淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒及其檢測方法

2023-06-17 01:19:41

專利名稱：淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及淡水魚類肌球蛋白重鏈(MYH)的檢測技術，具體的說是運用實時螢光 PCR技術快速檢測淡水魚類肌球蛋白中重鏈mRNA的表達量的方法。
背景技術：
肌球蛋白廣泛存在於動物中，是構成骨骼肌粗絲的主要成分，也是重要的功能性 蛋白。脊椎動物肌球蛋白的分子結構為"Y"形不對稱六聚體，長約160cm，由兩條分子量約 220Kd左右的淡水魚類肌球蛋白重鏈(MYH)和四條分子量為16—-20Kd左右的短鏈即肌球 蛋白輕鏈(MLC)組成。根據結構和功能不同，肌球蛋白可分為3個結構域2條重鏈和輕鏈 的N端結合，摺疊形成頭部和頸部調節結構域(SI) ;2條重鏈的C端摺疊成一螺旋結構，構 成肌球蛋白長杆狀的尾部，形成尾部結構域。其中頭部含有一個ATP和肌動蛋白結合位點， 直接與肌肉的運動和能量供應相關；與頭部等相連的一螺旋的頸部，通過鈣或其他類似鈣 元素調節輕鏈對頭部的活性；尾部的結構域有決定肌球蛋白與膜或與另外肌球蛋白分子結 合的相互反應。另外，肌球蛋白具有ATP酶活性，能裂解ATP釋放化學能，並且具有與肌動 蛋白結合的能力，是決定肌纖維收縮性質的主要分子之一。 不同的魚種、不同的發育階段、不同的組織、不同的環境中，重鏈基因的表達情況 不一樣。因此，對淡水魚類肌球蛋白重鏈的定量的研究有助於為今後的進一步研究該類基 因在魚肌肉生長和發育中的調控作用，以及研究不同養殖環境對該類基因表達的影響奠定 當前Trizol(Invitrogen) —步抽提法以簡便、快速、需要量少但提取質量高的特 點，實時螢光PCR法以操作簡便、靈敏、特異、快速、重複性好、定量準確、全封閉反應等優點 得到研究者的普遍認可與應用。 目前，尚未有快速檢測淡水魚類淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量的試劑盒，而 本發明可以完成魚類淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量的快速檢測。

發明內容
本發明的目的是提供淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒的製備 和檢測方法，為進一步研究該類基因在魚肌肉生長和發育中的調控作用，以及研究不同養 殖環境對該類基因表達的影響奠定基礎。 本發明的主要原理為針對淡水魚類肌球蛋白重鏈基因和內參基因保守序列設計 目的基因和內參基因引物(表1)。進行核酸檢測時，通過PCR反應生成雙鏈DNA，SYBR Green I與雙鏈DNA結合發出螢光，通過檢測PCR反應液中的螢光信號強度，可以對目的基因進行 準確定量。隨著PCR循環的增加，目的片段成指數增長，螢光信號也同步增強，螢光信號的 強弱直接反映模板數量。 本發明涉及的魚類肌球蛋白重鏈基因表達量的快速檢測試劑盒，其中的試劑包括如下 (l)PCR擴增反應液 包括10XPCR反應緩衝液、0. 1-0. 4mmol/LdNTP(含dTTP) 、2-4mmol/L硫酸鎂、 l-2UTaq酶、0. 2-0. 6umol/L上遊引物、0. 2-0. 6umol/L下遊引物、1 X0. 2XSYBR Green I染 料其中IOXPCR反應緩衝液含有100mmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、
500mmol/L氯化鉀和1 %曲拉通X-100 ; 其中目的基因引物和內參基因引物參數如表1。 表1用於螢光定量分析的目的基因引物 和內參基因的引物參數
產物大
基因 引物序列 小
gene Prime Product
size
S: 5'-GCTCATCACCACCAACCC-3， MYH 239 A*. 5'-GCCTCCTCTGTGCCATCA-3'
S :
GAPDH 5'——ATCAAGGAAGCGGTGAAGAAGG——3' 194
A :
5'—CGAAGATGGAGGAGTGGGTGTC 其中上遊引物、下遊引物、SYBR Green I染料的體積比為1 :1:1;
4
其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的摩爾量比為
dTTP : dATP : dGTP : dCTP = 1:1:1:1。 (2)對照cDNA 實驗組上面所述PCR擴增反應液，每管24uL的最佳組成為2. 5uL 10XPCR反 應緩衝液、2uL 2. 5mmol/LdNTP(四種脫氧核糖核酸的混合物)、2uL25mmol/L硫酸鎂、luL 10umol/L目的基因上遊引物、luL 10umol/L目的基因下遊引物、luL SYBR Green I染料、 0. 3uLTaq酶、14. 2uLddH20 (滅菌雙蒸水)。 對照組上面所述PCR擴增反應液A，每管24uL的最佳組成為2. 5uL 10 XPCR反 應緩衝液、2uL 2. 5mmol/LdNTP(四種脫氧核糖核酸的混合物)、2uL25mmol/L硫酸鎂、luL 10umol/L內參基因上遊引物、luL 10咖ol/L內參基因下遊引物、luL SYBR Green I染料、 0. 3uLTaq酶、14. 2uLddH20 (滅菌雙蒸水)。 使用上述試劑盒檢測淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量的方法，依次包括下列 步驟(1)_(3): (1)待檢樣品總RNA提取及cDNA第一鏈的合成 採用Trizol —步抽提法提取待檢樣品總RNA，然後用反轉錄試劑盒進行cDNA第一 鏈的合成； (2)淡水魚類肌球蛋白重鏈的實時螢光PCR擴增 A.在裝有24uL分別含目的基因引物、內參基因引物的兩支PCR擴增反應液A的反 應管中加入luL待檢樣品cDNA，混勻。 B.將PCR反應管放入螢光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增 95。C 10s， 1個循環，預變性； 95。C 5s， 1個循環，變性; 58 。C 20s退火延伸，45個循環，PCR擴增。 (3)應用螢光定量PCR儀隨機軟體，分析擴增結果，比較表達量的多少。
第一步判斷能否檢測出肌球蛋白重鏈。 如待測樣品出現擴增曲線，且Ct值小於或等於41，陰性對照、陽性對照和空白對 照結果正常者，則可判定該樣品檢出肌球蛋白重鏈。 如待測樣品Ct值大於或等於45，陰性對照、陽性對照和空白對照結果正常者，則 可判定該樣品未檢出肌球蛋白重鏈。 如待測樣品Ct值在41-45之間，應重作實時螢光PCR擴增。再次擴增後的結果Ct 值仍小於45，且陰性對照、陽性對照和空白對照結果正常者，則可判定該樣品檢出肌球蛋白 重鏈；再次擴增後的結果Ct值大於45，且陰性對照、陽性對照和空白對照結果正常者，則可 判定該樣品未檢出肌球蛋白重鏈。 第二步通過比較閾值法來測定目的基因的相對表達量。 根據數學推導得出，肌球蛋白重鏈mRNA的表達量二2—A A Ct，在該公式中，Ct是 熱循環儀檢測到反應體系中螢光信號的強度值，A ACt = (Ct目的基因-Ct管家基因)實 驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。實時螢光定量PCR結束後，目的基因的量的實 驗數據用Excel 2003軟體進行初步處理，接著採用SPSS 12. 0或SASS軟體對所得表達豐 度數據進行單因素方差分析(One-WayANOVA)，最後採用最小顯著差數法(LSD)進行多重比較，以對比樣品中重鏈基因的表達量。 本發明建立了魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量的實時螢光PCR檢測試劑盒及檢測 方法。本試劑盒根據魚類肌球蛋白重鏈基因的保守序列，設計了特異性引物。該保守基因 序列通過對Genebank登錄的各魚種肌球蛋白重鏈基因的核酸序列的比對獲得，可保證不 同魚種、不同組織、不同發育時期肌球蛋白重鍊表達量的檢出。本發明採用Trizol —步抽 提法提取RNA，該技術具有簡便、快速、需要量少但提取質量高的特點，採用實時螢光PCR法 進行檢測，該技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、定量準確的特點，因此特別適用於魚 類樣品量少的肌球蛋白重鏈mRNA表達量的對比。
有益效果 本發明建立了魚類淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量的實時螢光PCR檢測試劑 盒及檢測方法。本試劑盒根據魚類淡水魚類肌球蛋白重鏈基因的保守序列，設計了特異性 引物。該保守基因序列通過對Genebank登錄的各魚種淡水魚類肌球蛋白重鏈基因的核酸 序列的比對獲得，可保證不同魚種、不同組織、不同發育時期淡水魚類肌球蛋白重鍊表達量 的檢出。本發明採用Trizol(Invitrogen) —步抽提法提取RNA，該技術具有簡便、快速、 需要量少但提取質量高的特點，採用實時螢光PCR法進行檢測，該技術具有特異性強、靈敏 度高、操作簡便、定量準確的特點，因此特別適用於魚類樣品量少的淡水魚類肌球蛋白重鏈 mRNA表達量的對比。


圖1用實時螢光PCR技術檢測某待測草魚樣品cDNA，樣品的擴增曲線；
圖2數據處理後胚胎發育時期MYHmRNA相對表達量；
圖3用實時螢光PCR技術檢測某待測鱖魚樣品cDNA，樣品的擴增曲線；
圖4數據處理後胚胎發育時期MYHmRNA相對表達量。
具體實施例方式
為了使本發明實現的技術手段、創作特徵、達成目的與功效易於明白了解，下面結
合具體圖示，進一步闡述本發明。
實施例1 : 按下列配方製作原腸階段和尾腸階段的鰱魚肌肉肌球蛋白重鏈的實時螢光PCR 檢測試劑盒 包括10XPCR反應緩衝液、0. 2mmol/L dNTP(含dTTP) 、2mmol/L硫酸鎂、1. 5UTaq 酶、1X0. 2XSYBRGreenl染料、0. 4umol/L上遊引物、0. 4u mol/L下遊引物；
其中10XPCR反應緩衝液含有10Ommol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷_鹽酸、 500mmol/L氯化鉀和1 %曲拉通X-100 ; 其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的摩爾比為dTTP : dATP : dGTP : dCTP =
i : i : i : 1。 按照以下程序進行檢測 具體步驟如下 1、採用Trizol —步抽提法提取不同階段草魚普通肌總RNA，併合成cDNA第一鏈
(1)先在5mL離心管(DEPC處理)中加入lmL Trizol溶液，然後剪碎魚樣約100mg， 置於該離心管中，高速勻漿至勻漿液透明而無顆粒。 (2)將勻漿液轉移至1. 5mL的離心管(DEPC處理)中，室溫靜置10min，使其充分 裂解。 (3)將第(2)步處理的樣品置於離心機內，12000rpm，4。C離心10min。 (4)離心完畢，取上清液轉入另一新的DEPC處理的1. 5mL離心管中。並加入0. 2mL
的氯仿，用力搖晃lmin，使其充分乳化，無分相，室溫靜置5min。 (5)將第(4)步處理的樣品置於離心機內，12000rpm，4。C離心15min。 (6)離心完畢，小心吸取上層水相至另一DEPC處理的1. 5mL離心管中，加入等體積
異丙醇，上下輕混幾次，冰上放置10min。然後再在12000rpm，4t:離心10min。 (7)棄上清，用lml 75%乙醇洗滌沉澱。 (8)棄75%乙醇，重複步驟(7) ，8000rpm，4。C離心10min。 (8)棄75%乙醇，真空乾燥5min，使剩餘酒精完全揮發。 (9)沉澱用100 ii 1 DEPC處理H20溶解，_80"凍存或直接用於RT—PCR。取上 述DNase I處理過的總RNA樣品，利用反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成，獲得樣品的 cDNA，反轉錄產物(RT Products)於-20。C保存備用
2、待測樣品cDNA的實時螢光PCR擴增 A.在裝有24uL分別含目的基因引物MYH、內參基因引物的兩支PCR反應管中加入 PCR反應液和luL樣品cDNA，混勻。 B.將PCR反應管放入螢光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增 95。C 10s， 1個循環，預變性; 95。C 5s， 1個循環，變性; 58°C 20s退火延伸，45個循環，PCR擴增。 3、應用螢光定量PCR儀隨機軟體，分析擴增結果，比較表達量的多少。 實驗數據經過Excel 2003軟體的初步處理，再採用SPSS 12.0軟體對所得表達豐
度數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)並採用最小顯著差數法(LSD)進行多重比
較，發現原腸階段MYH相對表達量與尾芽階段相比有顯著差異(p < 0. 05)，即尾芽階段的
MYH要多。 實施例2 : 按下列配方製作尾芽期和仔魚期鱖魚肌肉肌球蛋白重鏈基因的實時螢光PCR檢 測試劑盒 包括10XPCR反應緩衝液、0. 2mmol/L dNTP(含dTTP) 、2mmol/L硫酸鎂、1. 5U Taq 酶、0.4u mol/L上遊引物0. 4u mol/L下遊引物、1 X—0. 2X SYBR Green I染料；
其中IOXPCR反應緩衝液含有100mmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷 一 鹽酸、 500mmol/L氯化鉀和1 %曲拉通X—100 ; 其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的摩爾比為dTTP : dATP : dGTP : dCTP =
i : i : i : 1。 按照以下程序進行檢測 1、採用Trizol —步抽提法提取不同時期鱖魚普通肌的總RNA，併合成cDNA第一鏈
7[OO79] (1)先在5mL離心管(DEPC處理)中加入lmL Trizol溶液，然後剪碎魚樣約100mg， 置於該離心管中，高速勻漿至勻漿液透明而無顆粒。 (2)將勻漿液轉移至1. 5mL的離心管(DEPC處理)中，室溫靜置10min，使其充分 裂解。 (3)將第(2)步處理的樣品置於離心機內，12000rpm，4t:離心10min。 (4)離心完畢，取上清液轉入另一新的DEPC處理的1. 5mL離心管中，並加入0. 2mL
的氯仿，用力搖晃lmin，使其充分乳化，無分相，室溫靜置5min。 (5)將第(4)步處理的樣品置於離心機內，12000rpm，4。C離心15min。 (6)離心完畢，小心吸取上層水相至另一DEPC處理的1. 5mL離心管中，加入等體積
異丙醇，上下輕混幾次，冰上放置10min。然後再在12000rpm，4t:離心10min。 (7)棄上清，用lml 75%乙醇洗滌沉澱。 (8)棄75%乙醇，重複步驟(7) ，8000rpm，4。C離心10min。 (8)棄75%乙醇，真空乾燥5min，使剩餘酒精完全揮發。 (9)沉澱用100 ii 1 DEPC處理H20溶解，-8(TC凍存或直接用於RT—PCR。 (10)取上述DNase I處理過的總RNA樣品，利用反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的
合成，獲得樣品的cDNA，反轉錄產物(RT Products)於-2(TC保存備用。 2待測魚樣cDNA的實時螢光PCR擴增 A.分別在兩支PCR反應管中加入24u L分別含目的基因MYH、內參基因P—actin 的PCR反應液A和lu L樣品cDNA，混勻。 B.將PCR反應管放入螢光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增 95°C 10s， 1個循環，預變性; 95°C 5s， 1個循環，變性； 58°C 20s退火延伸，45個循環，PCR擴增。 (3)應用螢光定量PCR儀隨機軟體，分析擴增結果，，比較表達量的多少。 實驗數據經過Excel 2003軟體的初步處理，再採用SPSS 12.0軟體對所得表達豐
度數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)並採用最小顯著差數法(LSD)進行多重比
較，發現尾芽階段MYH相對表達量與仔魚階段相比有顯著差異(p < 0. 05)，即仔魚階段的
MYH要多。
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權利要求
淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒，其特徵在於，試劑包括10×PCR反應緩衝液、0.1--0.4mmol/L dNTP、---4mmol/L氯化鎂、1--2UTaq酶、0.2---0.6umol/L上遊引物、0.2--0.6umol/L下遊引物、1×--0.2×SYBRGreen I染料；其中10×PCR反應緩衝液含有100mmo/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷--鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1％曲拉通x--100；
2. 根據權利要求l中所述的淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒，其特 徵在於，上述的上遊引物、下遊引物、SYBR Green I染料的體積比為1 :1:1。
3. 根據權利要求1中所述的淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒，其 特徵在於，上述的dNTP內的四種脫氧核糖核酸的摩爾比為dTTP : dATP : dGTP : dCTP =i : i : i : i;
4. 快速檢測淡水魚類淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量的方法，其特徵在於，依次包 括下列步驟(1) 待檢樣品總RNA提取及cDNA第一鏈的合成；(2) 魚類淡水魚類肌球蛋白重鏈的實時螢光PCR擴增；A. 在裝有24uLPCR擴增反應液A的反應管中加入luL待檢樣品cDNA，混勻；B. 將PCR反應管放入螢光PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增； 95°C 10 s，l個循環，預變性;95°C 5s，1個循環，變性;58 °C 20s，退火延伸，45個循環，PCR擴增。(3) 應用螢光定量PCR儀隨機軟體，分析擴增結果，比較表達量的多少。
全文摘要
本發明為淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒及其檢測方法。試劑盒包括PCR擴增反應液A、對照cDNA；PCR擴增反應液A含有10×PCR反應緩衝液、氯化鎂、dNTP、Taq酶、重鏈基因和內參基因特異性上、下遊引物各一對、SYBR Green I染料，魚類淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA表達量的快速檢測方法包括魚的總RNA提取、魚類淡水魚類肌球蛋白重鏈mRNA的實時螢光PCR擴增和結果判定。本發明的優點是需要量少、快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便、重複性好。
文檔編號C12Q1/68GK101724706SQ20101002200
公開日2010年6月9日 申請日期2010年1月5日 優先權日2010年1月5日
發明者周瑞雪, 張建社, 蒙濤, 褚武英, 趙發蘭, 陳敦學 申請人:長沙學院