複合蛋白的三個相對分 子質量十分接近而且抗原性具有有交叉的蛋白質：Ag85A、Ag85B和Ag85C。
[0036] 通過兩個Western Blot實驗結果（圖4、圖5)表明，重組卡介苗rBCG : : Ag85B- Bax構建成功。
[0037] 二、重組卡介苗體外實驗 按照實驗設計，在無菌條件下向盛有1X 1〇6細胞的24孔細胞培養板中分別加入PBS、 相同菌量（1 X l〇7CFU)的 BCG 或重組 BCG (第一組：rBCG : :Ag85B - Bax ;第二組：rBCG :: PMV261 ;第三組：rBCG : :Ag85B ;第四組：BCG ;第五組：PBS)。 放置0)2細胞培養箱中於 37°C、5%C02、100%溼度條件下靜置培養。分別於不同刺激時間（刺激811、2211、4711、6011)收 集細胞。洗漆細胞後，按凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC / PI Apoptosis Detection Kit (BD，USA)說明進行染色，最後利用流式細胞術檢測各組細胞凋亡百分率。
[0038] 細菌刺激小鼠單核/巨噬細胞RAW264. 7，經歷8h和22h，細胞幾乎未發生凋亡； 經47h刺激後，已有部分細胞發生凋亡；經過60h(圖6)刺激，幾乎全部細胞都發生凋亡，各 組誘導細胞凋亡的能力大小依次為rBCG: :Ag85B - BAX>rBCG: :pMV261> rBCG: :Ag85B>BCG >PBS。將細菌刺激60h後發生早期凋亡的細胞(流式細胞儀檢測結果四分門中的Q3區域） 佔總細胞的百分比（平均數土標準差）進行統計分析，經SPSS軟體進行單因素方差分析 (ONE-WAY AN0VA)，結果表明（圖7)，與PBS組或BCG組相比，rBCG: :Ag85B刺激後早期凋亡 細胞佔總細胞百分比差異顯著（P〈〇. 05); rBCG: :Ag85B-ΒΑΧ刺激後早期凋亡細胞佔總細 胞百分比差異極顯著（Ρ〈〇. 01);本發明所構建的該株重組卡介苗rBCG: :Ag85B - ΒΑΧ具有 很強的誘導巨噬細胞發生凋亡的能力。
[0039] 三、重組卡介苗免疫小鼠實驗結果 在本發明中，將從細胞免疫和體液免疫兩個角度檢測促凋亡重組卡介苗是否具有誘導 機體產生更強的Thl型免疫反應的潛力，在此基礎上進一步探索該重組卡介苗促進巨噬細 胞抗原遞呈的免疫機制。
[0040] 1. ELISP0T檢測分泌IFN- γ、TNF- α的陽性細胞頻率 本發明中，免疫12周後處死實驗動物，無菌分離脾臟淋巴細胞並計數，向96孔板每孔 加入2. 5 X 105個細胞，經Ag85B、ΡΗ)刺激36h後，通過酶聯免疫斑點實驗（ELISP0T)，計數 分泌幹擾素的形成的特異性斑點（spot-forming units, SFU)來評價脾臟淋巴細胞產生幹 擾素的陽性細胞頻率。結果如圖8所示，經Ag85B刺激，rBCG: :Ag85B-Bax免疫組與BCG免 疫組、PBS免疫組相比，均為差異顯著（P〈0. 05);其餘各組間差異不顯著。經PH)刺激，各 組形成的IFN-γ特異性斑點數量很少，各組差異均無統計學意義。初步表明針對特異性抗 原Ag85B，rBCG: :Ag85B-Bax相對於BCG具有較強的誘導機體產生IFN- γ的潛力。
[0041] 在本發明中，免疫12周後無菌分離脾臟淋巴細胞並計數，向96孔板中每孔加入 2. 5 X 105個細胞，經Ag85B、PH)刺激36h後，通過ELISP0T，計數分泌TNF- α所形成的特異 性斑點（spot-forming units, SFU)來評價脾臟淋巴細胞產生TNF-α的陽性細胞頻率。如 圖9所示，經Ag85B刺激，rBCG: : Ag85B-Bax免疫組與PBS免疫組相比差異極顯著（P〈0. 01); 但與BCG免疫組相比，差異無統計學意義（P>0. 05)。經PH)刺激脾細胞，與Ag85B刺激脾細 胞得出的結論完全一致。初步表明，經抗原Ag85B或PPD刺激，本實驗構建的兩種重組卡介 苗在誘導機體在產生TNF-α方面，其潛力至少與BCG相當。
[0042] 2. ELISA 檢測產生細胞因子 IFN-γ、TNF-a、IL-2、IL-4 的水平 本發明中，免疫12周後處死實驗動物，無菌分離脾臟淋巴細胞並計數，每孔加入 1. OX 106個細胞，經Ag85B、PH)刺激36h後，通過酶聯免疫吸附實驗（ELISA)檢測脾臟淋 巴細胞分泌IFN- γ的水平。如圖10所示，經PH)刺激，rBCG: : Ag85B-Bax免疫組與BCG 免疫組相比差異顯著（P〈〇. 〇5);rBCG: : Ag85B-Bax免疫組與PBS免疫組相比為差異極顯著 (P〈0.01)。初步表明，在產生IFN-γ方面，促凋亡重組卡介苗rBCG :: Ag85B-Bax相對於 BCG具有較大的潛力。
[0043] 在本發明中，經Ag85B、PH)刺激36h後，ELISA檢測脾臟淋巴細胞分泌TNF- α的水 平。結果如圖11所示，經Ag85B刺激rBCG: : Ag85B-Bax免疫組與BCG免疫組相比差異顯著 (P〈0. 05)。經PH)刺激，rBCG: : Ag85B-Bax免疫組與BCG免疫組相比差異極顯著（P〈0. 01)。 初步表明，促凋亡重組卡介苗rBCG: :Ag85B-Bax在刺激機體在產生TNF- α方面，顯著優於 BCG。
[0044] 本發明中，Ag85B、ΡΗ)刺激36h後，通過ELISA檢測脾臟淋巴細胞分泌IL-2的水 平。結果如圖12所示，經Ag85B刺激，rBCG: : Ag85B-Bax免疫組與BCG免疫組相比為差 異極顯著（P〈〇. 01)。經PPD刺激，rBCG:: Ag85B-Bax免疫組與BCG免疫組相比差異顯著 (P〈0. 05)。結果表明，在刺激機體在產生IL-2方面，相對於BCG而言，rBCG: :Ag85B-Bax具 有較強的誘導能力。IL-2是Thl免疫反應產生的特徵性細胞因子，表明與BCG相比，該株促 凋亡重組卡介苗均能誘導機體產生更強的Thl免疫反應。
[0045] 同理，經Ag85B、PH)刺激36h後，ELISA檢測脾臟淋巴細胞分泌IL-4的水平。結 果如圖13所示，經Ag85B刺激，該株促凋亡重組卡介苗免疫組產生的IL-4均低於BCG免疫 組，rBCG: :Ag85B-Bax免疫組與BCG免疫組相比，差異極顯著（P〈0. 01)。經PH)刺激，該株 促凋亡重組卡介苗免疫組與BCG相比，差異無統計學意義（P>0. 05)。結果表明，在刺激機體 在產生IL-4方面，本實驗構建的重組卡介苗rBCG: :Ag85B-Bax誘導機體產生較少的IL-4。 IL-4是Th2免疫反應產生的特徵性細胞因子，表明與BCG相比，rBCG::Ag85B-Bax能誘導機 體產生更弱的Th2免疫反應，佐證了上述的IL-2的實驗結果。
[0046] 3.免疫後外周血⑶4+T和⑶8+T變化 本發明在免疫小鼠後分別於4周、12周後處死，眼眶取血後室溫靜置2h取上層血清凍 存備用，然後取100 μ 1血漿與2ml紅細胞裂解液混合均勻，將離心收集到的外周血單個核 細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC)用PBS洗漆，染色後用流式細胞儀檢 測外周血中⑶4+T、⑶8+T淋巴細胞數量。
[0047] 本發明中比較了免疫後4周、12周的⑶4+T/⑶8+T，結果如圖14所示，雖然在免疫 後4周，rBCG: :Ag85B-Bax免疫組外周血⑶4+T/⑶8+T低於BCG免疫組；但到免疫後12周 rBCG: :Ag85B-Bax免疫組外周血⑶4+T/⑶8+T高於BCG免疫組。結果表明，該株促凋亡重組 卡介苗均能在較長時間內維持相對恆定的外周血CD4+T/CD8+T，利於機體維持抗結核分枝杆 菌的持久免疫力。
[0048] 4.免疫後外周血抗體亞型IgG2b/IgGl比例變化 從IgG2b/IgGl (圖15)來看，促凋亡重組卡介苗rBCG: :Ag85B-Bax免疫組在免疫後4 周、12周血清中IgG2b/IgGl均高於BCG免疫組，預示著該重組卡介苗均能誘導機體產生體 液免疫反應，並且能使機體向Thl型方向發展，增強機體抵禦結核分枝桿菌的免疫保護力。
[0049] 結果證實rBCG: :Ag85B - ΒΑΧ在刺激機體產生IFN- γ、TNF- α和Thl免疫反應特 徵性細胞因子IL-2方面均優於BCG ;而刺激機體產生Th2免疫反應特徵性細胞因子IL-4的 量顯著低於BCG，血清抗體亞型IgG2b/IgGl比例高於BCG，表明與BCG相比，該重組卡介苗 在誘導機體產生以Thl為主導的細胞免疫方面更具潛力，利於形成抗結核分枝桿菌的免疫 保護力。
【權利要求】
1. 一種促凋亡重組卡介苗，其特徵在於，其通過在大腸桿菌一分枝桿菌穿梭質粒 PMV261中依次插入結核保護性抗原Ag85B和促細胞凋亡基因 ΒΑΧ得到重組質粒pMV261- Ag85B - ΒΑΧ，再將重組質粒pMV261-Ag85B - ΒΑΧ電轉入BCG而獲得，記為rBCG: :Ag85B- ΒΑΧ。
2. -種如權利要求1所述的促凋亡重組卡介苗的製備方法，其特徵在於，包括以下步 驟： (1) 分別PCR擴增ag85b和Bax基因； (2) 用同樣的核酸內切酶對&88513和質粒？1^261進行雙酶切，再用了4 0嫩連接酶進行 連接形成重組質粒PMV261-Ag85B ; (3 )將步驟（2 )獲得的重組質粒在進行測序正確後，轉化，克隆； (4) 抽提步驟（3)獲得的重組質粒，用同樣的核酸內切酶對Bax和重組質粒pMV261- Ag85B雙酶切，再用T4 DNA連接酶進行連接形成重組質粒pMV261-Ag85B - ΒΑΧ ; (5) 將步驟（4)獲得的重組質粒pMV261-Ag85B - ΒΑΧ通過電脈衝轉移系統轉入BCG 中，形成重組卡介苗rBCG: :Ag85B - ΒΑΧ。
3. 根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，步驟（2)和步驟（4)中所述核酸內切 酶是feo/PI 和歷·Ζ7?/ III。
4. 根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，步驟（2)和步驟（4)中所述核酸內切 酶是班/7?/ III和Sal I。
【文檔編號】A61P31/06GK104107426SQ201410283901
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年6月24日 優先權日:2014年6月24日
【發明者】王洪海, 徐穎, 李光華, 劉國元, 宋娜, 孔聰, 黃琪 申請人:復旦大學