一種提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法

2023-06-16 21:44:01 2

一種提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，包括樣品的預處理、精子懸液的製作、精子的懸浮處理、精子膜蛋白分離、精子膜蛋白去脂純化、精子膜蛋白的SDS-PAGE檢測以及精子膜蛋白質譜檢測的步驟；本方法在傳統去汙法的基礎上，擬合了蛋白酶抑制劑和TM-PEK法的特點，所提取的魚類精子膜蛋白蓋度達到86%以上，平均每5×107個精子中可得到0.6mg膜蛋白和0.8mg胞質蛋白。本發明專利方法的推廣應用可以為魚類精卵作用機制以及受精機理的探明提供基礎資料；可以為魚類的增養殖尤其是江海洄遊性魚類的生殖繁育提供指導；可以為其他水生生物物種的精子膜蛋白研究提供有用的參考方法。
【專利說明】一種提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於動物精子檢測領域，特別涉及一種提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]動物的精子是一類結構和功能都十分特化的細胞，精子膜表面存在多種膜蛋白和蛋白受體複合物等，它們與精子發生、成熟獲能、精卵識別、受精過程等生殖生物學活動有重要功能。
[0003]精子膜表面蛋白是精子發生、成熟和精卵相互作用的重要分子，對其深入研究有助於揭示精子發生、成熟獲能和受精的生物學機制。成熟精子的質膜表面含有多種蛋白，它們自身固有或是外界粘附到精子表面，在維持精子形態結構完整等過程中發揮著重要的作用，特別是與精卵識別結合以及質膜融合等過程密切相關。因此精子膜蛋白組分的測定對於探索魚類精子獲能，精卵識別和生殖過程的生物學機制是非常重要的。
[0004]精子膜蛋白抽提方法通常是使用去汙劑、超聲破碎、蔗糖密度梯度離心、生物素化等方法進行。抽提得到的精子膜蛋白往往需要透析濃縮(李彥臻等，2008)，精子懸液懸浮處理(潘洪強，2001)和利用鏈親和素對膜蛋白進行分離富集和洗脫等(Shetty etal.，20 01)等步驟。這些步驟的會導致所提取精子膜蛋白的量和純度。目前，對人類和其他一些哺乳動物的精子膜蛋白研究報導較多，一些水生生物如海膽(Echinoidea)和鮑(Haliotis)是目前研究較多的實驗材料。但有關魚類精子膜蛋白的研究均未見報導。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在於為了克服以上現有技術的不足而提供一種提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法。
[0006]本發明是由以下技術手段實現的:
[0007]一種提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，按照以下步驟進行:
[0008](I)對所採集的魚類精巢或成熟精子樣本使用PBS與質量濃度為0.7%NaCl的漂洗緩衝液進行漂洗，除去碎屑物質，得到樣品液；
[0009](2)緩衝漂洗後，採用懸浮緩衝液對樣品進行懸浮處理0.5-lh ;加懸浮緩衝液再進行懸浮處理l_2h ;取懸浮上清液加精子膜蛋白分離液，混勻，置搖床上，冰浴緩慢振搖
1.5h，然後4°C離心，上清為精子膜蛋白溶液，沉澱為脫膜精子；
[0010](3)將得到的精子膜蛋白溶液轉移至試管中，在25°C下孵育15-20分鐘，對混合物進行離心，獲得懸液的相分層，上層為水相層，下層為膜蛋白混合物層；留下層液體用於後續的膜蛋白純化；使用冰浴的TBS將所得膜蛋白粗提物，重複精子膜蛋白的分離步驟，得到較好濃度和純度的精子膜蛋白，取少量溶液測其蛋白含量，其餘_20°C保存備用；
[0011](4)對所抽提的精子膜蛋白進行SDS-PAGE電泳，使用5XSDS-PAGE樣品溶解液對樣品進行處理；[0012](5)對所抽提的精子膜蛋白進行納米級串聯質譜Nano-LC MS/MS技術檢測。
[0013]所述的提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，步驟(1)中使用PBS的濃度可以為
0.01M0
[0014]所述的提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，步驟(2)中4°C離心條件可以為12000r/min,IOmin0
[0015]所述的提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，步驟(3)中離心條件可以為5000g，20-25分鐘。
[0016]所述的提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，步驟(3)中重複精子膜蛋白的分離步驟可以為2-4次[0017]基於對長江刀鱭等江海洄遊性魚類的精子膜蛋白提取和檢測的反覆驗證，本發明提供的方法可以高效快速提取魚類精子膜蛋白，可以平均從5X IO7個精子中可得到0.6mg膜蛋白，0.Smg胞質蛋白，整個提取過程可在2小時內完成。該方法與傳統的精子膜蛋白的提取方法相比，具有耗時少，效率高，在其他動物物種的精子膜蛋白研究中都可以推廣應用。通過該方法所提取的精子膜蛋白純度和蓋度高，可以用於精子發生和受精生物學的機制研究，研究結果可以為魚類的增養殖尤其是江海洄遊性魚類的生殖繁育提供指導。
[0018]本專利方法採用去垢劑法和精子懸液處理的方法提取魚類精子膜蛋白，具有耗時短，所提精子膜蛋白產量和純度高的優點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是提取長江刀鱭精子膜蛋白的SDS-PAGE檢測和WB鑑定圖。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
[0021]本實施例以長江刀鱭魚作為試驗對象，進行其精子蛋白的提取和檢測。
[0022]本實施例中所用的試劑以及配製方法如下:
[0023](I)A液:0.25M蔗糖，0.1M Tris-HCl,0.5M苯甲醯胺，ImM EDTA，等體積混合得到A液；
[0024]B液:質量比為5%果糖，0.01M枸櫞酸鈉，等體積混合得到B液；
[0025](2)懸浮緩衝液:由0.01M PBS緩衝液加0.05%鏈親和素常規溶液配製方法，等體積混合配製而成，用於後續精子抽提液的懸浮處理懸浮離心收集上清液；
[0026](3)精子膜蛋白分離液:l%Triton X-100,1.7%Triton X-114, IM NaCl 溶液，等體積混勻配製成精子膜蛋白分離液，用來提取魚類的精子膜蛋白；
[0027](4) 5 X SDS-PAGE 樣品溶解液:5 X loading buffer40ml，Tris 緩衝液 ρΗ6.8 (IM)10ml，甘油 8ml，10%SDS16ml，β -巰基乙醇 4ml，0.11% 溴酚藍，用 IM HCl 調 pH 至 6.8。
[0028]1、樣品採集與保存:
[0029]選取鮮活的長江刀鱭精巢組織，術者佩戴醫用口罩和塑膠手套等防止採樣汙染；採樣過程需要快速進行(l_2min內完成)，樣品立即使用4°C遇冷的PBS緩衝液漂洗。漂洗完成後放置於-20°C低溫冰箱保存。
[0030]2、樣品的預處理[0031]樣品立即使用4°C遇冷的0.01M PBS緩衝液漂洗，倒入消毒好且0.01M PBS與
0.7%NaCl的漂洗緩衝液浸潤或者衝洗處理的培養皿中靜置I小時，除去碎屑等雜質。緩衝漂洗後，採用所配製的懸浮緩衝液對樣品進行懸浮處理0.5h-lh ;加懸浮緩衝液再進行懸浮處理l_2h ;取懸浮上清液加精子膜蛋白分離液，混勻，置搖床上，冰浴緩慢振搖1.5h，然後4°C 12000r/min離心lOmin，上清為精子膜蛋白溶液，沉澱為脫膜精子，上清液用於後續的膜蛋白分離。
[0032]3、精子懸液的製作
[0033]取製備好的A液與樣品液等體積稀釋離心，精子沉澱液按體積比1:9加B液重新懸浮，再加入質量濃度為0.05%的乙基苯基聚乙二醇(NP-40)孵育2h至終濃度為含
0.05%NP-40。
[0034]將市場上購得的Triton X-114預濃縮配製得到均質Triton X-114混合物(IOmMTris-HCl pH7.4, 0.15mM EDTA和 PBSl.7%(W/V)Triton X-114) ? 用於後續精子膜蛋白的懸
浮分離。
[0035]4、精子的懸浮處理
[0036]在精子懸液中加入蛋白酶抑制劑AntipainlO μ L，防止樣品在準備期間蛋白的降解。將樣品在4°C下恆溫混勻儀中孵育一小時並輕微震蕩，4°C高速離心機lOOOOg，離心20分鐘。收集上清液用於後續膜蛋白的分離。
[0037]5、精子膜蛋白分離
[0038]上述分離所得的上清液在25°C下孵育15-20分鐘，混合物在25°C，5000g離心20-25分鐘，獲得懸液的相分層，上層為水相層，下層為膜蛋白混合物層。留下層液體用於後續的膜蛋白純化。使用冰浴的TBS(1%W/V Triton X-114)稀釋所得下層膜蛋白粗提物，重複精子膜蛋白的分離步驟2-4次，得到較好濃度和純度的精子膜蛋白。
[0039]6、精子膜蛋白去脂純化
[0040]採用去脂抽提蛋白的方法，對所分離的精子膜蛋白按照1:14體積比，與冰磷酸三丁酯(Tributyl phosphate, TBP):丙酮:甲醇(按體積比I:12:1)混合物混勻，4°C下恆溫孵育90分鐘。然後於4°C下恆溫2800g離心15分鐘，然後依次用適量體積(10X)的TBP，丙酮，甲醇沉澱蛋白，常溫乾燥，即得純化的精子膜蛋白，使用蛋白保存液保存備用。
[0041 ] 7、精子膜蛋白的SDS-PAGE檢測
[0042]採用分離膠濃度12.5%，濃縮膠濃度4.8%的SDS-PAGE對精子膜蛋白溶液樣品進行電泳分析。將2倍體積的5 X SDS-PAGE樣品溶解液加入到精子膜蛋白中，煮沸IOmin後，反覆吹打，再煮沸10min，3000r/min離心5min(4°C )，以備上樣檢測，上樣量為10 μ L，恆流電泳，開始電流20mA，待指示劑進入分離膠後電流改為40mA，電泳至溴酚藍線遷移至膠地板0.5-lcm處停止電泳。電泳結束後取下凝膠進行硝酸銀染色拍照，檢測所提取精子膜蛋白的質量，所抽提蛋白如圖1所示，所提取的精子膜蛋白分子量集中在20-85kDa，所得的精子膜蛋白條帶較清晰，無明顯拖帶。
[0043]8、精子膜蛋白質譜檢測
[0044]該方法採用納米級串聯質譜Nano-LC MS/MS技術檢測精子膜蛋白的組成和分類。其檢測過程主要包括以下幾個步驟:
[0045](I)單向SDS-PAGE，該過程同精子膜蛋白的SDS-PAGE檢測過程；[0046](2)蛋白條帶凝膠切膠回收，將清晰條帶用刀片成6段，切割下來的條帶再被小心切成顆粒，大小約為0.5mm3, _80°C保存備用；
[0047](3 )膠內胰蛋白酶消化過程。凝膠顆粒通過200 μ L30%NH4HC030.1M硝酸鈣銨(calcium ammonium nitrate, CAN)脫色並凍幹。具體步驟如下:
[0048]①每管加入90 μ L0.01M NH4HCO3 和 10 μ L0.01M 二硫蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT) (100mmol/L)後，給予 56°C 的溫度 30min 還原蛋白質。
[0049]②離心後去上清，再加入100 μ L100%丙烯腈(acrylonitrile, ACN), 5min後吸去ACN。
[0050]③每管加入70yL NH4HCO3 (100mmol/L), 30 μ L IAA (200mmol/L，現配並避光保存)，暗處放置20min。離心去上清後，再加入IOOyL NH4HCO3 (100mmol/L)，室溫條件下放置15min。離心去上清後，加入100 μ L100%ACN, 5min後吸去ACN，再凍幹。
[0051]④凍幹後，每管各加入5 μ L Trypsin (IOng/μ L)溶液,4°C條件下放置60min,膠塊能充分吸收Trypsin並彭脹。再加入NH4HCO3 (50mmol/L)，37°C條件下反應過夜，吸出酶解液後轉移至新EP管中。向原管加入100μ L60%ACN後，超聲破碎IOmin。用微量移液槍吸出溶液，和前次得到的酶解液合併在一起。抽提過程重複3次。
[0052](4)Nano-LC MS/MS檢測。準備p印mapl00C18柱，緩衝液A和B分別是0.1%甲酸溶液，0.1%甲酸的95%乙腈溶液。必須先通過0.22 μ m濾膜進行溶液過濾，在線脫氣。柱前分流，分流後流速被設置為200nL/min。自動進樣器進樣，進樣體積6 μ L，在室溫條件下運行。將樣品上樣後，轉換閥門使得上樣液可以單獨地衝洗預柱，而後再將預柱轉換至分析柱流路，進行洗脫。洗脫順序為:使用3%的B液來平衡色譜柱；樣品上樣後，8%至50%的B液連續洗脫30分鐘50%-60%的B液連續洗脫4分鐘；60%-95%的B液連續洗脫4分鐘；95%的B液等梯度連續洗脫6分鐘；洗脫後的組分經過電噴霧離子化的過程進入下一步的質譜檢測。由ES1-Q-TOF得到的胺基酸殘基離子的m/z值，可以人工識別肽序列。
[0053]本實施例的長江刀鱭魚精子進行精子膜蛋白質譜檢測後結果見表1。
[0054]表1精子膜蛋白質譜檢測分析結果
【權利要求】
1.一種提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，其特徵在於，按照以下步驟進行: (1)對所採集的魚類精巢或成熟精子樣本使用PBS與質量濃度為0.7% NaCl的漂洗緩衝液進行漂洗，除去碎屑物質，得到樣品液； (2)緩衝漂洗後，採用懸浮緩衝液對樣品進行懸浮處理0.5-lh ;加懸浮緩衝液再進行懸浮處理1-2 h;取懸浮上清液加精子膜蛋白分離液，混勻，置搖床上，冰浴緩慢振搖1.5h，然後4 V離心，上清為精子膜蛋白溶液，沉澱為脫膜精子； (3)將得到的精子膜蛋白溶液轉移至試管中，在25°C下孵育15-20分鐘，對混合物進行離心，獲得懸液的相分層，上層為水相層，下層為膜蛋白混合物層；留下層液體用於後續的膜蛋白純化；使用冰浴的TBS稀釋所得膜蛋白粗提物，重複精子膜蛋白的分離步驟，得到較好濃度和純度的精子膜蛋白，取少量溶液測其蛋白含量，其餘_20°C保存備用； (4)對所抽提的精子膜蛋白進行SDS-PAGE電泳，使用5XSDS-PAGE樣品溶解液對樣品進行處理； (5)對所抽提的精子膜蛋白進行納米級串聯質譜Nano-LCMS/MS技術檢測。
2.根據權利要求1所述的提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，其特徵在於，步驟(1)中使用PBS的濃度為0.01M0
3.根據權利要求1所述的提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，其特徵在於，步驟(2)中4 °C離心條件為 12000 r/min, IOmin0
4.根據權利要求1所述的提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，其特徵在於，步驟(3)中離心條件為5000g，20-25分鐘。
5.根據權利要求1所述的提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，其特徵在於，步驟(3)中重複精子膜蛋白的分離步驟為2-4次。
【文檔編號】G01N27/62GK103694309SQ201310681572
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】方弟安, 張敏瑩, 徐東坡, 劉凱, 周彥鋒, 段金榮 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心