一種人胃癌多藥耐藥細胞株的製作方法

2023-06-17 01:02:06 1

一種人胃癌多藥耐藥細胞株的製作方法
【專利摘要】本發明採用人胃癌細胞株SGC-7901為誘導對象，採用大劑量衝擊法，後採用逐步遞增VP濃度、間歇作用的體外誘導法，建立了人胃癌多藥耐藥細胞株SGC-7901/VP。該細胞株已經於2013年11月14日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?NO.8455。本發明的細胞株具有典型多藥耐藥特性，為進一步研究耐藥逆轉途徑提供了實驗基礎。
【專利說明】一種人胃癌多藥耐藥細胞株
【技術領域】
[0001]本發明屬於細胞工程【技術領域】，涉及一種人類細胞株，具體涉及一種人胃癌多藥耐藥細胞株及其建立方法。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤是危害人民健康和生命的嚴重疾病，在不少國家和地區，已佔居民疾病死亡原因的第一位或第二位。在所有惡性腫瘤中，胃癌佔有相當大的比重。其發生率和病死率分別居惡性腫瘤的第四位和第二位。在我國，胃癌的發生率和病死率均居惡性腫瘤之首，且有上升趨勢。
[0003]化學藥物是治療人類惡性腫瘤的重要手段之一，化療效果差的原因之一在於腫瘤耐藥的產生，其原因尚未完全闡明。許多研究認為腫瘤多藥耐藥(Multidmg Resistance,MDR)是腫瘤細胞對化療藥物不敏感的重要原因。克服腫瘤多藥耐藥性，尋找逆轉惡性腫瘤細胞多藥耐藥的新途徑，提高腫瘤細胞對化療的敏感性是當前腫瘤領域的重要課題之一。成功建立耐藥腫瘤細胞模型是開展此研究的前提和基礎。
[0004]瘤細胞耐藥株的建立方法通常有兩種，一是逐步增加藥物濃度、持續誘導法，二是大劑量衝擊法。通過耐藥細胞株的建立可以進一步構建體內外腫瘤耐藥模型，從而深入研究MDR耐藥機制，甚至發現其他新的耐藥機制。通過耐藥細胞株的建立的體內外腫瘤耐藥模型，可以用於抗腫瘤藥物的篩選。
[0005]通過檢索發現，目前國內外還沒有關於以人胃癌細胞株SGC-7901為誘導對象，建立人胃癌多藥耐藥細胞株SGC-7901/VP的文獻報導。

【發明內容】

[0006]鑑於現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種人胃癌多藥耐藥細胞株及其建立方法。本發明的細胞株具有典型多藥耐藥特性，為進一步研究耐藥逆轉途徑提供了實驗基礎。
[0007]本發明的目的是這樣實現的:
[0008]本發明米用人胃癌細胞株SGC-7901為誘導對象，前期誘導米用大劑量衝擊法，後期誘導採用持續誘導法，建立了人胃癌細胞依託泊苷耐藥株SGC-7901/VP。該細胞株已經於2013年11月14日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CGMCC N0.8455。
[0009]具體地，本發明涉及的人胃癌多藥耐藥細胞株SGC-7901/VP是按照如下方法建立
獲得:
[0010](I)人胃癌細胞株SGC-7901用培養液(含10%小牛血清的RPM1-1640培養液)，5% C02, 37°C條件下，培養至70%~90 %貼壁率時，去上清，加入VP100ng/ml衝擊培養I小時，去VP100ng/ml培養液，空白RPM1-1640培養液洗滌2次後，更換增殖培養液培養72_96h擴增存活細胞。至存活細胞擴增至70%~90%貼壁率時，再重複用VP100ng/ml培養液衝擊培養I小時9次， 即總共完成10次100ng/ml VP16培養液衝擊培養I小時，進一步以此細胞為基礎，1000ng/ml持續培養7天。
[0011](2)重複上述操作，將篩選條件依次改為VP200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml培養液。
[0012]本發明通過細胞形態學觀察、生長曲線和群體倍增時間測定、藥物敏感試驗、細胞內Rh-123研究及細胞周期的測定，評價人胃癌多藥耐藥細胞株SGC-7901/VP的生物學特性，結果成功建立了 SGC-7901/VP耐藥株，耐藥指數為88.746，對順鉬(cDPP)、紫杉醇(Taxol)、長春新鹼(VCR)、氟尿嘧啶(5-FU)和阿黴素(Adr)產生了明顯的交叉耐藥性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為SGC-7901、SGC-7901/VP的細胞生長曲線圖。
[0014]圖2為SGC-7901細胞株的細胞周期圖
[0015]圖3為SGC-7901/VP細胞株的細胞周期圖
[0016]圖4為羅丹明123在SGC-7901細胞內的含量圖
[0017]圖5為羅丹明123在SGC-7901/VP細胞內的含量圖
[0018]圖6為本發 明SGC-7901/VP細胞株的顯微圖。
【具體實施方式】
[0019]下面通過實施例進一步說明本發明。本發明的實施例僅僅是用於說明本發明，而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下對本發明方法的簡單改進都屬於本發明要求保護的範圍。
[0020]實施例1人胃癌多藥耐藥細胞株SGC-7901/VP的誘導建立
[0021]採用逐步遞增VP濃度、間歇作用的體外誘導法建立人胃癌多藥耐藥細胞株SGC-7901/VP，具體步驟如下:
[0022](I)人胃癌細胞株SGC-7901用培養液(含10%小牛血清的RPM1-1640培養液)，5% C02, 37°C條件下，培養至70%~90 %貼壁率時，去上清，加入VP100ng/ml衝擊培養I小時，去VP100ng/ml培養液，空白RPM1-1640培養液洗滌2次後，更換增殖培養液培養72_96h擴增存活細胞。至存活細胞擴增至70%~90%貼壁率時，再重複用VP100ng/ml培養液衝擊培養I小時9次，即總共完成10次100ng/mlVP培養液衝擊培養I小時，進一步以此細胞為基礎，100ng/ml持續培養7天。
[0023](2)重複上述操作，將篩選條件依次改為VP200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml培養液。
[0024](3)敏感細胞逐漸死亡，而耐藥細胞繼續生長。如此反覆誘導、換液、傳代，歷時約6月，最終得到在800ng / mL VP中穩定生長增殖的耐藥株，命名為SGC-7901/VP。將該細胞凍存2月後復甦，在不含VP的培養液中反覆傳代2月以上仍基本保持原來的耐藥性。
[0025]實施例2耐藥株形態學觀察
[0026]取對數生長期的人胃癌多藥耐藥細胞株SGC-7901/VP，於倒置顯微鏡下觀察細胞形態，結果如圖6所示:細胞形態變大，核皺縮，細胞易堆積成團。
[0027]實施例3細胞生長曲線測定
[0028]細胞消化、計數、配製成濃度為5X103個/mL的細胞懸液，96孔細胞培養板中每孔加入100 μ L細胞懸液(每孔500個細胞);6孔細胞培養板置於37°C，5%C02培養箱中分別培養2d、4d、6d、8d、IOd ;將96孔板進行MTT染色，λ =490nm,測定OD值；每孔加入20 μ L MTT(5mg/mL)，在培養箱繼續培養4小時；棄去培養基，每孔加入150 μ L DMSO溶解，搖床10分鐘輕輕地混勻；λ =490nm,酶標儀讀出每孔的OD值以時間為橫坐標、OD值為縱坐標，繪製細胞生長曲線。SGC-7901、SGC-7901/VP的細胞生長曲線見圖1。
[0029]實施例4、PI染色法檢測細胞周期
[0030]用0.25%胰酶消化對數生長期細胞，調節細胞密度為2 X 105/ml，接種於6孔培養板，培養24h ；0.25%胰酶消化，收取細胞；用4°C保存的0.01M PBS洗滌細胞3次，70%乙醇冰上固定5min, 2000rpm室溫離心5min,重懸於冷PBS I ml,備用；用流式細胞儀檢測，激發波長為488nm，接收波長為575nm。結果顯示，SGC-7901G1期、S期、G2期細胞分別為77.19%、18.25%,4.56%, SGC-7901/VP Gl 期、S 期、G2 期細胞分別為 57.56%,28.57%、13.87%,SGC-7901/VP Gl期細胞減少，S、G2期細胞增多，結果見圖2、圖3。 [0031]實施例5流式細胞儀檢測羅丹明123蓄積
[0032]用0.25%胰酶消化對數生長期細胞，調節細胞密度為2 X 105/ml，接種於6孔培養板，培養24h ；0.25%胰酶消化，收取細胞；用4°C保存的0.01M PBS洗滌細胞3次，收集並調整細胞濃度為1父1071111，每管加入濃度為5呢/1111的羅丹明123500uL，37°C保溫30min，500rpm離心2min，去除培養液，再用新培養液洗去細胞外的羅丹明染料，在37 °C保溫IOmin,使P-gp糖蛋白功能得以發揮，把藥物泵出，再用培養液洗I次，放在冰冷的培養液中待檢測，流式細胞儀用488nm的激發光，測試細胞螢光強度。結果見圖4、圖5。SGC-7901細胞螢光強度為16384，SGC-7901/VP細胞螢光強度為895，SGC-7901/VP細胞內的細胞羅丹明123比SGC-7901減少。
[0033]實施例6藥物敏感試驗
[0034]細胞消化、計數、配製成濃度為I X IO5個/ml的細胞懸液，96孔細胞培養板中每孔加入IOOul細胞懸液(每孔IX IO4個細胞)；96孔細胞培養板置於37°C，5%C02培養箱中培養24小時；用完全培養基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入100 μ L相應的含藥培養基，(4)96孔細胞培養板置於37°C，5%C02培養箱中培養24小時；將96孔板進行MTT染色，λ =490nm,測定OD值；計數各組別抑制率及藥物IC50。
[0035]試驗結果參見表1。根據表1的結果可以看出，SGC-7901/VP對依託泊苷、順鉬、紫杉醇、長春新鹼、氟尿嘧啶、阿黴素的耐藥指數是88.746,4.392,4.685,6.469,8.954、
4.014。
[0036]表1細胞株對各種化療藥物的I C50和耐藥指數
[0037]
[0038]
【權利要求】
1.一種人胃癌多藥耐藥細胞株SGC-7901/VP，保藏號為CGMCC N0.8455。
【文檔編號】C12R1/91GK103740647SQ201310627784
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】不公告發明人 申請人:南京凱基生物科技發展有限公司