一種威靈仙的有效組分及其製備方法與用途的製作方法

2023-06-17 11:23:46

專利名稱：：一種威靈仙的有效組分及其製備方法與用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種治療腫瘤疾病的中藥提取物，具體地說涉及從威靈仙中提取的有效組分，製劑及其製備方法與用途。
背景技術：
：腫瘤是一種常見病、多發病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的一類疾病。目前業內對惡性腫瘤的治療主要還是以手術、放療、化療為主，但許多化學抗癌藥物在作用於靶細胞時往往累及正常細胞，造成嚴重的副反應。植物藥的遺傳毒性不明顯，中草藥在抗癌抗突變方面有獨特的優勢和廣闊的應用前景，而且中藥在對腫瘤的輔助治療中也起到不容忽視的作用。紫杉醇即是典型的從植物中獲得的具有良好抗癌活性的天然化合物，現已開發為抗腫瘤藥物。目前我國危害性最為嚴重的腫瘤為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。特別是肝癌的發生率近年來有所增加。值得重視，這些腫瘤的病因學、發病學及其防治，均為我國腫瘤研究的重點。尋找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當前腫瘤研究的重要內容。我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質是研究和發現新藥先導化學物，開發新藥的天然寶庫。目前，我國從天然產物中提取活性物質，用於開發成治療腫瘤疾病、安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產物中提取活性物質，開發成具有抗腫瘤療效的新藥，具有重要應用價值和廣闊發展前景。威靈仙為一半常綠藤本植物。藥用部分為根。其性味功能辛，鹹，溫。祛風溼，通經絡，止痺痛，消骨鯁。辛，鹹，溫.歸膀胱經。其功能主治為1，祛風溼，通經絡主治風寒溼痺，肢節疼痛，麻木重著，屈伸不利者2，消痰水可用於痰飲積聚，凝滯而成的痃癖證
發明內容-本發明的目的在於提供一種威靈仙的有效組分。本發明的另一目的在於提供上述威靈仙有效組分的製備方法。本發明還提供含有上述威靈仙有效組分的製劑及該組分的用途。本發明的威靈仙有效組分，其製備過程包括以下步驟歩驟1:用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對威靈仙進行提取，步驟2:提取液經過色譜柱層析得洗脫液；步驟3:用製備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動相為水和乙腈，收集35.6-40.2分鐘洗脫液得到有效組分(或稱為C08)。其中步驟l中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1-5:1-5，優選為乙酸乙酯乙醇=1-2:1-2，最優選為乙酸乙酯乙醇=1:1。所述步驟中，步驟l具體為取威靈仙藥材，以乙酸乙酯乙醇=1-5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離後得到的提取液為提取物l，步驟2具體為將提取物l過正相矽膠柱，先用石油醚乙酸乙酯=47-53:1作為流動相洗脫，然後改換氯仿甲醇8-13:1作為流動相，得洗脫液，步驟3具體為用製備液相色譜繼續分離得到的洗脫液，流動相為水-A和乙腈-B，進行梯度洗脫，流速為9-llml/min,柱溫為室溫，收集35.6-40.2分鐘洗脫液得到有效組分。步驟3中所述梯度洗脫程序如下表1洗脫梯度表Time(min)A(%)B(%)090103050505059555595流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段35.6-40.2分鐘收集溶液，溶液經濃縮乾燥後得到有效組分。本發明優選的威靈仙有效組分製備方法，包括下列步驟將威靈仙藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.8-1.2)，加熱回流0.8-1.2小時，提取1-3次，合併濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(47-53:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇(8-13:l)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9-llml/min，柱溫為室溫。本發明最優選的威靈仙有效組分製備方法，包括下列步驟將威靈仙藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流l小時，提取2次，合併濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件:色譜柱為製備柱(ZorbaxSB-C18;21.2讓250mm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下Time(min)A(%)B(%)090103050505059555595流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段35.6-40.2分鐘收集溶液，溶液經濃縮乾燥後得到有效組分。本發明35.6-40.2分鐘收集的有效組分成分如下表表2成分表組分Rt(min)含量分子量化合物結構式fr.5-816,85-15%618Oleanolicacid3-glycosides扭22.125-35%2204,7-Dihydroxy-5-methyl國2H-1-benzopyran-2-oneOz\〇ztableseeoriginaldocumentpage7本發明還提供用本發明的中藥有效組分作為藥物活性成分製備成的藥物組合物，本發明的藥物組合物，包括有效組分，根據需要該組合物還可以加入藥物可接受的載體。本發明的組合物，是單位劑量的藥物製劑形式，所述單位劑量形式是指製劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋等。本發明的組合物其中的有效組分，其在製劑中所佔重量百分比可以是0.1-99.9%，其餘為藥物可接受的載體。本發明的組合物，通過將上述有效組分和藥物可接受的載體混合製備得到。本發明的組合物，其藥物製劑形式可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、衝劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。本發明的制齊U，優選的是口服劑型，如膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等。本發明的組合物，其口服給藥的製劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調味劑和溼潤劑，必要時可對片劑進行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括澱粉、聚乙烯吡咯烷酮和澱粉衍生物，例如羥基乙酸澱粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的溼潤劑包括十二烷基硫酸鈉。可通過混合，填充，壓片等常用的方法製備固體口服組合物。進行反覆混合可使活性物質分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中。口服液體製劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復配的乾燥產品。這種液體製劑可含有常規的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸，並且如果需要，可含有常規的香味劑或著色劑。對於注射劑，製備的液體單位劑型含有本發明的活性物質和無菌載體。根據載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的製備通常是通過將活性物質溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然後密封。輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩衝劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩定性，可在裝入小瓶以後將這種組合物冰凍，並在真空下將水除去。本發明的組合物，在製備成藥劑時可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價鹼金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、胺基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、澱粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、矽衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環糊精、e—環糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發明的組合物在使用時根據病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次1-20劑，如l-20袋或粒或片。本發明還提供本發明的中藥有效組分和藥物組合物在抗腫瘤方面的應用。以下為抗腫瘤藥理實驗的數據對35.6-40.2分鐘段組分的活性篩選，在細胞水平上檢測有效組分對多種腫瘤細胞的生長抑制作用。藥效篩選藥理模型HL-60腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氫刺90%,胎牛血清(四季青)10。/。混合培養HL60細胞，密度需低於106個/mL。計算需要細胞總量NT=/ocellTnL-1xVTOo=2x104個/mL),其中VT-0.1mLx孔數+細胞槽剩餘量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10/;L,加10//L胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NL/4x104x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液V1mL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2-NT/NxV1。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入150/zL。種板後選取4孔加入200;uL培養液作為空白對照，剩餘孔加入200/;LPBS,以減少培養液的蒸發。給藥方案威靈仙C08有效組分加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。在新的96孔板中加入220〃L/孔的培養液，將吸取0.88/vL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50//L,此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50ng/mL。孵育48h。每個濃度設4個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200//L的培養液，將吸取0.88/vLDMSO加入混勻)，及陽性對照組(順鉑終濃度4;ug/mL)。SRB染色細胞培養結束後，取出培養板，每孔加入40%(質量/體積)的三氯乙酸(TCA)100uL固定細胞，室溫放置5min，4。C冰箱中放置1h。培養板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中乾燥後，每孔加0.4。/。的SRB100uL(1。/。色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內液體後用1%乙酸洗滌5遍，去除未結合的染料，空氣中乾燥後用10mmol/LTris150iiL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標儀(ELx800)觀啶，所用波長為490nm。抑制率的計算抑制率按如下公式計算袖^t"八藥物組」值一空白組/<值"no,抑制率(％)=-x100%陰性對照組」值一空白組」值藥效結果見表3。根據HL-60腫瘤細胞抑制率結果，威靈仙C08有效組分對抑制HL-60腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表3，HL-60腫瘤細胞抑制率結果tableseeoriginaldocumentpage10藥理模型K562腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%,非必需胺基酸(Gibco)1。/。混合培養K562細胞。計算需要細胞總量NT-pcell'mL-lxVT0^8x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數+細胞槽剩餘量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10/:L,加10/iL胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液VlmL,吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，毎孔加入100mL，孵育24h。種板後選取4孔加入培養液作為空白對照，剩餘孔加入100pLPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案威靈仙C08有效組分加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液150mL。在新的96孔板中加入220ml/孔的培養液，將吸取0.88/iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50mL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200ML的培養液，將吸取0.88/xLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿黴素終濃度4Mg/mL)。SRB染色細胞培養結束後，取出培養板，每孔加入40%(質量/體積)的三氯乙酸(TCA)70uL固定細胞，4'C冰箱中放置1h。培養板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中乾燥後，每孔加0.4%的SRB100uL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內液體後用1%乙酸洗滌5遍，去除未結合的染料，空氣中乾燥後用lOmmol/LTrisl50uL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標儀(ELx800)測定，所用波長為490nm。抑制率的計算抑制率按如下公式計算-抑制率(％)=藥畫-空畫戦陰性對照組/(值一空白組力值藥效結果見表4。根據K562腫瘤細胞抑制率結果，威靈仙C08有效組分對抑制K562腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表4，K562腫瘤細胞抑制率結果tableseeoriginaldocumentpage11藥理模型KB腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90。/。，小牛血清(賽樂)10%,非必需胺基酸(Gibco)1。/。混合培養KB細胞。計算需要細胞總量NT-pcellnnL-lxVT(p-2xl03個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數+細胞槽剩餘量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10/iL,加10ML胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min,10min)，吸去上清液，加入培養液VlmL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2二NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100/iL，孵育24h。種板後選取4孔加入培養液作為空白對照，剩餘孔加入IOOmLPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案威靈仙C08有效組分根據所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液150/iL。在新的96孔板中加入22(VL/孔的培養液，將吸取0.88/iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50pL,此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200/iL的培養液，將吸取0.88/xLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿黴素終濃度4/ig/mL)。MTT比色法測定取出培養板，去處每孔上清，加入培養液一MTT混合溶液(培養液MTT溶液二10:1)100/iL，孵育4h。吸棄培養液，每孔加入150/iL的DMSO，振蕩lOmin,550nm酶標儀(Ebc800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算鵬摔(％)=,諫-空白歸x醒陰性對照組^值一空白組力值藥效結果見表5。根據KB腫瘤細胞抑制率結果，威靈仙C08有效組分對抑制KB腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。tableseeoriginaldocumentpage12藥理模型MCF-7腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%,非必需胺基酸(Gibco)1%混合培養MCF-7細胞。計算需要細胞總量NT-pcelhmL-lxVT(p=2xl03個/mL),其中VT=0.1mLx孔數+細胞槽剩餘量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10pL，加10/iL胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液VlmL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100/iL，孵育24h。種板後選取4孔加入培養液作為空白對照，剩餘孔加入100;uLPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案威靈仙C08有效組分根據所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液150aiL。在新的96孔板中加入220ML/孔的培養液，將吸取0.88ML藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50/iL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50/zg/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200/xL的培養液，將吸取0.88/iLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿黴素終濃度4/ig/mL)。MTT比色法測定取出培養板，去處每孔上清，加入培養液一MTT混合溶液(培養液MTT溶液二10:1)100/iL，孵育4h。吸棄培養液，每孔加入150]LiL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(E函O)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物歸-空白歸。陰性對照組^值一空白組」值藥效結果見表6。根據MCF-7腫瘤細胞抑制率結果,威靈仙C08有效組分對抑制MCF-7腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表6，MCF-7腫瘤細胞抑制率結果tableseeoriginaldocumentpage13藥理模型HepG2腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%,胎牛血清(四季青)10%,非必需胺基酸(Gibco)P/。混合培養HepG2細胞。計算需要細胞總量NT-pcellnnL-lxVT(p-2xl03個/mL)，其中VT-0.1mLx孔數+細胞槽剩餘量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10/iL，加10/iL胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液VlmL,吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2二NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100fiL,孵育24h。種板後選取4孔加入培養液作為空白對照，剩餘孔加入IOOmLPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案威靈仙C08有效組分根據所稱量的藥品的重量，根據所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20"C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液150mL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養液，將吸取0.88/iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50/iL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配^^——加入200/xL的培養液，將吸取0.88mLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿黴素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測定取出培養板，去處每孔上清，加入培養液一MTT混合溶液(培養液MTT溶液=10:1)100/iL,孵育4h。吸棄培養液，每孔加入150/iL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(Ebc800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥訓-空畫德陰性對照組^值一空白組^值藥效結果見表7。根據HepG2腫瘤細胞抑制率結果，威靈仙C08有效組分對抑制HepG2腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表7，HepG2腫瘤細胞抑制率結果tableseeoriginaldocumentpage14本發明的有益效果為1.本發明的提取分離工藝中使用了正相矽膠柱，能有效地除去糖、蛋白質、胺基酸等雜質，提高有效成分的含量，同時採用了製備色譜，能快速準確的得到有效成分。2.本發明提供的威靈仙有效組分化學成分簡單明確，在藥理研究上更易於闡明其作用機制，在生產中更易於藥物的質量控制。本發明提供的方法首次從威靈仙藥材中得到含有C09有效組分，並首次將其在多種腫瘤細胞株上進行藥效篩選，由於成分確切，含量明確，製備工藝便捷，活性好，適宜開發成抗腫瘤中藥新藥。圖1為本發明威靈仙有效組分的HPLC分析圖。具體實施例方式下面將結合本發明的實施例進一步詳細說明本發明的實質內容，該實施例僅用於說明本發明而對本發明並沒有限制。實施例1威靈仙有效組分的製備取威靈仙藥材250g，將其粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流l小時，提取2次，濾液合併得提取液。將提取液濃縮成浸膏得8.8g，將浸膏和矽膠拌樣，用正相矽膠柱進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動相，得洗脫液I，然後改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動相，得洗脫液II，濃縮乾燥後得1.6g樣品。用製備液相色譜繼續分離得到的樣品。製備色譜的分離條件色譜柱為Agient製備柱(ZorbaxSB_C18;21.2mmx250mm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下complextableseeoriginaldocumentpage15流速為10ml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段35.6-40.2分鐘收集溶液，濃縮乾燥後得到有效組分組分0.04g。實施例2威靈仙有效組分的分析對實施例1的威靈仙有效組分的HPLC-ELSD聯用分析色譜條件色譜柱AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6咖X150mm,5ym);採用梯度洗脫，流動相A相為0.2%冰醋酸水溶液，流動相B相為含0.2%冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為90y。的0.2。/。冰醋酸水溶液、流動相B為10%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；10分鐘時，流動相A為50%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為50%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；30分鐘時，流動相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為95%的0.2W水醋酸的乙腈溶液；35分鐘時，流動相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mL'mirf';檢測波長全波長；柱溫3(TC;ELSD條件漂移管溫度105°C;氮氣流速2.0L/min供試品溶液的製備稱取本發明有效組分，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。測定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，測定。實施例3烕靈仙有效組分製劑取實施例1的威靈仙有效組分0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料後移至滴丸滴灌中，藥液滴至6-8'C液體石蠟中，除油，製得滴丸400粒。實施例4威靈仙有效組分製劑取實施例1的威靈仙有效組分0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水lml，上述組分混合均勻後，冷凍乾燥，分裝500支，即得。實施例5威靈仙有效組分製劑取降香油1.5g,加入到13ml飽和的羥丙基P-環糊精中，攪拌溶解，濾過，濾葉低溫乾燥，的降香油和羥丙基e-環糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥丙基e-環糊精的包合物粉末外，再取實施例1的威靈仙有效組分0.5g、甘露醇5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2ml，上述組分混勻後，冷凍乾燥，分裝300支，即得。實施例6威靈仙有效組分的製備操作步驟同實施例l，條件改為乙酸乙酯和乙醇(1:5)，正相矽膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯47:l作為流動相，得洗脫液I，然後改換氯仿和甲醇(8:1)作為流動相。操作步驟同實施例l，條件改為乙酸乙酯和乙醇(5:1)，正相矽膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯53:l作為流動相，得洗脫液I，然後改換氯仿和甲醇(13:1)作為流動相。實施例8威靈仙有效組分的製備操作歩驟同實施例l，條件改為乙酸乙酯和乙醇(1:2)，正相矽膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯47:l作為流動相，得洗脫液I，然後改換氯仿和甲醇(8:1)作為流動相。實施例9威靈仙有效組分的製備操作步驟同實施例l，條件改為乙酸乙酯和乙醇(2:1)，正相矽膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯53:l作為流動相，得洗脫液I，然後改換氯仿和甲醇(13:1)作為流動相。權利要求1、一種威靈仙有效組分，其特徵在於，其製備過程包括以下步驟步驟1用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對威靈仙進行提取，步驟2提取液經過色譜柱層析得洗脫液；步驟3用製備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動相為水和乙腈，收集35.6-40.2分鐘洗脫液得到有效組分。2、權利要求1的有效組分，其特徵在於，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1-5:1-5。3、權利要求1的有效組分，其特徵在於，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1-2:1-2。4、權利要求1的有效組分，其特徵在於，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1:1。5、權利要求l的有效組分，其特徵在於，所述步驟中，步驟l為取威靈仙藥材，以乙酸乙酯:乙醇=1-5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離後得到的提取液為提取物l，步驟2為將提取物l過正相矽膠柱，先用石油醚乙酸乙酯=47~53:1作為流動相洗脫，然後改換氯仿甲醇813:1作為流動相，得洗脫液，步驟3為用製備液相色譜繼續分離得到的洗脫液，流動相為水-A和乙腈-B，進行梯度洗脫。6、權利要求5的有效組分，其特徵在於，所述梯度洗脫程序如下:Time(min)A(%)B(%)090103050505059555595流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段35.6-40.2分鐘收集溶液，溶液經濃縮乾燥後得到有效組分。7、含有權利要求l-6任何一項有效組分的藥物組合物。8、權利要求1的有效組分的製備方法，其特徵在於，其製備過程包括以下步驟:步驟1:用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對威靈仙進行提取，步驟2:提取液經過色譜柱層析得洗脫液；步驟3:用製備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動相為水和乙腈，收集35.6-40.2分鐘洗脫液得到有效組分。9、權利要求8的有效組分的製備方法，其特徵在於，所述步驟中，步驟l為取威靈仙藥材，以乙酸乙酯:乙醇=1-5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離後得到的提取液為提取物l，步驟2為將提取物l過正相矽膠柱，先用石油醚乙酸乙酯=47~53:1作為流動相洗脫，然後改換氯仿甲醇8~13:1作為流動相，得洗脫液，步驟3為用製備液相色譜繼續分離得到的洗脫液，流動相為水-A和乙腈--B，梯度洗脫程序如下Time(min)A(%)B(%)090103050505059555595流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段35.6-40.2分鐘收集溶液，溶液經濃縮乾燥後得到有效組分。10、權利要求9的有效組分的製備方法，其特徵在於，步驟如下將威靈仙藥材粉碎後加入乙酸乙酯乙醇=1:1，加熱回流l小時，提取2次，合併濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚乙酸乙酯=50:1作為流動相，得洗脫液I，棄之,然後改換氯仿甲醇=10:1作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為製備柱ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm，流動相為水A和乙腈B，梯度洗脫程序如下Time(min)A(%)B(%)090103050505059555595流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段35.6-40.2分鐘收集溶液，溶液經濃縮乾燥後得到有效組分。全文摘要本發明涉及一種威靈仙的有效組分及其製備方法與用途，本發明的威靈仙有效組分，其製備過程包括以下步驟步驟1用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對威靈仙進行提取，步驟2提取液經過色譜柱層析得洗脫液；步驟3用製備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動相為水和乙腈，收集35.6-40.2分鐘洗脫液得到有效組分。文檔編號A61P35/00GK101347521SQ20071012327公開日2009年1月21日申請日期2007年7月20日優先權日2007年7月20日發明者靂劉,強史,水文波,程翼宇,靜竇,葛志偉,慶賀,陽霍申請人:天津天士力製藥股份有限公司