用於純化高分子量透明質酸的有效方法

2023-06-17 08:47:51 1

專利名稱：：用於純化高分子量透明質酸的有效方法
技術領域：
：本發明涉及改進的用於生產和純化透明質酸和它的鹽的技術。本發明也涉及具有生物醫學應用的透明質酸和它的鹽的生產和工藝最優化和純化。
背景技術：
：透明質酸(HA)是一種在細菌和包括人類在內的高等動物中具有生物功能的天然存在的生物聚合物。天然存在的HA可以在高等動物組織中發現，尤其作為胞間隙填充物(Balazs,Viscosupplementationanewconceptinthetreatmentofosteoarthritis.J.Rheumatol.Suppl.;39:3_9,(Aug.1993))。它在眼睛玻璃體液和關節滑液中的濃度最高(O'Regan,M.，Martini,I.，Crescenzi,F.，DeLuca,C,和Lansing,M.,Molecularmechanismsandgeneticsofhyaluronanbiosynthesis.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules16:283-286(1994))。在革蘭氏陽性的鏈球菌(Streptococci)中，發現它是圍繞在細菌周圍的粘液樣莢膜。透明質酸也稱作乙醯透明質酸或透明質酸鹽，是一種在結締組織、上皮組織和神經組織中廣泛分布的糖胺聚糖。它是胞外基質的主要組分之一。它主要有助於細胞增殖和遷移，且也可以參與有些惡性腫瘤的進展。乙醯透明質酸天然地存在於許多身體組織中，例如皮膚、軟骨和玻璃體液。因此它非常適用於靶向這些組織的生物醫學應用。在二十世紀七十年代和八十年代開發了第一種乙醯透明質酸生物醫學產品Healon,並批准用於眼外科手術(即，角膜移植術、內障外科、青光眼外科手術和修復視網膜剝離的外科手術)。其它生物醫學公司也生產用於眼外科手術的乙醯透明質酸品牌。乙醯透明質酸也用於治療膝蓋的骨關節炎。這樣的治療作為向膝關節中的注射過程來施用，且可以用於補充關節液的粘性，從而潤滑關節、緩衝關節和產生鎮痛作用。乙醯透明質酸也可以對軟骨細胞具有積極的生化效應。由於它的高生物相容性和它常存在於組織的胞外基質中，乙醯透明質酸在組織工程研究中作為生物材料支架日益得到普及。在有些癌症中，乙醯透明質酸水平與惡性腫瘤和預後差非常相關。乙醯透明質酸可以用作前列腺癌和乳腺癌的腫瘤標記。它也可以用於監控這些疾病的進展。乙醯透明質酸也可以在手術後用於誘導組織癒合，特別在內障外科後。現有的傷口癒合模型提出，更大的透明質酸聚合物出現在癒合早期，以在物理上為介導免疫應答的白細胞騰出空間。乙醯透明質酸是皮膚護理產品中的常見成分。術語「透明質酸鹽」是指透明質酸(HA)的共軛鹼。因為該分子通常以它的聚陰離子形式存在於體內，所以它最常見地稱作「乙醯透明質酸」。HA包含由通過￠1-3和￠1-4糖苷鍵交替連接的葡糖醛酸(GlcUA)和N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)組成的線性的、不分支的、聚陰離子二糖單元，如圖I所示。HA是糖胺聚糖家族的成員，該家族包括硫酸軟骨素、硫酸皮膚素(dermatinsulphate)和硫酸乙醯肝素。不同於該家族的其它成員，它不共價結合蛋白。在中性水溶液中，由於氫鍵形成，水分子和鄰近的羧基和N-乙醯基賦予聚合物構象勁度，這限制了它的柔性。氫鍵形成導致聚合物的獨特的水結合和保留能力。因而也斷定，水結合能力與該分子的分子量直接相關。已知每克HA可以結合最高達6升水(Sutherland,Novelandestablishedapplicationsofmicrobialpolysaccharides.TrendsBiotechnoll6:41-46,1998)。已經廣泛研究了透明質酸(HA)和它的衍生物在生物醫學實踐中的應用。該聚合物的生物相容性特徵已經引起矯形外科的注意，因為它可以用於粘稠物質手術，並允許外科醫生在組織之間安全地產生間隙。從HA構建粘稠物質手術植入物(Balazs，Aug1993，同前)。HA的粘彈性特徵已經用於補充關節中的潤滑。其也已經用於作為微囊的靶向藥物遞送。最後，因為它的高水保留能力，該EPS(胞外多糖)也在盈利的化妝品市場上佔有一席之地。在2003年，FDA批准乙醯透明質酸注射劑用於填充軟組織缺陷，例如面部皺紋。Restylane是該產品的常見商品名稱。乙醯透明質酸注射劑通過增加皮膚下容積來暫時平滑皺紋，效果通常持續6個月。另外，HA溶液的特徵在於粘彈性和假塑性。甚至在該聚合物的非常稀的溶液(其中形成非常粘稠的凝膠)中，也發現了這些特徵。通過HA的濃度和分子量，控制對於它作為生物材料的用途重要的HA溶液的粘彈性性質。來自不同來源的HA的分子量相差很大，其範圍從IO4至107Da。隨著它的產生經細胞膜擠出HA，這允許不受拘束的聚合物延伸，這可以導致產生非常高分子量的HA。分子量是最影響基於透明質酸的醫學設備的物理性質的參數。分子量影響透明質酸溶液的粘度對濃度概況，且在它的其它粘彈性性質中起重要作用。具體地，如果分子量增力口，其治療功效需要給定粘度的溶液要求更低的透明質酸濃度。已經表明，這為眼和矯形外科應用提供優點。能產生具有大於750，000道爾頓的分子量的醫學級透明質酸的方法因而具有顯著的商業潛力。在許多醫藥應用中，不希望在製劑中具有低分子量透明質酸，例如考慮到在美國專利號4，141，973中報導的低分子量HA的炎性作用。透明質酸用於有些銷售得非常好的商業化產品，包括SynviSC(Genzyme)、Orthovisc(Anika)、Seprafilm(Genzyme)>Restylane(Q-Med)、Healon(Pharmacia)、Amvisc(Med-Chem)等。但是，由於它的高成本,它僅以非常低的濃度用於這些產品中。HA具有比其它微生物EPS更高的商業價值。估計它的世界市場價值是5億美元，每千克售價約10萬美元。已經常規地從公雞冠和牛玻璃體液提取HA。但是，難以以工業上可行的速率從這些來源分離高分子量HA，因為它與在動物組織中存在的蛋白聚糖形成複合物(O'Regan等人，1994)。當它在動物組織中合成時，控制生物聚合物的分子量目前是不實際的。此外，動物衍生的生化試劑用於人治療的用途已經產生了倫理問題，且遇到與日俱增的阻力。除了倫理問題以外，存在與動物衍生的生化試劑用於人治療的用途有關的潛在傳染病危險。在可以從動物組織得到IOMDa鏈的條件下，有相當大的提高範圍。面討論的缺點已經迫使エ業上採用細菌發酵方法，希望得到商業上可行的生物聚合物。使用細菌發酵方法，HA被釋放進生長培養基，它輔助控制聚合物特徵，並導致提高的HA得率。通過上述途徑可以生產的生物聚合物的量在理論上是無限的。但是，細菌發酵的應用確實具有缺點。最近的趨勢是使用Lancefield氏A和C組鏈球菌，它天然地生產HA的粘液樣莢膜。HA莢膜是能使該革蘭氏陽性細菌避免宿主免疫防禦的生物相容性因子，且是它的特徵性高毒力水平的原因。使用細菌的提取和純化方法中的以前的後續提高已經導致HA的固有的分子量降低。鏈球菌發酵已經僅能生產範圍為l_4MDa的平均分子量的HA。如上面所討論的，高分子量是HA生物聚合物的希望的性質。本發明提供了得到具有高分子量的HA的方法。鏈球菌是營養上難養的兼性厭氧菌，它生產乳酸作為葡萄糖分解代謝的副產物。因此通過這些細菌回收的能量比需氧細菌更低。使用以前已知的方法從細菌發酵得到的HA得率特徵性地低(0.lg/g葡萄糖，0.15g/lh)。這樣的低得率滿足市場需求必然是費勁的。另外，發酵的嚴格營養需求通過禁止化學成分確知培養基用於生產規模發酵來影響經濟，並限制可以採用的複雜培養基的選擇。幾個研究組已經提供了建議的エ藝參數最優化，HA的エ藝模式的選擇，通過複雜培養基設計來最優化得率，和基於HA的發酵控制的模型。Cooney，M.J.，Goh,L.T.，Lee，P.L，衝:ロJohns，R.R.，structuremodel-basedanalysisandcontroloithehyaluronicacidfermentationbyStreptococcuszooepidemicus:Physiologicalimplicationsofglucoseandcomplex-nitrogen-limitedgrowth,BiotechnologyProgress，15:898-910(1999)；LarsM.Blank,RichardLMcLaughlin，LarsK.Nielsen,StableproductionofhyaluronicacidinStreptococcuszooepidemicuschemostatsoperatedathighdilutionrate,BiotechnologyandBioengineering，90(6)685-693(2005)；Johns,M.R.，Goh,L_T.，和Oeggerli，A.，EffectofpH,agitationandaerationonhyaluronicacidproductionbyStreptococcuszooepidemicus.BiotechnologyLetters16:507-512(1994);Kitchen，J.R.，和Cysyk,R.L，SynthesisandreleaseofhyaluronicacidbySwiss3T3fibroblasts，BiochemicalJournal，309:649-656(1995)；ArmstrongD，JohnsMR，CultureconditionsaffectthemolecularweightpropertiesofhyaluronicacidproducedbyStreptococcuszooepidemicus,Appl.Environ.Microbiol.,63:2759-2764(1997)。隨著時間的逝去，HA分子量已經變成研究人員的主要研究領域。研究人員例如Armstrong和Johns已經檢查了エ藝參數的作用，以確定對HA的分子量的作用。Armstrong，D.C，和Johns，M.R.,EffectofCultureConditionsonMolecularWeightofHyaluronicAcidProducedbyStreptococcuszooepidemicus,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,63:2759-2764(1997)；Armstrong,D.C，和Johns，M.R.，Improvedmolecularweightanalysisofstreptococcalhyaluronicacidbysizeexclusionchromatography,BiotechnologyTechniques，9:491-496(1995)。這些研究組已經發現，某些發酵參數影響生產的HA的分子量。Armstrong等人(1997)報導，諸如溫度、通氣和葡萄糖濃度的條件影響HA的分子量，而pH和攪拌不會。發現低生長溫度(28°C)、培養通氣和高起始葡萄糖濃度(40g/l)導致獸瘟鏈球菌(S.zooepidemicus)生產更高分子量的HA。以前的研究組也發現,培養pH和攪拌不影響HA發酵的分子量結果。具體地，Johns等人(1994)以前報導，pH和攪拌普遍地影響HA的生產，但是不影響分子量已知的事實是，細菌的比生長速率和HA的分子量成反比。該效應可以通過如圖2所示的HA合成的基於資源的代謝模型來解釋。以它的最簡單的形式，在細菌細胞內發生2個競爭過程，即細胞生長和HA的生物合成。這2個過程競爭有限的資源，例如碳、氮和能量。在低比生長速率，細胞指導更多的葡萄糖-衍生的活化的前體(即UDP-Glc和UDP-GlcNAc)進行HA合成而不是細胞壁合成。來自需氧葡萄糖分解代謝的更高的ATP得率有利於UTP形成，後者是HA合成的兩種活化的前體(即UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc)的形成所必需的。通過厭氧生長下乳酸鹽的生產，也耗盡了可以用於合成HA的葡萄糖。以前也觀察到HA生產的比速率(ggH隨著比生長速率的降低而增加。在活化的HA合成酶的密度不太可能改變的事實的條件下，更高的生產速率可以歸因於通過每種合酶的更高的聚合速率。增加的合酶活性可以源自由低生長速率導致的更高的細胞內底物濃度。通過合酶在它的壽命中可以聚合的前體的數目，確定生產的HA的分子量。基於該理論，合酶的超表達導致合成的HA的分子量的降低。實際上，它可以降低平均分子量，因為存在更多的酶競爭相同的資源。為重組大腸桿菌(E.coli)中聚羥基丁酸鹽合酶的超表達報導了類似的效應(Sim等人,PHAsynthaseactivitycontrolsthemolecularweightandpolydispersityofpolyhydroxybutyrateinvivo,"NatureBiotech.15:63-67,1997)。美國專利號4，897，349證實，通過控制生產透明質酸的微生物的代謝可利用的氧，可以得到提高的HA總得率。可利用的氧限於刺激希望的透明質酸的不成比例的更大生產。沒有研究關於碳源的培養條件。但是，該過程需要修改溶解氧，其通常不導致生產的HA的一致得率。歐洲專利EP0694616採用2.5%濃度的從保藏中心得到的獸瘟鏈球菌培養物。發酵在37°C進行約24小時，通過連續自動加入NaOHJfpH維持在7.00。在接種時加入33%的葡萄糖，且連續施用剩餘的葡萄糖。通過HPLC分析測得的該方法的得率低至0.8g/l，估計的平均分子量是約500，OOODa。日本專利JP62215397證實，在攪拌下在培養基中需氧培養能生產透明質酸的微生物，由於向培養基中加入糖幾次，培養基中糖的濃度總是保持在0.l_3w/v%。收集在培養基中積累的透明質酸。優選的糖是葡萄糖或乳糖。通過分離多糖的常規方法，分離在培養混合物中積累的透明質酸。在該專利中呈現的過程是補料分批過程，且不適用於連續分批過程。日本專利JP62257901公開了一種生產HA的方法，其可以通過在含有碳水化合物的培養基(例如，pH7.5，含有0.50%酵母提取物、0.75%蛋白腖、0.02%亞硫酸鈉和1_3%葡萄糖)中培養透明質酸生產細菌來得到。日本專利JP62289198提出一種方法，其中將生產透明質酸的微生物菌株例如馬鏈球菌(Sti^ptococcusequi)NK_850214接種進含有濃度為0.01_lwt%的精氨酸和/或穀氨酸以及蛋白腖、NaCl、痕量維生素等的液體培養基中，培養過程包含以將整個培養過程中碳水化合物濃度恆定保持在0.1-3W/V%的方式，在>3份劑量中每I升培養基加入>20g碳水化合物，例如葡萄糖。在日本專利JP05276972中，在含有表面活性劑的培養溶液中培養能生產透明質酸的微生物。在培養溶液中形成和積累透明質酸，並收集。日本專利JP06038783提供了ー種在エ業規模生產透明質酸的方法，其通過在營養培養基中培養屬於鏈球菌屬(Streptococcus)的生產透明質酸的微生物菌株實現。培養基在特定條件下含有特定量的糖組分(作為主要碳源)，同時通過通氣攪拌培養基。將屬於鏈球菌屬且能生產透明質酸的微生物菌株(例如，獸瘟鏈球菌)接種到含有>3%糖組分作為主要碳源的營養培養基上，且在通氣攪拌下在PH7和33°C培養4天。通過該方法得到的產量是2.lg/L。日本專利JP06319579提出了在含有葡萄糖和果糖作為主要碳源的培養基中生產透明質酸，以在培養混合物中積累高分子量的透明質酸。美國專利號4，784，990證實了得到透明質酸鈉的方法，其包含在適當條件下在劇烈攪拌下在含有糖組分作為碳源的營養培養基中培養鏈球菌屬的微生物。微生物生產大量高分子量透明質酸，且該專利涉及選擇微生物的方法，所述微生物生產增加量的透明質酸，且缺少溶血活性。獸瘟鏈球菌HA-116ATCC39920是ー種突變株。然後如下回收透明質酸鈉取出微生物和培養基中不溶的其它材料，從培養基沉澱透明質酸鈉，例如使用有機溶齊U，和回收沉澱。然後粉碎和乾燥沉澱。通過這些方法，可以生產特徵在於不存在致熱性和炎性活性的透明質酸鈉組合物。培養基具有基本上恆定的約6.0至7.5的pH，且使用包含沉澱、再溶解和再沉澱透明質酸鹽的方法，純化生物分泌進培養基中的透明質酸鈉。通過向培養基中加入第一種有機溶劑，例如異丙醇，可以使透明質酸鈉從培養基或濾液中沉澱。將沉澱再溶解於3%含水こ酸鈉，然後用第二種有機溶劑例如こ醇再沉澱。將第二次沉澱再溶解於3%含水こ酸鈉，且加入活性炭，以形成懸浮液。過濾懸浮液，且加入第三種有機溶劑例如丙酮，以生產透明質酸鈉沉澱。第一種、第二種和第三種有機溶劑各自可以是異丙醇、こ醇或丙酮。或者，可以在每個步驟中用相同的有機溶劑沉澱透明質酸鹽。例如，在所有3個沉澱步驟中，使用異丙醇從培養基沉澱透明質酸鈉。該專利中用於醫學級HA的方法包含使用去汙劑例如十六烷基氯化吡啶鐵，多溶劑沉澱步驟，矽酸鎂載體(florisil)處理等。美國專利號4，946，780提供了通過採用表面活性劑例如十六烷基氯化吡啶輸,從發酵生產HA的方法。該方法也包含下述純化程序，所述純化程序包含使含有透明質酸鈉的溶液接觸氧化鋁、活性炭或其混合物，然後接觸ニ氧化矽，以形成純化的透明質酸鈉溶液。該方法然後將醇加入純化的透明質酸鈉溶液，以沉澱純化的透明質酸鈉，並乾燥純化的透明質酸鈉。表面活性劑難以從產物去除，且使得需要用無致熱原水多次洗滌的步驟。美國專利號5，563，051公開了ー種方法，其中在發酵過程後，用特別合適的試劑殺死生物質。用於殺死生物質的試劑是甲醛，例如，以通常已知為福馬林的水溶液形式。用含有陰離子表面活性劑即十二烷基硫酸鈉的含水介質提取HA。該專利另外公開了具有通常是10，000至25，000道爾頓、且優選20，000道爾頓的適當分子量截止的超濾膜的應用。用8-20體積的純化水、優選約10體積的純化水滲濾包含溶解的HA的過濾的溶液,其中連續拋棄濾液。美國專利號6，489，467要求保護從生物源純化高分子量透明質酸的方法，其包括將含有來自生物源的高分子量透明質酸的水溶液的PH調節至I.7至3.3的pH範圍的步驟。該方法另外包含使用具有100，000道爾頓的標稱分子截止至0.45□的孔徑的濾器，滲濾在相同PH的水溶液，並從含有來自生物源的高分子量透明質酸的水溶液去除細胞。美國專利號7，002，007公開了ー些方法，它們包含使含有透明質酸鹽的來源接觸酸，以產生酸性的透明質酸鹽懸浮液，在有酸性緩衝液存在下，使該懸浮液接觸陰離子交換介質，且此後使所述介質接觸具有更高鹽含量的酸性緩衝液，以從培養基解吸透明質酸鹽。以前的生產HA的方法通常使用葡萄糖作為碳源。使用這些方法，得到的HA的分子量經常是2至4xl05Da，即相對低的分子量。此外，HA的固有粘度隨著它的分子量的増加而增加。該增加的粘度已經在發酵過程以及HA純化中產生主要障礙。儘管高分子量HA可能太大而不能穿透皮膚和血流，但它具有許多有價值的用途。例如，在局部用製劑中，高分子量HA可以用於眼外科手術和化妝品。同樣，高分子量HA可以用於粘弾性薄膜，以保留皮膚水分和阻斷外來物質。因此，提供一種生產高分子量HA的方法已經成為ー項挑戰和需要，所述高分子量HA包括滿足關於醫學應用所述的規定的那些，例如，在英國藥典(BritishPharmaacoepia)2003版中所述的規定。以前的純化HA的方法包含至少3個連續的溶劑沉澱步驟，由此導致增加數目的過程步驟和冷凍乾燥機的過載。以前的沉澱發酵液(fermentationbroth)的方法也包含使用表面活性劑或去汙劑，例如十六烷基氯化吡啶鐵/十六烷基三甲基溴化銨。剰餘的去汙劑或表面活性劑的去除増加所需的處理步驟的數目，它已經造成複雜性和成本。另外，以前已知的純化程序，例如用於實現高分子量HA的滲濾步驟，包含使用大體積的有機溶剤。這樣的溶劑的使用，造成按比例放大操作中的處理問題，並導致環境危險。本發明涉及生產和純化HA的方法的改進，所述HA例如高分子量HA和它的鹽，包括具有英國藥典2003版所述的醫學應用的那些。本發明提出了用於HA的高得率生產的簡單且經濟上可行的方法，其通過在合適的培養基中連續發酵細菌，例如獸瘟鏈球菌，以生產高得率的高分子量HA實現。本發明的方法優於傳統的分批培養，在後者中，降解酶可以開始分解鏈球菌屬的細胞壁，並將細胞內容物釋放進發酵液(fomenterbroth)中，從而導致HA的純化困難。此外，本發明也提出了透明質酸的純化方法，它包括與活性炭處理相組合的矽膠過濾和隨後的使用更少量溶劑的滲濾，由此產生具有生物醫學應用的更好質量的透明質酸。同樣，本發明提供了具有エ業應用的透明質酸和它的鹽的一種商業上可行的純化方法。
發明內容本發明的目的是，提供生產透明質酸的方法，所述透明質酸滿足藥典中關於醫學應用的規定。同樣，本發明的目的是，提供一種商業上可行的生產透明質酸和它的鹽的方法。本發明的目的是，提供由獸瘟鏈球菌生產的醫學級高分子量透明質酸。本發明的目的是，提供一種高分子量透明質酸，在HA的生產過程中不使用表面活性劑或去汙劑。本發明的目的是，最優化各種條件對本發明下的HA的分子量的作用，例如碳源、金屬離子和培養基組成。本發明的目的是，提供透明質酸的純化方法，產生具有生物醫學應用的更好質量的透明質酸。本發明的目的是，提供通過採用矽膠純化和碳處理兩個步驟，從透明質酸去除蛋白雜質的有效方法。本發明的目的是，提供在透明質酸的純化中使用更少量的溶劑的有效的滲濾方法。本發明的目的是，提供一種醫學級高分子量透明質酸。本發明的目的是，提供一種不使用表面活性劑或去汙劑的方法。本發明的目的是，提供用於純化透明質酸的單個循環過程。本發明的目的是，提供一種方法，其包含最小量的溶劑。本發明的目的是，採用矽膠和活性炭處理，去除至少90%的蛋白雜質。本發明的目的是，提供一種導致高分子量HA的用於恆定體積滲濾的方法。本發明的目的也是，提供按照英國藥典2003版的規定的HA。本發明提供了節省成本的生產高分子量透明質酸和它的鹽的方法。本發明會產生不含有表面活性劑或去汙劑的具有生物醫學應用的更好質量的透明質酸。本發明包含下述生產醫學級透明質酸的步驟。a)通過發酵製備HA,b)去除蛋白雜質，c)滲濾。在一個實施方案中，本發明使用發酵技術，來使用細菌生產高分子量透明質酸。在一個實施方案中，所述細菌是獸瘟鏈球菌。在另一個實施方案中，本發明使用碳源、金屬離子和培養基組成，其最優化高分子量HA的生產。在一個實施方案中，如下製備HA:在合適的培養基中起始培養微生物獸瘟鏈球菌，隨後在約300-500rpm攪拌和l_3vvm(體積/體積/分鐘(vol/vol/min))通氣下,通過將PH維持在中性範圍，在1-10升發酵罐中在約30-40°C將發酵液發酵約15-28小時。(通氣速率vvm=每分鐘每單位液體體積的氣流體積(體積/體積/分鐘))。溫育後，適當地用水稀釋發酵液，並澄清。用等體積的合適的溶劑(包括但不限於異丙醇)再沉澱在澄清的發酵液中存在的HA。然後將沉澱的高分子量HA轉化成它的鹽，其中它可以然後溶解，用於後續純化程序。在一個實施方案中，通過加入3%乙酸鈉和均化至完全溶解，將HA轉化成它的鈉鹽。在一個實施方案中，本發明提供了最優化HA的產量和分子量的培養條件。已經發現，HA的生產是生長相關的現象。通過控制培養條件，人們可以生產高分子量HA。例如，生產的HA的分子量隨著細菌生長而增加。在發酵過程開始時，更低的分子量群體(5000Da)是總HA的約60%。在發酵22小時結束時，約70%的總HA具有高分子量(>800KDa)(圖4)。另外，在HA的發酵過程中人們可以使用不同的金屬。已知金屬離子增強各種細菌的莢膜生產。測試了在發酵24小時結束時0.025%(終濃度)的CuSO4、MnSO4和ZnSO4對HA的得率的作用。儘管在對照(沒有加入金屬)和用CuSO4或MnSO4處理的瓶之間沒有顯著差異，但發現在用ZnSO4處理過的培養基中的總HA的相當大部分(60%)是在更高的分子量區域(>800KDa)(圖5)。同樣，可以改變培養基中的碳源即糖。測試了在含有各種類型的糖的培養基中的生長和HA生產。培養基中的不同糖影響生產過程中HA的分子量。儘管在大多數糖(2%終濃度)中的生長相當恆定，但乳糖和蔗糖給出比葡萄糖更好的高分子量HA(>800K)得率，所述葡萄糖產生更低分子量的HA(圖6)。與葡萄糖相比，使用蔗糖得到的HA的得率高至少10-倍，且發現HA的分子量高得多。如圖6所示，通過本發明使用蔗糖得到的HA的分子量大於SxlO5Da(即，SOOkDa)，而在葡萄糖培養基中，發現分子量是2至4xl05Da(即，200-400kDa)。檢查了培養基對高分子HA的生產的作用。在一個實驗中，改變培養基中的糖和酪蛋白水解物酶含量。在該實驗中，糖提供必需的能量，且酪蛋白酶水解物提供必需的氮源。圖7顯示了當培養基中的糖濃度從2%増加至5%且當酪蛋白水解物酶濃度從2.5%降低至1%時的結果。這些參數使HA產量增加了5-6g/L(圖7)。圖7中的「糖」是指蔗糖；「生物質」是指細胞密度，它反映微生物的生長。當糖濃度更低(2%)且酪蛋白酶水解物濃度更高(2.5%)時，或當僅糖濃度升高至5%時(數據未顯示)吋，產量更低。在一個實施方案中，如下製備HA:在合適的培養基中起始培養微生物獸痕鏈球菌，隨後在約300-500rpm攪拌和l-3vvm通氣下，通過將pH維持在中性範圍，在1_10升發酵罐中在約30-40°C將發酵液發酵約15-28小吋。在一個實施方案中，本發明提供了ー種從透明質酸去除蛋白雜質的有效方法。本發明採用矽膠過濾和活性炭處理，用於有效地去除蛋白雜質。在一個實施方案中，本發明提供了一種通過滲濾純化透明質酸的有效方法。本發明在該方法中採用更少量的溶剤。溫育後，適當地用水稀釋發酵液，並澄清。用等體積的合適的溶劑，包括但不限於異丙醇，再沉澱在澄清的發酵液中存在的HA。然後將沉澱的高分子量HA轉化成它的鹽，其中它可以然後溶解，用於後續純化程序。本發明通過加入3%こ酸鈉和均化至完全溶解，將HA轉化成它的鈉鹽。本發明也提供了ー種從透明質酸去除蛋白雜質的有效純化方法。該方法採用矽膠過濾和活性炭處理，用於有效地去除蛋白雜質。使用矽膠的初步處理會去除約68-70%的蛋白。離心去除矽膠後，用活性炭處理高分子量HA，這去除85-90%的蛋白。在一個實施方案中，該方法包含使ニ氧化矽處理過的樣品穿過浸潰在纖維素筒上的碳。在一個實施方案中，通過滲濾進ー步純化去除蛋白雜質後得到的溶液。本發明在該方法中採用更少量的溶剤。例如，在一個實施方案中，所述滲濾步驟包含，用溶劑(即無致熱原水)稀釋HA溶液，且該稀釋僅進行5次，不同於美國專利號6，489，467(Carlino等人(2002),Processforpurifyinghighmolecularweighthyaluronicacid)中所述的10次，從而顯著減小處理體積。可以使用連續方式的滲濾，它包含用無菌的、無致熱原的水稀釋，例如5次。在一個實施方案中，該過程還包含，通過經0.22ym孔過濾器的過濾，分離無菌的、純化的透明質酸。在另一個實施方案中，通過無菌過濾，可以得到用於生物醫學目的的透明質酸鈉產物。任選地，可以用異丙醇再沉澱透明質酸鈉，以產生純化的高分子量HA。可以凍幹得到的HA，直到水分含量小於5%。總之，本發明提供了一種改進的HA純化方法，其不採用酸性pH條件，且不使用任何去汙劑和表面活性劑。蛋白雜質的去除步驟不使用任何有害的化學試劑，例如福馬林。另外，所述純化方法採用更少的溶劑稀釋，且因此減少了冷凍乾燥機的負載。下述附圖構成本說明書的部分，且包括進來用於進一步證實本發明公開內容的某些方面。因而，參考這些附圖中的一幅或多幅以及本文所述實施方案的詳述，可以更好地理解本發明。圖I:顯示了包含GlcUA和GlcNAc的HA的二糖重複單元。圖2:顯示了鏈球菌中的HA生物合成途徑。圖3:說明了製備醫學級高分子量透明質酸的方法的流程圖。圖4.在獸痕鏈球菌生長過程中各種分子量的HA的分布。圖5.金屬離子對各種分子量的HA群體的作用。圖6.來自含有不同碳源的培養基的HA的HPLC概況。培養基補加了終濃度為2%的葡萄糖、蔗糖、乳糖或果糖。圖7.提高的HA產量的培養基最優化。起始蔗糖含量是5%，且酪蛋白水解物的濃度是I.0%。對應著g/100ml培養基；「糖」是指蔗糖；且「生物質」是反映微生物的生長的細胞密度。酪蛋白水解物酶用作細菌生長過程中的氮源。具體實施例方式本發明提供了從細菌發酵液得到醫學級高分子量HA的高得率的方法。本發明也提供了一種節省成本的純化HA的方法。定義本文使用的術語「透明質酸」或「HA」是指從任意生物來源得到的透明質酸。本文使用的術語「透明質酸鹽」是指HA的任意鹽形式，例如HA的鈉鹽。本文使用的術語「高分子量」是指具有至少1000KDa(100萬Da)分子量的HA或HA的鹽。術語「矽膠」是指多孔的、顆粒狀的二氧化矽，其從具有不同孔隙率的矽酸鈉合成地生產，且保留可利用的最高容量吸附劑。一個實例是Ineos銷售的矽膠。術語「活性炭」是指具有特別高的表面IR的材料。僅Ij活性炭就具有約500m2的表面積，通常通過氮氣吸附來泖丨定，且包括大量微孔。一個實例由Mi11ipore(Millistak+,ActivatedCarbonminicapsuleM40AC23HH3)銷售。術語「滲濾」是指一種交叉流過濾方法，其允許低分子量種類、水和/或溶劑穿過膜轉移，而不改變溶液體積。該方法用於純化保留的大分子量種類、增加低分子量種類的回收、緩衝液更換和簡單改變給定溶液的性質。它可以通過例如Sartoconslicecassettemod.No.3051465001E-SG，50kDaMWCO來實現。術語「中性pH」是指pH是7.0。在一個實施方案中，微生物源是能生產高分子量透明質酸的鏈球菌屬物種。例如，所述微生物源可以選自獸痕鏈球菌、馬鏈球菌和釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)。本文使用的術語「溶劑」是指任意有機或無機溶剤。在一個實施方案中，所述溶劑是異丙醇。如前面所指出的，HA的生產是生長有關的現象，且與生長負相關。在本發明的一個實施方案中，選擇平衡這2個過程的培養和發酵參數。HA的分子量隨著培養時間過去而増加，在生長期中早期檢測到更小的鏈，然後在生長的後面部分過程中檢測到高分子量HA。以前的研究,例如Armstrong和Johns的研究，已經表明當在細菌中生產HA吋，溫度、pH和攪拌速率急劇影響HA的分子量。當將結果與Armstrong等人(Armstrong和Johns,1997)進行的研究和其它常規方法的結果相對比時，其它研究人員發現，培養PH和攪拌速率在生產過程中不急劇影響HA的分子量。在本發明中，使用更低的溫度和通氣，以及其它參數，可以提高HA生產的得率，並增加生產的HA的分子量。以前的研究發現，起始葡萄糖濃度對HA的分子量有深遠影響。ー個研究組Armstrong和Johns提供了一種解釋，即當激活的糖單體UDP-GIcUA和UDP-GlcNAc在高濃度存在吋，HA鏈持續延伸。外部葡萄糖濃度可能已經與這些單體的內部濃度相關聯，因為它們源自葡萄糖，且它們的合成需要相當大量能量消耗(Armstrong和Johns,1997)。但是，在本發明中，發明人已經發現，就高分子量HA的生產而言，蔗糖和乳糖是比葡萄糖更好的碳源。因為蔗糖和乳糖是ニ糖，所以它們可以用作比葡萄糖更好的能量來源。本發明在一個實施方案中進ー步提供，在更高濃度的蔗糖或乳糖和在更低濃度的蛋白(例如酪蛋白水解物)上生長，生成5-6g/L的高分子量HA。發現HA的分子量在3.5-4.OxlO6Da範圍內。還已經研究了各種金屬離子對生產的HA的分子量的作用。在培養基中存在的金屬離子是細菌的氧化應激的原因，由此在該過程期間釋放出自由基，後者可以具有殺細菌作用。為了躲避，幾種細菌、特別有些假單胞菌屬(Pseudomonas)物種生產EPSs(胞外多糖)，例如藻酸鹽等，其輔助細菌侵入宿主並從而存活。KeithLMW,BenderCL.AIgT(I22)しontrolsAlginateProductionandTolerancetoEnvironmentalStressinPseudomonassyringae,J.Bacteriol,181:7176-7184(1999)。至少ー個組已經暗示，鏈球菌和哺乳動物透明質酸鹽合酶比其它金屬離子更偏好續離子用於生產高分子量HA(Yamada和Kawasaki,Microbialsynthesisofhyaluronanandchitinnewapproaches.J.Biosci.Bioeng.99:521-528,2005)。YamadaT和Kawasaki,2005提供了用鎂離子刺激的另ー種新的生產HA的小球藻病毒系統，其生產約0.5-lg/L的HA。在本發明中，金屬離子例如Cu和Mn不誘導高分子量HA的生產，儘管含有Zn的培養基中的相當大群體的HA是在高分子量範圍內。總之，本發明已經最優化了培養條件，其已經導致提高的高分子量HA產量，例如5-6gHA/L。在一個實施方案中，降低培養基中的酪蛋白水解物酶，且增加培養基中的糖濃度。這些條件導致更低的生長速率。因為HA的生產與生長成負比，所以獲得HA產量的增力口。在一個實施方案中，發酵24小時後，通過本發明得到的HA的分子量是約3.5xl06至3.9xl06Da。在本發明的一個實施方案中，提供了生產具有至少100萬Da分子量的高分子量透明質酸(HA)或它的鹽的方法，該方法包含(a)提供能生產HA的細菌；(b)提供包含二價金屬離子鹽(例如MgS04、CuS04、MnS04和ZnSO4)、酪蛋白水解物和碳源(例如乳糖或蔗糖)的營養培養基；(c)在營養培養基中培養細菌；和(d)在需氧條件下發酵、例如連續發酵營養培養基。能生產HA的細菌包括選自獸瘟鏈球菌、馬鏈球菌和釀膿鏈球菌的那些。在另一個實施方案中，營養培養基包含I%酪蛋白水解物和/或5%乳糖或蔗糖。在另一個實施方案中，營養培養基包含鋅，例如以ZnSO4形式，濃度為10g/L的酪蛋白水解物，和濃度為50g/L的選自乳糖和蔗糖的碳源。在另一個實施方案中，在30-40°C的溫度、300-500rpm的攪拌速率、l_3vvm的通氣和中性pH，進行所述發酵步驟至少15個小時。在另一個實施方案中，該方法生產分子量在約3.5xl06Da至4.OxlO6Da範圍內的HA或它的鹽。在一個實施方案中，該方法產生至少5g高分子量HA/升營養培養基。在一個實施方案中，發酵24小時後，HA的分子量是至少3xl06Da。本發明也提供了從生產的HA去除蛋白雜質的方法，其包含矽膠處理、然後活性炭處理兩步。後續的滲濾步驟也幫助確保高度純化的HA的鹽。然後可以無菌過濾這樣得到的產物，用於生物醫學應用。以前已知的純化方法使用去汙劑或表面活性劑(例如十六烷基氯化吡啶輸,/十六烷基三甲基溴化銨)沉澱HA。但是，這需要多個步驟來去除殘餘的去汙劑或表面活性齊U。本發明提供了一種有效的HA純化方法，它不採用去汙劑或表面活性劑。以前已知的使用滲濾技術純化HA的方法已經包含用溶劑大量稀釋，例如稀釋10次。參見美國專利號6，489，467(Carlino,等人,Processforpurifyinghighmolecularweighthyaluronicacid(2002))0大體積溶劑的應用在更大規模的操作中產生問題,例如更大的處理容器和更長的時間來完成過程，和當然更高的生產成本。本發明通過使用更少的稀釋，避免了這種問題。在一個實施方案中，從細菌發酵液純化透明質酸(HA)或它的鹽的方法包含(a)稀釋和澄清發酵液；(b)用等體積的溶劑，例如異丙醇、乙醇或丙酮，沉澱在發酵液中存在的HA；(c)將沉澱的HA或它的鹽溶於溶液，例如3%乙酸鈉；(d)將矽膠加入來自步驟(c)的HA溶液或HA鹽溶液，然後去除矽膠，例如通過離心；(e)用活性炭處理來自步驟(d)的HA溶液或HA鹽溶液；和(f)使用溶劑，例如約5體積的無菌無致熱原水，滲濾來自步驟(e)的HA溶液或HA鹽溶液；其中在沒有任何去汙劑或表面活性劑或福馬林存在下和在中性PH進行該過程。在另一個實施方案中，該方法另外包含將在步驟(b)中沉澱的HA轉化成它的鹽，然後在步驟(C)的溶液中均化HA鹽。在另一個實施方案中，在步驟(e)中將活性炭浸潰在纖維素筒上。在另一個實施方案中，該方法另外包含，通過無菌過濾器過濾，分離無菌的、純化的HA或它的鹽；和/或凍幹HA或它的鹽，直到水分含量小於5%。包括下面的實施例用於證實本發明的優選實施方案。本領域技術人員應明白，在下面的實施例中公開的技術代表發明人發現的在本發明的實踐中較好發揮作用的技術，且因而可以視作構成它的實踐的優選模式。但是，本領域技術人員根據本發明的公開內容應明白，在不背離本發明的精神和範圍的情況下，在公開的特定實施方案中可以作出許多改變，且仍然得到相似或類似的結果。實施例I:細菌菌株和培養基。從美國典型培養物保藏中心得到馬鏈球菌獸瘟亞種ATCC39920。在腦心浸液瓊脂或胰腖豆腖培養液上維持細菌。實施例2:HA的估計用等體積的異丙醇沉澱並再溶解於3%乙酸鈉溶液後，通過咔唑測定(Bitter，T.,和Muir,M.,Amodifieduronicacidcarbazolereaction.AnalBiochem4:330-334,1962)常規地估計發酵液中的HA。實施例3:培養基最優化對於培養基最優化實驗，在由2.5%酪蛋白水解物酶、I%酵母提取物、0.2%K2HP04、0.15%NaCUO.04%MgSO47H20和2%碳源(蔗糖)組成的培養基中培養獸瘟鏈球菌。在37°C、在200rpm在錐形瓶中培養生物24小時。為了評價金屬離子對HA生產的作用，在0.025%的終濃度，將過濾除菌的CuS04、ZnSO4和MnSO4溶液加入培養基。參見圖5。實施例4:分子量測定使用串聯連接的ShodexOH-PakSB805-804HQ柱，通過大小排阻層析在HPLC上測定HA的分子量。使用的流動相是IMNaNO3，流速為Iml/分鐘，且使用RI檢測器檢測峰。用不同分子量的支鏈澱粉標準校正柱。實施例5:蛋白雜質的去除矽膠處理用2%終濃度的用於吸附蛋白的矽膠，以分批模式處理部分均化的懸浮液100ml。該步驟去除68-70%的蛋白。通過在12，OOOrpm、在4°C離心20分鐘，從透明質酸鈉溶液分離矽膠。活性炭處理用炭吸附的0.45U過濾器集合(Millipore,Millistak+,ActivatedCarbonminicapsuleM40AC23HH3),進一步處理高分子量透明質酸溶液。流速是14ml/分鐘。該步驟去除85-90%的剩餘蛋白。實施例6:純化連續模式滲濾使用連續模式滲濾方法,進一步純化穿過碳過濾器的流通物(flowthrough)。將稀釋的HA溶液泵入(流速15ml-20ml/分鐘)配有50kDa截止聚醚碸盒(Sartoconslicecassettemod.No.3051465001E-SG)的交叉流過濾器架。在開始將水性發酵液供給過濾器時，關閉滲透閥，以再循環水性發酵液幾次，直到系統穩定且在滲餘物(retentate)中看不到氣泡。10分鐘後打開滲透閥，且在進料儲器中再循環水性發酵液另外10分鐘，以確保沒有透過滲透閥的跨膜HA洩漏。15分鐘後，分別收集滲透物和滲餘物。在含有HA溶液的儲器中，連續加入5個等價體積的無菌的、無致熱原的蒸餾水。以與濾液的流出速率相同的流速，向HA溶液加入水。交叉流過濾器架的入口壓力維持在約0.5-1.5巴(bar)。滲餘物用於進一步回收透明質酸，且拋棄滲透物。基本上，滲透物不含有HA。將滲餘物濃縮至原始體積，並分析純度。滲濾步驟去除80-85%的剩餘蛋白。無菌過濾最後對來自滲濾過程的濃縮的透明質酸溶液進行0.22iim無菌過濾(Milliporestericup:SCGPU02RE，PVDF過濾器材料)，這產生合格用於生物醫學應用的產物。凍幹這樣形成的產物，以得到醫學級高分子量透明質酸鈉。實施例7:最優化的製備和純化HA的參數在由I%酵母提取物、I%酪蛋白水解物酶、0.2%K2HPO4^O.15%NaCUO.04%MgSO47H20和5%蔗糖組成的培養基中，培養獸瘟鏈球菌ATCC39920。在Ivvm通氣、400rpm、37°C，在IL培養基中培養生物24小吋。通過連續加入NaOH水溶液，將培養基的pH維持在7.O。溫育後，用I體積的水稀釋發酵液，並通過在10，000rpm、4°C離心20分鐘進行澄清。用等體積的異丙醇沉澱在澄清的發酵液中的HA。使用機械勻楽;器(Kinematica-A.G.,polytronPT2100)在15000rpm,將通過在10,000rpm、4°C離心20分鐘分離的沉澱懸浮於IL3%こ酸鈉中10分鐘，重複3個循環。用2%終濃度的用於吸附蛋白的矽膠，處理均化的溶液。該步驟去除85%的蛋白。通過在12，OOOrpm、在4°C離心20分鐘，從透明質酸鈉溶液分離娃膠。用碳吸附的0.45u過濾器集合(Millipore,Millistak+,ActivatedCarbonminicapsuleM40AC23HH3),進一步處理高分子量透明質酸溶液。流速是14ml/分鐘。該步驟去除60%的剩餘蛋白。使用連續模式滲濾方法，進ー步純化來自碳過濾器的流通物。將稀釋的HA溶液泵入(流速15ml_20ml/分鐘)配有50kDa截止聚醚諷盒(Sartoconslicecassettemod.No.3051465001E-SG)的交叉流過濾器架。在開始將水性發酵液供給過濾器吋，關閉滲透閥，以再循環水性發酵液幾次，直到系統穩定且在滲餘物中看不到氣泡。10分鐘後打開滲透閥，且在進料儲器中再循環水性發酵液另外10分鐘，以確保沒有透過滲透閥的跨膜HA洩漏。15分鐘後，分別收集滲透物和滲餘物。在含有HA溶液的儲器中，連續加入5個等價體積的無菌的、無致熱原的蒸餾水。以與濾液的流出速率相同的流速，向HA溶液加入水。交叉流過濾器架的入口壓カ維持在約0.5-1.5巴。滲餘物用於進ー步回收透明質酸，且拋棄滲透物。基本上，滲透物不合有HA。將滲餘物濃縮至原始體積，並分析純度。滲濾步驟去除70%的剩餘蛋白。最後對來自滲濾過程的濃縮的透明質酸溶液進行0.22iim無菌過濾(Milliporestericup:SCGPU02RE，PVDF過濾器材料)，這產生合格用於生物醫學應用的產物。凍幹這樣形成的產物，以得到醫學級高分子量透明質酸鈉，剰餘蛋白相對於HA的含量是0.031%，回收率是51%。實施例8將實施例I的方法按比例放大至10し可以再現HA的回收率和純化概況。終產物導致相對於HA具有0.066%蛋白的產品，且HA的回收率是82%。實施例9:相對分析下表是指相對分析權利要求1.從細菌發酵液純化透明質酸(HA)或它的鹽的方法，包含(a)稀釋和澄清發酵液；(b)用等體積的溶劑沉澱在發酵液中存在的HA；(c)將沉澱的HA或它的鹽溶於溶液；(d)將矽膠加入來自步驟(c)的HA溶液或HA鹽溶液，然後去除矽膠；(e)用活性炭處理來自步驟(d)的HA溶液或HA鹽溶液；和(f)使用約5體積的溶劑，滲濾來自步驟(e)的HA溶液或HA鹽溶液；其中在沒有任何去汙劑或表面活性劑或福馬林存在下和在中性PH進行該方法。2.根據權利要求I的方法，其中(a)在步驟(b)中沉澱的HA轉化成它的鹽，然後在步驟(c)的溶液中均化HA鹽；和/或(b)在步驟(c)中的溶液是3%乙酸鈉；和/或(c)在步驟(d)中通過離心去除矽膠；和/或(d)在步驟(e)中將活性炭浸潰在纖維素筒上；和/或(e)在步驟(f)中的溶劑是無菌的無致熱原水。3.根據權利要求I的方法，其中在步驟(b)中使用的溶劑選自異丙醇、乙醇和丙酮。4.根據權利要求3的方法，其中所述溶劑是異丙醇。5.權利要求I的方法，另外包含(g)通過無菌過濾器過濾，分離無菌的、純化的HA或它的鹽；和(h)凍幹HA或它的鹽，直到水分含量小於5%。6.根據權利要求I的方法，其中步驟(b)的溶劑是異丙醇，且該方法另外包含(g)凍幹HA或它的鹽，直到水分含量小於5%。7.權利要求1-6的任一項的方法，其中所述發酵液是通過包含以下步驟的方法獲得的(i)提供能生產HA的細菌；提供營養培養基來培養細菌，其中所述營養培養基包含二價金屬離子鹽、I%酪蛋白水解物和5%選自乳糖和蔗糖的碳源；(iii)在營養培養基中培養細菌；和(iv)在需氧條件下發酵營養培養基，其中所述透明質酸具有至少100萬Da的分子量。8.權利要求7的方法，其中(a)發酵是連續的；和/或(b)所述二價金屬離子鹽選自MgSO4、CuSO4、MnSO4和ZnSO4;和/或(c)在30-40°C的溫度、300-500rpm的攪拌速率、l-3vvm的通氣和中性pH，進行所述發酵步驟至少15個小時；和/或(d)所述HA具有在約3.5xl06Da至4.OxlO6Da範圍內的分子量，且該方法生產產量為至少5g高分子量HA/升營養培養基；和/或(e)所述細菌選自獸瘟鏈球菌、馬鏈球菌和釀膿鏈球菌。9.權利要求8的方法，其中所述鹽是ZnS04。10.權利要求9的方法，其中發酵24小時後，HA的分子量是至少3xl06Da。11.權利要求8的方法，其中所述細菌是獸瘟鏈球菌。12.權利要求I的方法，其用於生產透明質酸(HA)或它的鹽，該方法包含(a)提供能生產HA的細菌；(b)提供營養培養基來培養微生物源，其中所述營養培養基包含二價金屬離子鹽、I%酪蛋白水解物和5%選自乳糖和蔗糖的碳源；(C)在營養培養基中培養細菌；(d)在需氧條件下發酵營養培養基；(e)稀釋和澄清營養培養基；(f)用溶劑沉澱在稀釋的培養基中存在的HA；(g)將沉澱的HA或它的鹽溶於溶液；(h)將矽膠加入來自步驟(g)的HA溶液或HA鹽溶液，然後去除矽膠；(i)用活性炭處理來自步驟(h)的HA溶液或HA鹽溶液；和(j)使用溶劑滲濾來自步驟(i)的HA溶液或HA鹽溶液；其中在沒有任何去汙劑或表面活性劑或福馬林存在下和在中性PH進行該方法；其中所述HA具有至少100萬Da的分子量。生產透明質酸(HA)或它的鹽的方法，該方法包含(a)提供能生產HA的細菌；(b)提供營養培養基來培養細菌，其中所述營養培養基包含鋅、濃度為10g/L的酪蛋白水解物和濃度為50g/L的選自乳糖和鹿糖的碳源；(c)在營養培養基中培養細菌；和(d)在需氧條件下發酵營養培養基，其中所述透明質酸具有至少100萬Da的分子量。全文摘要本發明涉及用於純化高分子量透明質酸的有效方法。一個實施方案涉及提供在獸瘟鏈球菌中生產高分子量HA的生長條件。例如，在包含更低的蛋白濃度(例如，1％酪蛋白水解物)和更高的糖濃度(例如，5％蔗糖)的培養基中生長，產生5-6g/L的高分子量HA，其範圍是3.5-4.0x106Da。本發明也提供了純化HA的有效方法，其包含用矽膠處理、然後用活性炭處理，隨後用更小體積的溶劑滲濾。文檔編號C12R1/46GK102617754SQ20121002748公開日2012年8月1日申請日期2007年7月6日優先權日2006年7月6日發明者A·卡帕特,H·維蘭卡,J·達門德拉,V·蘭加斯瓦米,V·桑託什,V·納塔拉申請人:利萊恩斯生命科學有限公司