提高聚蘋果酸產量的培養基及其應用和方法

2023-06-16 22:26:46

專利名稱：提高聚蘋果酸產量的培養基及其應用和方法
技術領域：
本發明涉及發酵領域，具體涉及提高聚蘋果酸產量的培養基，還涉及該培養基的應用和方法。
背景技術：
聚蘋果酸(Polymalic acid，PMLA)以L-蘋果酸為唯一單體在體內聚合而成，是一種新型完全生物降解性高分子材料，具有高度的生物相容性、生物降解性和生物可吸收性等優點。由於PMLA在側鏈上具有懸掛羧基，容易與其他官能團反應而製備PMLA衍生物，與聚乳酸等材料相比，PMLA在體內易代謝性、易修飾性等方面表現出更好的優勢，在藥物制齊U、食品包裝、農業等方面應用前景廣闊。聚蘋果酸還可以水解為單體，即L-蘋果酸，又名2-羥基丁二酸，是重要的有機酸和生物煉製平臺化合物。L-蘋果酸具有天然果實的酸味特 徵，L-蘋果酸的酸感強度約相當於檸檬酸的1.2倍，味覺自然豐厚，產熱量更低，可以替代檸檬酸作為食品添加劑加以應用。聚蘋果酸的可以由出芽短梗黴(Aureobasidium pulIulans)以澱粉或葡萄糖為原料發酵生產聚蘋果酸，該過程是以三羧酸循環(TCA)代謝產生的蘋果酸經聚蘋果酸聚合酶聚合而成聚蘋果酸，聚合過程需要ATP的參與。而細胞內源ATP產生達到飽和條件下，無法繼續增加，因此在一定程度上影響了聚蘋果酸的得率。因此急需一種提高聚蘋果酸產量的培養基，能夠大幅度提高聚蘋果酸的產量。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的之一在於提供一種提高聚蘋果酸產量的培養基，在培養基中通過添加外源能源供體，提高細胞內ATP的供應量，從而提高聚蘋果酸的產量。為了實現上述為目的，本發明的技術方案為
提高聚蘋果酸產量的培養基，所述培養基是含有1-20 g/L的檸檬酸或檸檬酸鹽。優選的，所述培養基還包括葡萄糖50-200g/L、氮源l_5g/L、KH2P04 O. 005-0. 3g/L、ZnSO4 O. 005-0. 3g/L、MgSO4 O. 005-0. 3g/L、玉米漿 0. 05_3g/L 和 CaCO3 10-50 g/L。更優選的，所述培養基由葡萄糖100-150g/L、氮源2_4g/L、KH2PO4 O. 05-0. 2g/L、ZnSO4 O. 05-0. 2g/L、MgS04 O. 05-0. 2g/L、玉米漿 0. 5_2g/L、檸檬酸或檸檬酸鹽 5_15g/L 和CaCO3 20-40 g/L 組成。最優選的，所述氮源為硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀或硝酸鈉；所述檸檬酸鹽為檸檬酸鈉。本發明中檸檬酸可以用分析級檸檬酸，為降低生產成本也可以為工業生產檸檬酸中檸檬酸發酵液經結晶剩餘的液體，即檸檬酸母液。檸檬酸母液為檸檬酸發酵液經鈣鹽法提取工藝，檸檬酸結晶後剩餘的液體，檸檬酸母液中含檸檬酸60wt%，以及殘糖、蛋白、色素及 Ca2+、Fe3+、S042_ 等離子。本發明目的之二在於提供培養基的應用，技術方案為所述培養基在利用出芽短梗黴{Aureobasidium pulIulans )生產聚蘋果酸中的應用。本發明的目的之三在於提供利用培養基的方法，技術方案為
利用所述培養基生產聚蘋果酸的方法，包括以下步驟
將出芽短梗黴的活化種子液接種於所述提高聚蘋果酸產量的培養基中，在溫度為23-30°C震蕩培養96小時以上。優選的，將所述活化種子液與所述培養基按體積比為1:10-20接種，在溫度為25°C、轉速為180-1000 rpm條件下培養96-200小時。更優選的，所述活化的種子液的製備方法是將出芽短梗黴接種於種子培養基，在溫度為23-30°C震蕩培養至0D_= O. 4，得活化種子液；所述種子培養基為葡萄糖40_100g/ L^NH4NO31-5 g/L、KH2PO4 O. 005-0. 3g/L、ZnSO4 O. 005-0· 3g/L、MgSO4 0· 005-0· 3g/L、玉米漿0.05-3 g/L和 CaCO3 10-50 g/L。最優選的，所述出芽短梗黴為出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M2012223。本發明有益效果在於本發明公開的提高聚蘋果酸產量的培養基，由於含有適量的檸檬酸或檸檬酸鹽能夠為出芽短梗黴提供外源能源供體，能夠提高出芽短梗黴胞內的ATP，因此能夠有效提高聚蘋果酸的產量，打破了聚蘋果酸合成中的瓶頸；同時利用出芽短梗黴發酵的終產物為聚蘋果酸，解決了傳統路線發酵直接產生蘋果酸會抑制菌種產酸能力的問題，因而能夠獲得高濃度的聚蘋果酸發酵液，發酵液中聚蘋果酸最高達48. 48g/L。本發明使用的出芽短梗黴FMT1801生產的聚蘋果酸還能直接分泌到胞外，用體積分數為95%的乙醇溶液即可沉澱，容易提取，工藝步驟簡單，適合大規模工業生產，獲得的聚蘋果酸可通過酸水解獲得蘋果酸產品。本發明中朽1檬酸可以由朽1檬酸母液提供，我國是朽1檬酸發酵生產的世界第一大國。採用鈣鹽法或色譜法從發酵液中提取檸檬酸，提取後檸檬酸母液中含有大量都會產生大量的檸檬酸，直接丟棄造成資源浪費，如果將其回收繼續提取，容易導致產品收率下降，並影響產品質量等問題。因此本發明將檸檬酸母液添加，提高聚蘋果酸產量，同時解決檸檬酸母液資源浪費等問題。菌種保藏
本發明中出芽短梗黴(Jtfreo AaWia pul Iulans^) FMT1801是從出芽短梗抱NRRLY2311經過自然分離獲得能高效利用蔗糖為碳源產生聚蘋果酸的菌株，送中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO: M2012223，地址位於中國武漢武漢大學，保藏日期為2012年6月12日，分類命名為出芽短梗黴Uareo如Wiws pullulans ) FMT1801。
具體實施例方式以下將結合實施例對本發明進行詳細的描述。優選實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件。本發明使用的發酵菌株為出芽短梗黴(Auroobasidium pullulans ) FMT1801CCTCC NO: M2012223，將出芽短梗黴 FMT1801 CCTCC NO: M2012223 製備成 OD6tltl= O. 4 左右的菌液，為出芽短梗黴FMT1801種子液，備用。實施例I
生產聚蘋果酸的方法，具體步驟為a.種子活化
將出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M2012223接種於種子培養基中，接種量按照出芽短梗黴FMT1801種子液與種子培養基的體積比為1:200，種子培養基配方為葡萄糖40 g/L、硝酸銨 O. 005 g/L、KH2PO4 O. 005g/L、ZnSO4 O. 005g/L、MgSO4 O. 005g/L、玉米漿 O. 5g/L 和CaCO3 10g/L，在溫度為23°C、轉速為250 rpm條件下震蕩培養72小時，得活化種子液。b.發酵
將步驟a所得活化種子液接種於含3L發酵培養基的5L發酵罐中，接種量按照活化種子液與發酵培養基的體積比為1:15，發酵培養基配方為葡萄糖50 g/L、氯化銨I g/L、KH2PO4 O. 005g/L、ZnSO4 O. 005g/L、MgSO4 O. 005g/L、玉米漿 O. 005g/L、檸檬酸 20g/ L 和CaCO3 10 g/L，在溫度為28°C、轉速為500 rpm，通氣量為I: O. 8條件下培養200小時，培養液用板框過濾機過濾，收集濾液，得發酵液。c.聚蘋果酸提取
將步驟b所得發酵液中加入相當於發酵液體積5倍的體積分數為95%的乙醇溶液，40C冷凍24小時，轉速為4500rpm離心20分鐘，收集沉澱，得到聚蘋果酸。本實施例中，聚蘋果酸產量為38.76 g/L，獲得的聚蘋果酸用體積分數為95%的乙醇洗滌3次後，將沉澱溶解在濃度為2 M硫酸中，在80°C條件下水解12小時，得到蘋果酸，蘋果酸產量為43. 97g/L。實施例2
生產聚蘋果酸的方法，具體步驟為 a.種子活化
將出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接種於種子培養基中，接種量按照出芽短梗黴FMT1801種子液與種子培養基的體積比為1:800，種子培養基配方為葡萄糖100 g/L、硝酸銨 5 g/L,KH2PO4 O. 3g/L,ZnSO4 O. 3g/L, MgSO4 O. 3g/L、玉米漿 3 g/L、檸檬酸 15 g/L和CaCO3 50g/L在溫度為28°C、轉速為300 rpm條件下震蕩培養36小時，得活化種子液。b.發酵
將步驟a所得活化種子液接種於含50mL發酵培養基的搖瓶中，接種量按照活化種子液與發酵培養基的體積比為1:10，發酵培養基配方為葡萄糖200 g/L、硝酸銨5 g/L、KH2P04
O.3g/L,ZnSO4 0.3g/L、MgS04 O. 3g/L、玉米漿 3g/L、檸檬酸鈉 12 g/L 和 CaCO3 50 g/L，在溫度為30°C、轉速為300rpm條件下震蕩培養150小時，培養液用板框過濾機過濾，收集濾液，得發酵液。c.聚蘋果酸提取
將步驟b所得發酵液中加入相當於發酵液體積4倍的體積分數為95%的乙醇溶液，40C冷凍36小時，轉速為5000rpm離心5分鐘，收集沉澱，得到聚蘋果酸。本實施例中，聚蘋果酸產量為40. 67g/L，獲得的聚蘋果酸用體積分數為95%的乙醇洗滌3次後，將沉澱溶解在濃度為2 M硫酸中，在80°C條件下水解12小時，得到蘋果酸，蘋果酸產量為46. 14 g/L。實施例3
生產聚蘋果酸的方法，具體步驟為 a.種子活化將出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M2012223接種於種子培養基中，接種量按照出芽短梗黴FMT1801種子液與種子培養基的體積比為1:500，種子培養基配方為葡萄糖80g/L、硝酸銨 4 g/L,KH2PO4 O. 2g/L,ZnSO4 O. 2g/L, MgSO4 O. 2g/L、玉米漿 2g/L 和 CaCO3 40 g/L 在溫度為25°C、轉速為180rpm條件下震蕩培養96小時，得活化種子液。b.發酵
將步驟a所得活化種子液接種於含50mL發酵培養基的搖瓶中，接種量按照活化種子液與發酵培養基的體積比為1:10，發酵培養基配方為葡萄糖150g/L、硝酸鈉4 g/L、KH2PO4O. 2g/L, ZnSO4 O. 2g/L, MgSO4 O. 2g/L、玉米漿 2g/L、檸檬酸母液 20 g/L 和 CaCO3 40 g/L,在溫度為23°C、轉速為180 rpm條件下震蕩培養96小時，培養液用板框過濾機過濾，收集濾液，得發酵液。c.聚蘋果酸提取
將步驟b所得發酵液中加入相當於發酵液體積3倍的體積分數為95%的乙醇溶液，40C·冷凍12小時，轉速為3500rpm離心45分鐘，收集沉澱，得到聚蘋果酸。·本實施例中，聚蘋果酸產量為46. 54g/L，獲得的聚蘋果酸用體積分數為95%的乙醇洗滌3次後，將沉澱溶解在濃度為2 M硫酸中，在80°C條件下水解12小時，得到蘋果酸，蘋果酸產量為52. 79g/L。本實施例中，檸檬酸母液為檸檬酸發酵液經鈣鹽法提取工藝，檸檬酸結晶後剩餘的液體，檸檬酸母液中含檸檬酸60wt%，以及殘糖、蛋白、色素及Ca2+、Fe3+、S042-等離子。實施例4
生產聚蘋果酸的方法，具體步驟為 a.種子活化
將出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M2012223接種於種子培養基中，接種量按照出芽短梗黴FMT1801種子液與種子培養基的體積比為1:100，種子培養基配方為葡萄糖60g/L、硝酸銨 2 g/L、KH2PO4 O. 05g/L、ZnSO4 O. 05g/L, MgSO4 O. 05g/L、玉米漿 O. 05g/L 和 CaCO3 20g/L在溫度為25°C、轉速為250 rpm條件下震蕩培養48小時，得活化種子液。b.發酵
將步驟a所得活化種子液接種於含50mL發酵培養基的搖瓶中，接種量按照活化種子液與發酵培養基的體積比為1:20，發酵培養基配方為葡萄糖100 g/L、硝酸鉀2 g/L、KH2P04
O.05g/L, ZnSO4 O. 05g/L,MgSO4 O. 05g/L、玉米漿 O. 5g/L、檸檬酸 I g/L 和 CaC0320 g/L，在溫度為25°C、轉速為220 rpm條件下震蕩培養144小時，培養液用板框過濾機過濾，收集濾液，得發酵液。c.聚蘋果酸提取
將步驟b所得發酵液中加入相當於發酵液體積2倍的體積分數為95%的乙醇溶液，40C冷凍24小時，轉速為4000rpm離心30分鐘，收集沉澱，得到聚蘋果酸。本實施例中，聚蘋果酸產量為41. 7g/L，獲得的聚蘋果酸用體積分數為95%的乙醇洗滌3次後，將沉澱溶解在濃度為2 M硫酸中，在80°C條件下水解12小時，得到蘋果酸，蘋果酸產量為47. 3g/L。實施例5
生產聚蘋果酸的方法，具體步驟為a.種子活化
將出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M2012223接種於種子培養基中，接種量按照出芽短梗黴FMT1801種子液與種子培養基的體積比為1:1000，種子培養基配方為葡萄糖70 g/L、硝酸銨 3 g/L、KH2PO4 O. I g/L, ZnSO4 O. 15g/L，MgSO4 O. lg/L、玉米漿 lg/L 和 CaCO3 30 g/L在溫度為25°C、轉速為220 rpm條件下震蕩培養48小時，得活化種子液。b.發酵
將步驟a所得活化種子液接種於含5L發酵培養基的IOL發酵罐中，接種量按照活化種子液與發酵培養基的體積比為1:10，發酵培養基配方為葡萄糖120 g/L、硝酸鉀3 g/L、KH2PO4 O. I g/L, ZnSO4 O. 15g/L、MgS04 O. lg/L、玉米漿 lg/L、檸檬酸鈉 lg/ L 和 CaCO3 30 g/L，在溫度為25°C、轉速為1000 rpm，通氣量為I: I. 6條件下培養96小時，培養液用板框過濾機過濾，收集濾液，得發酵液。c.聚蘋果酸提取
將步驟b所得發酵液中加入相當於發酵液體積2倍的體積分數為95%的乙醇溶液，40C冷凍24小時，在3000rpm條件下離心20分鐘，收集沉澱，得到聚蘋果酸。本實施例中，聚蘋果酸產量為48. 48g/L，獲得的聚蘋果酸用體積分數為95%的乙醇洗滌3次後，將沉澱溶解在濃度為2 M硫酸中，在80°C條件下水解12小時，得到蘋果酸，蘋果酸產量為55g/L。實施例6
生產聚蘋果酸的方法，具體步驟為
a.種子活化
將出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M2012223接種於種子培養基中，接種量按照出芽短梗黴FMT1801種子液與種子培養基的體積比為1:100，種子培養基配方為葡萄糖60g/L、硝酸銨 2 g/L、KH2PO4 O. 05g/L、ZnSO4 O. 05g/L, MgSO4 O. 05g/L、玉米漿 O. 05g/L 和 CaCO3 20g/L在溫度為25°C、轉速為250 rpm條件下震蕩培養48小時，得活化種子液。b.發酵
將步驟a所得活化種子液接種於含50mL發酵培養基的搖瓶中，接種量按照活化種子液與發酵培養基的體積比為1:15，發酵培養基配方為葡萄糖100 g/L、硝酸鉀2 g/L、KH2P04
O.05g/L,ZnSO4 O. 05g/L,MgSO4 O. 05g/L、玉米漿 O. 5g/L 和 CaC0320 g/L，在溫度為 25°C、轉速為220 rpm條件下震蕩培養144小時，培養液用板框過濾機過濾，收集濾液,得發酵液。c.聚蘋果酸提取
將步驟b所得發酵液中加入相當於發酵液體積2倍的體積分數為95%的乙醇溶液，40C冷凍24小時，轉速為4000rpm離心30分鐘，收集沉澱，得到聚蘋果酸。本實施例為對比實施例，聚蘋果酸產量為30. 86 g/L，獲得的聚蘋果酸用體積分數為95%的乙醇洗滌3次後，將沉澱溶解在濃度為2 M硫酸中，在80°C條件下水解12小時，得到蘋果酸，蘋果酸產量為35.01 g/L。由實施例f 5與實施例6相比聚蘋果酸的產量均有提高，其中實施例5提高最為明顯，提高了 57. 1%，其次為實施例3提高了 50. 8%，實施例I、實施例2和實施例4分別提高了 25. 6%、31. 8%和48. 5%，其機理為添加的檸檬酸或檸檬酸鹽能夠提高出芽短梗黴胞內的ATP，打破聚蘋果酸合成的瓶頸，提高聚蘋果酸的產量。
最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述， 但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和範圍。
權利要求
1.提高聚蘋果酸產量的培養基，其特徵在於所述培養基是含有1-20g/L的檸檬酸或檸檬酸鹽。
2.根據權利要求I所述提高聚蘋果酸產量的培養基，其特徵在於所述培養基還包括葡萄糖 50-200g/L、氮源 l_5g/L、KH2PO4 O. 005-0. 3g/L、ZnSO4 O. 005-0. 3g/L、MgSO4O. 005-0. 3g/L、玉米漿 0. 05-3g/L 和 CaCO3 10-50 g/L。
3.根據權利要求2所述提高聚蘋果酸產量的培養基，其特徵在於所述培養基由葡萄糖 100-150g/L、氮源 2-4g/L、KH2PO4 O. 05-0. 2g/L、ZnSO4 O. 05-0. 2g/L、MgSO4 O. 05-0. 2g/L、玉米漿0. 5-2g/L、檸檬酸或檸檬酸鹽5-15g/L和CaCO3 20-40 g/L組成。
4.根據權利要求1-3任一項所述提高聚蘋果酸產量的培養基，其特徵在於所述氮源為硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀或硝酸鈉；所述檸檬酸鹽為檸檬酸鈉。
5.權利要求1-4任一項所述培養基在利用出芽短梗黴pulIulans、生產聚蘋果酸中的應用。
6.利用權利要求1-4任一項所述培養基生產聚蘋果酸的方法，其特徵在於，包括以下步驟 將出芽短梗黴的活化種子液接種於所述提高聚蘋果酸產量的培養基中，在溫度為23-30°C震蕩培養96小時以上。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於將所述活化種子液與所述培養基按體積比為1:10-20接種，在溫度為25°C、轉速為180-1000 rpm條件下培養96-200小時。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特徵在於所述活化的種子液的製備方法是將出芽短梗黴接種於種子培養基，在溫度為23-30°C震蕩培養至0D_= O. 4，得活化種子液；所述種子培養基為葡萄糖 40-100g/L、NH4NO31-5 g/L、KH2PO4 O. 005-0. 3g/L、ZnSO4O. 005-0. 3g/L、MgSO4 0. 005-0. 3g/L、玉米漿 0. 05-3 g/L 和 CaCO3 10-50 g/L。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述出芽短梗黴為出芽短梗黴FMT1801CCTCC NO: M 2012223。
全文摘要
本發明公開了提高聚蘋果酸產量的培養基，含有1-20g/L的檸檬酸或檸檬酸鹽，能夠為芽短梗黴在發酵過程中提供外源能源供體，提高細胞內ATP的供應量，從而提高聚蘋果酸的產量，最高能提高57.1%；本發明公開的培養基能夠用於出芽短梗黴發酵產生聚蘋果酸，具有很好的經濟效益。
文檔編號C12P7/62GK102899365SQ201210200489
公開日2013年1月30日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者鄒祥, 戢運超, 吳小燕, 昝佔全, 馬海霞 申請人:西南大學