一種白土苓基原植物dna分子鑑別方法

2023-06-17 06:23:01 2

專利名稱：一種白土苓基原植物dna分子鑑別方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別是涉及白土苓DNA分子鑑別方法。
背景技術：
白土苓為百合科肖菝葜屬植物短柱肖菝葜Heterosmilax yunnanensis Gagnep., 華肖菝葜H. chinensis Wang或肖菝葜H. japonica. Kunth的乾燥塊莖。其混用比較嚴重， 尤其是與菝葜屬植物存在混用，二者植物形態差別不大，鑑別不易。肖菝葜，無刺灌木，攀緣，少有直立。葉紙質，少有近革質，有3-5條主脈和網狀支脈；葉柄具或不具卷鬚，在上部有一脫落點，因而在葉片脫落時總是帶著一段短的葉柄(纖柄肖菝葜幾乎不帶葉柄)。傘形花序生於葉腋或鱗片腋內；總花梗常多少扁平，在總花梗著生點和葉柄之間多半有一腋生芽；花小，雌雄異株；花被片合生成筒狀，稱花被筒，筒口一般有3 (2-6)小齒；雄花有3-12枚雄蕊，花絲或多或少合生成一柱狀體，少有完全分離；花葯基著，2室，內向，近藥隔邊緣開裂，無退化子房；雌花有3-6退化雄蕊，生於子房基部或筒上，絲狀或條形；子房3室，每室有2胚珠，柱頭3裂。漿果球形，有1-3顆種子。肖菝葜含有多種化學成分，主要含有皂苷類、蒽醌類、留醇類、黃酮類、有機酸類、 酚苷類、烷烴類、多糖類、鞣質類等成分。它具有清熱、除溼、解毒、通利關節的功效，臨床用於溼熱淋濁，帶下，疥癬，楊梅毒皰，筋骨攣痛，瘰癧癰腫及鉤端螺旋體等病。本屬區別於菝葜屬的唯一性狀是花被片合生成筒狀，而本屬植物的種間主要鑑別點也是在花。白土苓的花期較短，並受生長環境影響，生長分散，較難採集具有代表性數量的帶花植物，為白土苓藥材的基原鑑別增加了難度。

發明內容
本發明目的在於公開一種白土苓DNA分子鑑別方法，特別是白土苓中短柱肖菝葜、華菝葜和肖菝葜中DNA分子鑑別方法。本發明目的是通過如下方案實現的一種短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜的DNA分子鑑別方法，其特徵在於通過如下步驟實現(1)總DNA的提取取待測短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜植物葉片，提取獲得總DNA。(2) PCR 擴增選取葉綠體DNA基因間序列引物引物 1 Forward-Primer :5，-TTGAGCTCCATCTACAAATGG-3，引物 2 =Reverse-Primer :5，-CCCTTATCTAGCTAAAGGATT-3，進行PCR擴增，擴增結果用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(3)總DNA的序列測定PCR擴增產物直接送北京擎科新業生物技術有限公司測序。
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(4) DNA序列分析及植物鑑別測序結果先用Contig Express (Informax 2000)序列比對軟體校序，再用 BioEdit序列編輯軟體對序列進行編輯，尋找種間變異位點，結果為其中190bp的C/A替代和366-402bp37個鹼基插入/缺失是短柱肖菝葜的鑑別特徵位點；262_302bp40個鹼基和342-350bp9個鹼基的插入/缺失是華肖菝葜和肖菝葜的鑑別特徵位點。其中(1)所述的總DNA的提取的具體步驟為1)用研磨儀將用矽膠乾燥的葉片在2ml離心管中研磨至粉末狀。2)加入900μ 1預熱的2XCTAB提取液(十六烷基三甲基溴化銨4g ;NaCl 16. 364g ； 1MPH8. 0 的 Tris-HCl 20ml ；0. 5M EDTA 8ml)和 6 μ 1 β -巰基乙醇，60°C _70°C水浴溫浴1.5-2小時。3)將溫浴的材料冷卻至室溫，加入等體積的M 1的氯仿-異戊醇混合溶液，搖勻5-10分鐘，然後離心5-10分鐘，取上清液。4)將上清液轉移到一新的2ml離心管中，再加入等體積的M 1的氯仿-異戊醇混合溶液，搖勻5-10分鐘，然後離心5-10分鐘，取上清液。5)將上清液轉移到一新的1. 5ml離心管中，加入相當上清液體積70%的異丙醇， 沉降DNA，顛倒離心管2-3次，可見白色絮狀沉澱，-20°C冰箱中靜置30分鐘，離心5_10分鐘，棄上清液，得固體沉澱。6)固體沉澱用500 μ 1 75%乙醇和無水乙醇各洗1次，離心20_30s後棄上清，然後將離心管吹乾使乙醇完全揮發，得到短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜植物的總DNA。7)將上述的總DNA乾燥後加入0. 1 X TE緩衝液100 μ 1和1_2 μ 1的RNase (核糖核酸酶)於室溫下消化RNA11-13小時，混勻後用0.5-1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。其中 O) PCR擴增條件為PCR擴增反應採用20 μ 1體系，其組分及終濃度反應程序在92 °C -96 °C下反應2_6分鐘後，在92 °C -96 °C反應30秒-45秒， 550C -600C 25 秒 _；35 秒，70°C -74°C 1.分鐘 _2 分鐘，28-32 個循環後，再在 70°C _74°C下反應5分鐘-10分鐘。擴增結果用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均出現清楚的擴增條帶。其中O) PCR擴增條件優選為PCR擴增反應採用20μ 1體系，其組分及終濃度
10倍PCR緩衝液脫氧核糖核酸(dNTP) 引物1 引物2
DNA聚合酶提取的DNA溶液重蒸水加至
1.00~5.00μ1 1.00~2.30μ1 0.30~0.70μ1 0.30 0.70μ1 0.10~0.50μ1 0.30 0.70μ110倍緩衝液2.00μ1
脫氧核糖核酸(dNTP)1.60μ1
引物 10.50μ1
引物 20.50μ1
DNA聚合酶0.20μ1 提取的DNA溶液 0.50μ1
重蒸水14.7μ1反應程序94°C 4分鐘後，94 V 45秒，58 V 30秒，72 °C 1分30秒，30個循環後，再反應72°C 7分鐘。擴增結果用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。本發明提供了短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜的基因序列及鑑別方法。該種白土苓DNA分子鑑別方法具有高度的準確性，在近年來，DNA測序成本不斷降低，利用測序方法進行鑑別已成為一種趨勢。本發明所提供的方法為白土苓的鑑別提供了快速、實用的方法。下述實驗例和實施例進一步說明但不限於本發明。實驗例1對採摘不同地點的如下表的9種菝葜樣品(均通過專家鑑定)首先按照實施例1的方法提取基因組DNA和PCR擴增反應後，擴增結果用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 PCR擴增產物直接送基因公司(如擎科生物技術公司)測序。得到測序結果先用Contig Express (Informax2000)序列比對軟體校序，再用BioEdit序列編輯軟體對序列進行編輯， 尋找種間變異位點，序列分析結果(見序列表)所示表中的9種菝葜樣品共有14個變異位點，其中編號為1和2號的DNA序列在190bp的C/A替代並在366_402bp37個鹼基插入/缺失，證明該兩種編號為短柱肖菝葜；編號3-9的樣品第 2-302bp的40個鹼基和342_350bp 的9個鹼基的插入/缺失，證明編號3-9是華肖菝葜和肖菝葜。其餘位點是種內或種內種間同時存在的變異位點。表1 用於測定的9種來源不同的菝葜樣品
權利要求
1.一種短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜的DNA分子鑑別方法，其特徵在於通過如下步驟實現(1)總DNA的提取取待測短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜植物葉片，提取獲得總DNA；(2)PCR擴增選取葉綠體DNA基因間序列引物引物 1 :Forward-Primer :5，-TTGAGCTCCATCTACAAATGG-3，引物 2 =Reverse-Primer :5』 -CCCTTATCTAGCTAAAGGATT-3』進行PCR擴增，擴增結果用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測；(3)總DNA的序列測定PCR擴增產物直接測序；G) DNA序列分析及植物鑑別測序結果先用Contig Express序列比對軟體校序，再用 BioEdit序列編輯軟體對序列進行編輯，尋找種間變異位點，結果為其中190bp的C/A替代和366-402bp37個鹼基插入/缺失是短柱肖菝葜的鑑別特徵位點；262_302bp40個鹼基和342-350bp9個鹼基的插入/缺失是華肖菝葜和肖菝葜的鑑別特徵位點。
2.如權利要求1所述的DNA分子鑑別方法，其特徵在於其中(1)所述的總DNA的提取的具體步驟為(1)用研磨儀將用矽膠乾燥的葉片在2ml離心管中研磨至粉末狀；(2)加入900μ 1預熱的2XCTAB提取液和6μ 1β-巰基乙醇，60°C _70°C水浴溫浴 1. 5-2小時；(3)將溫浴的材料冷卻至室溫，加入等體積的M 1的氯仿-異戊醇混合溶液，搖勻 5-10分鐘，然後離心5-10分鐘，取上清液；(4)將上清液轉移到一新的2ml離心管中，再加入等體積的M 1的氯仿-異戊醇混合溶液，搖勻5-10分鐘，然後離心5-10分鐘，取上清液；(5)將上清液轉移到一新的1.5ml離心管中，加入相當上清液體積70%的異丙醇，沉降 DNA，顛倒離心管2-3次，可見白色絮狀沉澱，-20°C冰箱中靜置30分鐘，離心5_10分鐘，棄上清液，得固體沉澱；(6)固體沉澱用500μ 1 75%乙醇和無水乙醇各洗1次，離心20-30s後棄上清，然後將離心管吹乾使乙醇完全揮發，得到短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜植物的總DNA;將上述的總DNA乾燥後加入0. 1 XTE緩衝液100 μ 1和1_2 μ 1的RNase於室溫下消化RNAl 1_13小時，混勻後用0. 5-1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測；其中O) PCR擴增條件為PCR擴增反應採用20 μ 1體系，其組分及終濃度10倍PCR緩衝液1.00 5·00μ1脫氧核糖核酸(dNTP)1.00 2.30μ1引物10.30~0.70μ1引物20.30 0.70μ1DNA聚合酶0.10~0.50μ1提取的DNA溶液0.30~0.70μ1重蒸水加至20μ1反應程序在92°C -96°C下反應2-6分鐘後，在92°C -96。C反應30秒-45秒，55°C -60 V 25秒_；35秒，700C -740C 1.分鐘_2分鐘，28-32個循環後，再在70°C _74°C下反應5分鐘-10 分鐘。擴增結果用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均出現清楚的擴增條帶。
3.如權利要求1或2所述的DNA分子鑑別方法，其特徵在於其中Q)PCR擴增條件為PCR擴增反應採用20 Pl體系，其組分及終濃度10倍緩衝液2.00μ1 脫氧核糖核酸1.60μ1 引物10.50μ1 引物20.50μ1 DNA聚合酶0.20μ1 提取的DNA溶液0.50μ1 重蒸水14.7μ1反應程序94°C 4分鐘後，94°C 45秒，58°C 30秒，72°C 1分30秒，30個循環後，再反應 720C 7分鐘；擴增結果用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4.如權利要求1或2所述的DNA分子鑑別方法，其特徵在於其中(1)所述的總DNA的 提取的具體步驟為取待測短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜植物葉片，(1)用研磨儀將用矽膠乾燥的葉片在2ml的離心管中研磨至粉末狀；(2)加入900u 1預熱的2 X CTAB提取液，65°C水浴溫浴1. 5小時；(3)將溫浴的材料冷卻至室溫，加入等體積的M 1的氯仿-異戊醇混合溶液，搖勻5 分鐘，然後離心5分鐘，取上清液；(4)將上清液轉移到一新1.5ml離心管中，再加入等體積的M 1氯仿-異戊醇，搖勻 5分鐘，然後離心5分鐘，取上清液；(5)將上清液轉移到一新的1.5ml離心管中，加入相當上清液體積70%的異丙醇，沉降 DNA，顛倒離心管2-3次，白色絮狀沉澱，-20°C冰箱中靜置30分鐘，離心5分鐘，棄上清液， 得固體沉澱；(6)固體沉澱用200ill 70%的乙醇和200 ill無水乙醇各洗1次，離心30s後棄上清， 然後將離心管吹乾使乙醇完全揮發，得到短柱肖菝葜、華肖菝葜和肖菝葜植物的總DNA ；(7)將上述的總DNA乾燥後加入0.1 X TE緩衝液和1_2 u 1 RNase核糖核酸酶於室溫下 消化RNA過夜，混勻後用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
全文摘要
一種白土苓基原植物DNA分子鑑別方法。本發明公開一種白土苓DNA分子鑑別方法，特別是白土苓中短柱肖菝葜、華菝葜和肖菝葜中DNA分子鑑別方法。本發明是通過總DNA的提取、PCR擴增、總DNA的序列測定、DNA序列分析及植物鑑別而實現的，其中190bp的C/A替代和366-402bp37個鹼基插入/缺失是短柱肖菝葜的鑑別特徵位點；262-302bp40個鹼基和342-350bp9個鹼基的插入/缺失是華肖菝葜和肖菝葜的鑑別特徵位點。本發明白土苓DNA分子鑑別方法具有高度的準確性，為白土苓的鑑別提供了快速、實用的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102337330SQ201110200358
公開日2012年2月1日 申請日期2011年7月18日 優先權日2011年7月18日
發明者仰振球, 張思巨, 李進冉, 海麗娜, 胡紅宇, 範聖此, 袁慶軍 申請人:北京振東光明藥物研究院有限公司, 山西振東道地藥材開發有限公司