一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因構建方法
2023-06-16 03:14:46 1
專利名稱：一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因構建方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及基因的構建方法，具體涉及一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因構建方法。
背景技術：
馬鈴薯卷葉病毒(Potato leaf roll virus, PLRV)是馬鈴薯生產中危害最重的病毒之一,在世界各馬鈴薯產區均有分布。PLRV靠蚜蟲(主要是桃蚜(Myzus persicae))以持久、循環增殖型方式傳播。馬鈴薯感染PLRV後，正常的生理功能受到破壞，葉片呈現捲曲、黃化，葉質厚而脆，枝條僵化，植株矮縮，塊莖網狀壞死，嚴重影響產量和品質。為了提高馬鈴薯對卷葉病毒的抗性，生產上採取莖尖脫毒組織培養措施生產病毒含量很低的種薯，但成本高、環節多、工作量大，需要專門的脫毒組培設施，脫毒後的種薯在栽培過程中會受耕作措施及蚜蟲的侵染而重新感染病毒，種植兩三年後產量又會嚴重下降；而馬鈴薯為同·源四倍體作物，無性繁殖，以常規育種改良品種，過程複雜需時較長，利用基因工程培育抗病毒馬鈴薯是從根本上解決病毒侵染的有效途徑。隨著本領域技術的發展，人們把PLRV的基因轉入馬鈴薯，發現能提高抗病性，如張鶴齡(1995)、南相日(2007)分別將PLRV的外殼蛋白基因CP轉入馬鈴薯，Kaniewski等(1994)把PLRV的複製酶基因NIb轉入馬鈴薯，董江麗等(1999)把PLRV的基因間隔序列IS轉化馬鈴薯，都獲得了抗病性比非轉基因馬鈴薯提高的植株，但抗病株率較低，抗病水平也不高，難以用於生產。由於這些轉基因在馬鈴薯體內轉錄的RNA是完整的，有可能與侵入馬鈴薯體內的其它病毒的RNA發生同源重組或異源包裝，引發生物風險。RNA幹擾是近年來發現的生物對病毒的重大抗性機制。將病毒的某一序列設計成反向重複結構，轉入植物體後，轉錄出的RNA會形成雙鏈結構，被植物體內的核酸酶切割成21-23nt的小幹擾RNA。如果供體病毒侵染植物體,這些小幹擾RNA就會介導病毒mRNA與之同源的部分降解，阻斷病毒的繁殖，賦予轉基因植株穩定遺傳的抗病毒性狀。由於轉基因表達的mRNA會降解，也就規避了與入侵病毒發生同源重組的潛在風險。RNA幹擾已用於作物的抗病毒育種，但是，也有一些研究發現RNA幹擾抗病效率不高甚至達不到抗病的效果。通過大量研究，人們發現RNA幹擾的效率與形成的雙鏈RNA的長度和同源性有密切關係。Wesley等(2001)發現，雙鏈RNA的長度為400-800 bp時，基因沉默的效率最為穩定。Helliwell等(2003)發現，50-1000 bp的基因片段均能誘發基因沉默，但基因片段越短，基因沉默的效率越低，並認為片段長度為300-600 bp時是合適的，可以獲得最高的基因沉默效率。較長的雙鏈RNA可能誘發更高的沉默效率，但是在進行基因體外操作時將給基因的轉化以及表達等產生不利的影響。RNA幹擾效率也高度依賴於序列的同源性。植物病毒容易發生變異，形成不同的小種，因此選擇病毒基因組中最為保守的區域進行基因沉默會提高抗病效率。也有研究表明，在同一載體中設計針對多個基因的靶位點的RNA幹擾的途徑對愛滋病毒具有很好的抑制效果。PLRV病毒是單鏈正義RNA病毒，屬黃化病毒組iUiteovirus)，基因組全長6. O kb,中間有一段197 bp的非編碼區，也稱之為基因間隔區IS。IS將基因組分為5』和3』兩個編碼區。IS序列在PLRV基因組中比較保守，可能為PLRV亞基因組啟動子，控制其下遊亞基因組的表達。IS的5』端連接複製酶基因Nib，3』端連接外殼蛋白基因CP。利用RNA幹擾沉默PLRV病毒多個基因尚未見報導。本發明利用RT-PCR克隆PLRV病毒的一段序列，該序列包含複製酶基因3』端、基因間隔區和外殼蛋白基因5』端。將克隆是這段序列構建成反向重複基因結構，以PLRV病毒的複製酶基因、基因間隔區序列和外殼蛋白基因為靶位點進行沉默，以期獲得多基因沉默的抗PLRV病毒的馬鈴薯，提高抗病效率。
發明內容
本發明是為了解決現有提高馬鈴薯抗卷葉病毒的方法中存在的問題，提供了一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因構建方法。本發明是採用如下技術方案實現的· 一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因構建方法，包括以下步驟
(1)從感染PLRV病毒的馬鈴薯植物體內提取總RNA，通過RT-PCR擴增和基因克隆工序得到PLRV病毒的一段序列NiblsCp，該序列包括複製酶基因NIB的3』端、基因間隔區IS和外殼蛋白基因CP的5』端，位於卷葉病毒基因組的第3422至3790個核苷酸之間；
(2)將序列NibISCp以正向和反向連接到一個內含子的兩側，構建成I個反向重複基因結構 RNAiNibIsCp ；
(3)反向重複基因結構RNAiNibIsCp兩端分別連接啟動子和終止子。進一步地，所述的RT-PCR擴增，是取感染PLRV病毒的馬鈴薯塊莖的RNA2PL，再加入 ΙΟμΜ 的反向引物 2PL，10mM dNTP 2μ , ddH20 12μ , 65°C水浴 5min，冰浴 2min，再加Λ 5XRT 緩衝液 5μ , RNasin^L(5U)，M-MLRV 酶 μ (100U)，混勻後，42°C 60min，再 85°CIOmin,終止反應。本發明所基於的理論基礎是把源自病毒的基因構建成反向重複序列導入植物體，其轉錄產物會通過分子內序列互補形成雙鏈RNA結構，這些雙鏈RNA會被植物體內的核酸酶切割成小幹擾RNA，如果供體病毒侵入植物體，這些小幹擾RNA會介導病毒mRNA中與其同源的部分降解，阻止了病毒的複製和擴散，從而使轉基因植物獲得抗病性。將本發明構建好的抗PLRV病毒的基因RNAiNibIsCp通過DNA重組技術連接到可在細菌細胞或植物細胞中自我複製的植物表達載體上，例如衍生於大腸桿菌的質粒載體pUC18、pUC19，以及經過不同的修飾而造成不同的多克隆位點的一系列通稱為pGEM的質粒載體(由Promega公司生產)和pBS_T載體(由天根公司生產),尤其是植物表達載體PCAMBIA3301、pBinl9、pROKII和pBI121系統等，在本發明的一系列優選實施方案中，選用pBS-T、pCAMBIA3301等，後者特別適於作為製備植物表達載體的工具質粒載體；然後將植物表達載體轉入並整合到馬鈴薯基因組中，而抗病基因RNAiNibIsCp在馬鈴薯中的表達可賦予該植物對PLRV病毒的抗性，同時馬鈴薯的後代及任何部分的組織均具有抗性。上述將攜帶外源基因的表達載體導入宿主植物或其細胞內的許多方法都是本領域技術人員熟知的。這些方法包括a、農桿菌介導法、b、物理法，如基因槍法、電擊融合法、顯微注射法、超聲波法等；c、化學法，如PEG介導的轉化法、脂質體介導轉化法等；d、種植系統轉化法，如花粉管通道法、子房注射法、浸泡法等；e、以花椰菜花葉病毒(CaMV)、雙生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒載體所介導的轉化法。與現有技術相比，本發明具有以下優點
(1)本發明所述的方法構建的多基因融合的反向重複序列的轉錄產物會形成一種序列自我互補的雙鏈RNA結構，該結構會激發植株體內的RNAi機制，把該雙鏈結構降解成小片段，因此轉基因的mRNA不存在或存在量很少，也不會翻譯成蛋白質，避免了常規抗病毒轉基因方式可能引起病毒與轉基因發生同源重組或異源包裝的潛在生物風險；
(2)克隆的序列NibISCp由複製酶基因NIB的3』端序列、基因間隔區IS和外殼蛋白基因CP的5』端序列組成，在植物體內能同時沉默PLRV病毒的這3個基因，提高對PLRV病毒的抗性。
圖I為馬鈴薯卷葉病毒基因片段的RT-PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳結果；·
圖2為本發明所述的抗性基因RNAiNibIsCp的構建過程示意圖。
具體實施例方式以下是本發明的一個具體實施例
步驟一馬鈴薯卷葉病毒多基因融合序列的獲得CCGACACGATCGTGAGCTCG
I、根據PLRV的基因組序列(Accession :NC_001747)，設計PCR引物
正向引物 I :5』-GCATCGATTCCGACACGATCGTGAGCTCGT-3』，其 5』端人工加有 ClaI 酶切位佔.
反向引物 I :5』-CGTGGTTACCTGAACTGTTAGCGCGCCT-3』，其 5』端人工加有 BstEII 酶切位佔.
正向引物 2 :5』-CTGGTACCGACACGATCGTGAGCTCGT-3』，其 5』端人工加有 KpnI 酶切位點； 反向引物 2 :5』 -TCAGATCTGAACTCTGTTAGCGCGCCT-3』，其 5』 端人工加有 BglII 酶切位點。引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。2、cDNA第一鏈合成提取感染PLRV病毒的馬鈴薯塊莖的RNA，取2μ ，再加入ΙΟμΜ的反向引物 I 2PL，10mM dNTP 2μ , ddH20 12μ , 65°C水浴 5min，冰浴 2min，再加入 5XRT緩衝液 5μ , RNasin^L (5U) ,M-MLRV 酶 μ (100U)，混勻後，42°C 60min，再 85°C IOmin,終止反應。3、PCR擴增以步驟2反轉錄合成的第一鏈cDNA為模板，在正向引物I和反向引物I的引導下，PCR擴增PLRV的融合基因片段。PCR擴增得到的多基因融合序列兩側分別含有人工加上的ClaI酶切位點和BstEII酶切位點，該序列命名為BsCl。以步驟2反轉錄合成的第一鏈cDNA為模板，在正向引物2和反向引物2的引導下，PCR擴增PLRV的一段序列，該序列是一段多基因融合序列，由複製酶基因、基因間隔區和外殼蛋白基因組成。PCR擴增得到的多基因融合序列兩側分別含有人工加上的KpnI酶切位點和BglII酶切位點，該序列命名為BgKp。PCR反應程序是94°C變性 5min ;94°C變性 45s，58°C復性 lmin，72°C延伸 lmin，30個循環；然後70°C延伸lOmin。反應結束後，將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用柱式回收試劑盒(博邁德)回收約370bp的擴增產物。圖I為馬鈴薯卷葉病毒基因片段的RT-PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳結果；圖中M為DNA分子量標準，I為利用正向引物I與反向引物I通過RT-PCR擴增的PLRV基因；2為利用正向引物2和反向引物2通過RT-PCR擴增的PLRV基因。4、基因克隆取步驟3回收的PCR產物與pBS-T克隆載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，然後提取質粒進行酶切鑑定，將陽性克隆送三博遠志生物技術有限責任公司進行核苷酸序列測定。測序結果表明，融合基因片段已插入PBS-T載體，得到重組克隆載體。插入了 BsCl序列的重組克隆載體命名為pBS-BsCl，插入了 BgKp序列的重組克隆載體命名為pBS-BgKp
表I是克隆的PLRV的一段序列所在的基因組信息
權利要求
1.一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因的構建方法，其特徵是包括以下步驟 (1)從感染馬鈴薯卷葉病毒的植物體內經提取總RNA、通過RT-PCR擴增和基因克隆工序得到卷葉病毒的一段保守序列，所述保守序列包括複製酶基因、基因間隔區和外殼蛋白基因，位於卷葉病毒基因組的第3422至3790個核苷酸之間； (2)將步驟(I)獲得的卷葉病毒的保守序列以正向和反向分別連接到一個內含子的兩偵牝構建成一個反向重複序列，即為提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因RNAiNibIsCp ； (3)將基因RNAiNibIsCp兩端分別連接啟動子和終止子。
2.根據權利要求I所述的一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因的構建方法，其特徵是所述的保守序列包括複製酶基因NIB的3』端、基因間隔區IS和外殼蛋白基因CP的5』端。
3.根據權利要求I或2所述的的一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因的構建方法，其特徵是所述的RT-PCR擴增，是取感染PLRV病毒的馬鈴薯塊莖的RNA2PL，再加入ΙΟμΜ的 反向引物 2PL，10mM dNTP 2μ , ddH20 12μ , 65°C水浴 5min，冰浴 2min，再加入 5XRT 緩衝液 5μ ，Rnasin μ (5U)，M-MLRV 酶 μ (100U)，混勻後，42°C 60min，再 85°C lOmin，終止反應。
全文摘要
本發明公開了一種提高馬鈴薯對卷葉病毒抗性的基因構建方法，屬於生物技術領域。包括以下步驟從感染馬鈴薯卷葉病毒的植物體內經提取總RNA、通過RT-PCR擴增和基因克隆工序得到卷葉病毒的一段保守序列,所述保守序列包括複製酶基因、基因間隔區和外殼蛋白基因，位於卷葉病毒基因組的第3422至3790個核苷酸之間；將保守序列以正向和反向分別連接到一個內含子的兩側，構建成一個反向重複序列，即基因RNAiNibIsCp，然後在基因兩端分別連接啟動子和終止子。本發明避免了常規抗病毒轉基因方式可能引起病毒與轉基因發生同源重組或異源包裝的潛在生物風險；克隆的序列NibISCp在植物體內能同時沉默PLRV病毒的這3個基因，提高對PLRV病毒的抗性。
文檔編號C12N15/113GK102787126SQ20121025861
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月25日 優先權日2012年7月25日
發明者張忠梁, 張維鋒, 施俊鳳, 白雲風, 郭志華, 閆建俊 申請人:山西省農業科學院作物科學研究所